Abstrak
Kopyor merupakan sifat spesifik pada tanaman kelapa yang diduga akibat mutasi alami. Informasi keterpautan sifat kopyor dengan marka molekuler sangat penting untuk seleksi dini bahan tanaman dan program pemuliaan kelapa kopyor ke depan. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi pola ko-segregasi antar lokus dari sejumlah marka molekuler yang telah dikembangkan untuk genom kelapa dan menganalisis keterpautan (linkage) antara sifat kopyor dengan marka
molekuler yang dievaluasi. Populasi segregasi yang digunakan adalah progeni selfing dari tanaman F1 heterosigot Kk hasil persilangan antara kelapa Genjah Kuning Nias (homosigot normal KK) x kelapa Dalam kopyor hasil kultur embryo (homosigot kopyor kk). Sebanyak 113 bibit dan embrio F2 buah normal dan 13 bibit hasil kultur in vitro dan embryo buah kopyor telah diisolasi DNAnya. Seleksi 52 primer SSR dan 16 pasang primer SNP menghasilkan 19 primer SSR dan 2 primer SNP yang memiliki alel heterosigot pada tetua F1 selanjutnya digunakan untuk mengamplifikasi semua sampel DNA yang diuji. Hasil PCR menggunakan primer SSR dipisahkan pada gel akrilamid, sedangkan dengan primer SNP pemisahannya menggunakan gel agarose. Pembuatan peta pautan berdasarkan data genotipe hasil scoring menggunakan program MapMaker versi 3.0. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ko-segregasi marka SSR dan SNP yang diuji pada 121 progeni populasi F2 kelapa kopyor menghasilkan 13 lokus yang mengikuti pola segregasi Mendel, sedangkan tujuh lokus lainnya menyimpang. Sebanyak enam lokus yang terpaut dan tersebar pada dua group pautan kelapa kopyor yang diuji. Dua lokus SSR dan dua marka SNP terletak pada satu group pautan dengan sifat kopyor. Marka SNP WRKY_21 yang sangat dekat posisinya dengan sifat kopyor yaitu 9 cM diikuti marka CnCir_J2 dengan jarak 12.2 cM dan marka SNP CnSUS#3 dengan jarak 14.4 cM. Penambahan jumlah marka dan jumlah sampel tanaman yang diuji perlu dilakukan untuk mendapatkan kerapatan marka yang tinggi pada kromosom dan marka yang lebih dekat serta sangat terpaut dengan sifat kopyor pada kelapa. Marka tersebut dapat dijadikan sebagai kandidat marka untuk seleksi dini bibit kelapa kopyor.
Kata kunci: Sifat kopyor, populasi F2, ko-segregasi, marka SSR dan SNP, peta genetik
110 PRELIMINARY LINKAGE MAP AMONG SSR AND SNP MARKERS WITH LOCUS CONTROLLING KOPYOR CHARACTER IN COCONUT
Abstract
Kopyor the specific trait on coconut palm which allegedly caused a natural mutation. Linkage information of kopyor trait with molecular markers is essential for early selection of plant material and kopyor coconut breeding program forward. This study aimed to evaluate the pattern of co-segregation between the locus of a number of molecular markers which have been developed for palm genome and analyzing the linkage between kopyor trait with molecular markers evaluated. Segregation F2 population used is the progeny selfing of F1 plants heterosigot Kk from crosses between Nias Yellow Dwarf (normal homozygote KK) x Tall kopyor coconut from embryo culture results (homozygous kopyor kk). A total of 108 F2 seeds and fruit normal embryo and 13 seedlings in vitro culture and kopyor fruit embryo have been isolated DNA. Selection of 53 SSR locus and 16 SNP primer pairs gained 19 SSR locus and two primer SNP that have heterosigot allele of F1 palm, then used to amplify all DNA samples tested. PCR product separated on acrylamide gel, while the SNP primer separation using agarose gel. Making the linkage maps based on genotype data using the scoring results MapMaker program version 3.0. The result showed that the co-segregation of SSR and SNP markers were tested on a population of 121 F2 progeny coconut kopyor produce 13 loci which follows Mendelian segregation patterns, while seven other loci diverge. A total of six loci were adrift and spread on two linkage groups or chromosomes of kopyor coconut tested. Two SSR loci and two SNP markers located on linkage group with kopyor trait. SNP markers WRKY_21 a very close position to the kopyor trait is 9cM followed CnCir_J2 with distance of 12.2 cM and SNP marker CnSUS # 3 with a distance of 14.4 cM. Addition number of markers and the number of samples tested plants needs to be done to obtain a high density on chromosome markers and markers closer with kopyor trait on coconut. The markers can be used as candidate markers for early selection kopyor coconut seedlings.
Keywords: Kopyor trait, F2 population, co-segregation, SSR and SNP marker, genetik map
111 Pendahuluan
Kelapa (Cocos nucifera. L.) merupakan salah satu spesies dari famili Palmaceae yang memiliki jumlah kromosom 2n=2x=32. Tanaman palma ini dikategorikan dalam dua tipe berdasarkan karakteristik ukuran tanaman, umur mulai berbuah dan pola pembungaannya yaitu tipe kelapa Dalam, dan tipe kelapa Genjah. Hasil persilangan secara alami atau buatan dari kedua tipe tersebut diberi nama kelapa hibrida (Santos 1996).
Secara morfologi kelapa tipe Dalam dan tipe Genjah memiliki keragaman pada warna buah, ukuran buah dan bentuk buah. Selain itu di alam ditemukan karakter spesifik pada fenotipe buah, berupa ketidaknormalan endosperma yang diduga terjadi akibat mutasi alamiah seperti pada kelapa Makapuno yang terdapat di Philipina dan kelapa kopyor yang diduga merupakan tanaman kelapa mutan asli Indonesia (Maskromo et al. 2007). Seperti halnya pada tanaman kelapa Makapuno yang merupakan tanaman kelapa mutan, dugaan sementara gen pengendali sifat mutan dengan endosperma abnormal pada tanaman kelapa kopyor diduga dikendalikan oleh gen mutan resesif yang pada kelapa kopyor dilambangkan “k”
sedangkan endosperma normal dikendalikan oleh gen dominan “K” (Sukendah et al. 2008)
Tanaman kelapa kopyor di lapang saat ini umumnya berupa tanaman heterosigot (Kk) yang dikembangkan oleh petani dari buah normal pohon kelapa kopyor heterosigot. Buah yang dihasilkan pada tanaman kopyor heterosigot Kk tersebut dapat berasal dari hasil penyerbukan sendiri (selfing) atau persilangan
dengan sesama pohon kopyor heterosigot (Kk) atau dengan pohon normal dengan genