Dimasukkan 10 gram daun tumbuhan kedondong laut (Nothopanax fruticosum (L.)
2. Skrining Fitokimia
Dimasukkan 10 gram daun tumbuhan kedondong laut (Nothopanax fruticosum (L.)
Miq) yang telah dikeringkan dan dipotong-potong kecil ke dalam erlenmeyer, lalu
ditambahkan metanol sampai terendam seluruhnya. Dipanaskan lalu disaring dan dimasukkan ekstrak daun tumbuhan kedondong laut ke dalam tabung reaksi. Ditambahkan masing-masing dengan pereaksi
a. Tabung I : ditambah dengan FeCl3 menghasilkan larutan hitam
b. Tabung II : ditambah dengan Mg-HCl menghasilkan larutan merah muda c. Tabung III : ditambah dengan NaOH 10% menghasilkan larutan hijau
d. Tabung IV : ditambah dengan H2SO4 (p) menghasilkan larutan merah
3.3.3. Prosedur Untuk Memperoleh Senyawa Kimia dari Ekstrak Daun Tumbuhan Kedondong Laut
Daun tumbuhan kedondong laut yang telah dikeringkan dan dipotong-potong kecil ditimbang sebanyak 900 gram, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak 8 liter selama ± 48 jam, kemudian disaring dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga terbentuk ekstrak pekat metanol. Ekstrak pekat metanol tersebut dipartisi berulang-ulang dengan menggunakan n-heksana sebanyak 36 kali. Lalu diambil lapisan metanol dan dipekatkan. Lapisan metanol yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan rotarievaporator sampai seluruh metanol menguap, dan terbentuk padatan yang bebas metanol. Padatan tersebut kemudian ditambah dengan etil asetat dan diaduk. Etil asetat kemudian disaring dan diambil filtratnya dan dipekatkan dengan rotarievaporator sampai terbentuk ekstrak pekat etil asetat sebanyak 30,06 gram.
3.3.4. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis dengan kromatografi lapis tipis dimaksudkan untuk mencari perbandingan pelarut yang sesuai di dalam pemisahan senyawa dengan meningkatkan kepolarannya dalam kromatografi kolom. Pelarut yang digunakan adalah campuran pelarut kloroform : metanol (9:1 ; 8:2 ; 7:3 ; 6:4 ; 5:5 ; 4:6 ; 3:7 ; 2:8 ; 1:9) v/v, sehingga diperoleh perbandingan pelarut kloroform : metanol yang sesuai untuk kromatografi kolom.
Pelarut yang sesuai didasarkan kepada jumlah bercak atau noda yang terpisah dengan baik dalam kromatografi lapis tipis.
Prosedur:
Ke dalam bejana kromatografi lapis tipis dimasukkan larutan fase gerak yaitu campuran pelarut kloroform : metanol dengan campuran pelarut (9:1 ; 8:2 ; 7:3 ; 6:4 ; 5:5 ; 4:6 ; 3:7 ; 2:8 ; 1:9) v/v. Kemudian ekstrak etil asetat ditotolkan pada plat KLT yang sudah diaktifkan. Lalu plat dimasukkan ke dalam bejana yang berisi pelarut yang
dijenuhkan, kemudian ditutup. Setelah dielusi, dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan. Noda yang terbentuk diamati dengan sinar ultraviolet dan difiksasi dengan FeCl3 1%. Kemudian dihitung dan dicatat harga Rf. Yang memberikan pemisahan bercak noda yang baik adalah perbandingan pelarut kloroform : metanol (8:2) v/v yang memberikan empat noda dengan harga Rf yaitu 0,245 ; 0,415 ; 0,622 ; dan 0,830.
3.3.5. Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Dilakukan isolasi senyawa flavonoida terhadap total flavonoida yang telah diperoleh dengan menggunakan kromatografi kolom. Dimana sebagai fase diam yaitu silika gel 60 GF (0,063-0,200 mm) E.Merck.Art.7734 dan fase gerak yaitu pelarut kloroform 100% dengan campuran pelarut kloroform : metanol (90 : 10 ; 80 : 20 ; 70 : 30 ; 60 : 40 ; 50 : 50 ; 40 : 60 ; 30 : 70 ; 20 : 80 ; 10 : 90) v/v.
Prosedur :
Dibersihkan peralatan kromatografi kolom, dibilas dengan metanol, dikeringkan, dan dirangkai. Kemudian silika gel 60 GF (0,063-0,200 mm) E.Merck.Art.7734 sebanyak 300 gram dibuburkan dengan pelarut metanol, diaduk sampai homogen dan dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Lalu dielusi dengan metanol 100% hingga bubur silika gel memadat dan homogen. Dimasukkan sampel flavonoida sebanyak 10 gram yang telah dibuburkan dengan silika gel ke dalam kolom kromatografi yang telah diaktifkan. Sampel dibiarkan turun hingga memadat. Kemudian dielusi dengan pelarut kloroform 100% dan diatur aliran fraksi yang keluar dari kolom kromatografi bergerak secara kontinu dan ditampung tiap fraksi dalam botol vial masing-masing sebanyak 13 ml.
Perlakuan yang sama dilakukan terhadap campuran pelarut antara kloroform : metanol (90 : 10 ; 80 : 20 ; 70 : 30 ; 60 : 40 ; 50 : 50 ; 40 : 60 ; 30 : 70 ; 20 : 80 ; 10 : 90) v/v. Tiap-tiap fraksi yang telah diperoleh dari hasil elusi pelarut kloroform 100% dan variasi pelarut diKLT, lalu digabung fraksi dengan harga Rf yang sama dari perbandingan pelarut kloroform : metanol (80 : 20) v/v, kemudian diuapkan pelarutnya hingga diperoleh kristal
3.3.6. Analisis Kristal Hasil Isolasi
3.3.6.1. Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis
Uji kemurnian kristal dilakukan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis, dimana fase diam yang digunakan adalah Kieselgel 60 F254 (0,2 mm) E.Merck.Art 554 dan fase gerak kloroform : metanol 80 : 20 v/v.
Prosedur:
Kristal yang diperoleh dilarutkan dengan metanol, lalu ditotolkan pada plat KLT.
1. Dimasukkan larutan fase gerak kloroform : metanol (80 : 20 v/v) dalam bejana kromatografi lapis tipis yang telah dijenuhkan. Plat yang telah ditotolkan sampel dimasukkan ke dalam bejana kromatografi tersebut dan dibiarkan hingga pelarut naik sampai batas atas yang telah ditentukan dalam plat tipis.
2. Dikeluarkan plat dari bejana kromatografi, lalu dikeringkan dan dilihat bercak noda di bawah lampu UV, kemudian difiksasi dengan FeCl3 yang memberikan bercak noda berwarna hitam yang menunjukkan bahwa senyawa flavonoida positif.
3. Dikeringkan hingga terbentuk kristal. Dari kristal yang terbentuk tersebut diperoleh kristal berbentuk seperti berwarna kuning dan hasil bercak noda dari KLT yang telah dilakukan diperoleh lebih dari satu bercak noda.
4. Dimurnikan dengan etil asetat sebanyak 5 kali, kemudian diuapkan hingga terbentuk kristal.
Dilakukan uji kemurnian terhadap kristal yang sudah dimurnikan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis, dengan cara :
- Dimasukkan larutan fase gerak kloroform : metanol (80 : 20 v/v) dalam bejana kromatografi lapis tipis yang telah dijenuhkan. Plat yang telah ditotolkan sampel dimasukkan ke dalam bejana kromatografi tersebut dan dibiarkan hingga pelarut naik sampai batas atas yang telah ditentukan dalam plat tipis.
- Dikeluarkan plat dari bejana kromatografi, lalu dikeringkan dan dilihat bercak noda di bawah lampu UV, kemudian difiksasi dengan FeCl3 yang memberikan
bercak noda tunggal berwarna hitam yang menunjukkan bahwa senyawa flavonoida positif.
3.3.6.2. Uji Reaksi Warna terhadap Kristal Hasil Isolasi dengan Pereaksi Flavonoida
Dilarutkan kristal hasil isolasi secukupnya ke dalam botol vial, lalu diteteskan menjadi 4 larutan ke dalam plat tetes.
1. Larutan pertama ditetesi dengan FeCl3 menghasilkan larutan berwarna hitam
2. Larutan kedua ditetesi dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda 3. Larutan ketiga ditetesi dengan NaOH 10% menghasilkan larutan berwarna hijau 4. Larutan ketiga ditetesi dengan H2SO4 menghasilkan larutan berwarna merah
3.3.6.3. Penentuan Titik Lebur
Kristal hasil isolasi yang telah murni dimasukkan ke dalam melting point apparatus, lalu diamati pada suhu berapa kristal melebur.
3.3.7 Analisis Spektroskopi Kristal Hasil Isolasi
3.3.7.1. Uji Kristal Hasil Isolasi dengan Spektrofotometer Ultra Violet-Visible (UV)
Analisis kristal hasil isolasi dengan alat spektrofotometer Ultra Violet Visible (UV) dilakukan di Pusat Penelitian Kimia LIPI Serpong – Tangerang. (Lampiran E)
3.3.7.2. Uji Kristal Hasil Isolasi dengan Spektrofotometer Infra Merah
Analisis kristal hasil isolasi dengan alat spektrofotometer FT-IR dilakukan di Pusat Penelitian Kimia LIPI Serpong – Tangerang. (Lampiran F)
3.3.7.3. Uji Kristal Hasil Isolasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton 1H-NMR
Analisis Kristal hasil isolasi dengan alat Spektrometer 1H-NMR dilakukan di Pusat Penelitian Kimia LIPI Serpong – Tangerang dengan menggunakan aseton sebagai pelarut. (Lampiran G)
3.4. Bagan Tes Uji Pendahuluan (Skrining Fitokimia) terhadap Daun Tumbuhan Kedondong Laut
Diekstraksi maserasi dengan pelarut metanol
Disaring
Diuapkan dengan rotarievaporator
Dibagi dalam 4 tabung reaksi
Ditambahkan Ditambahkan Ditambahkan Ditambahkan FeCl3 1% NaOH 10% Mg-HCl H2SO4 (p)
10 gram daun tumbuhan kedondong laut (Nothopanax fruticosum (L.)Miq kering halus
Ekstrak pekat metanol
Tabung Tabung Tabung III Tabung IV
Larutan hitam Tidak terbentuk larutan biru violet
Larutan merah muda
Tidak terbentuk larutan oranye kekuningan Positif Flavonoida Negatif Flavonoida Positif Flavonoida Negatif Flavonoida
3.4.1. Bagan Penelitian
diskrining fitokimia
dimaserasi dengan metanol selama ± 48 jam diulangi sampai 4 kali
diskrining fitokimia
dipekatkan dengan rotarievaporator
diekstraksi partisi dengan n-heksana
zzzzzzzzzzzzzzzz
diskrining fitokimia dipekatkatkan dengan rotarievaporator
dilarutkan dengan etil asetat disaring
diskrining fitokimia
dipekatkan dengan rotarievaporator diuji KLT dibuburkan dengan silica gel 60 GF (0,063-0,200 mm) dengan
fase gerak kloroform : metanol 80:20 v/v ditampung tiap fraksi sebanyak 13 ml
diuji pereaksi diuji pereaksi diuji pereaksi diuji pereaksi diKLT (Rf) diKLT (Rf) diKLT (Rf) diKLT (Rf) diuapkan diuapkan diuapkan
dikristalisasi
dianalisis dengan KLT
dikarakterisasi
Ekstak metanol Residu
Ekstrak pekat metanol
Lapisan n-heksana Lapisan metanol
Fraksi Etil Asetat
900 gram daun tumbuhan kedondong laut (Nothopanax fruticosum (L.)Miq kering halus
Residu Ekstrak Pekat Metanol Hasil Negatif
Fraksi 1-4 Fraksi 5-35 Fraksi 40-60 Fraksi 80-90
Residu Coklat
Kristal Jarum Kuning Residu Coklat
Kristal Jarum Kuning
1H-NMR UV
FT-IR Titik Lebur
BAB 4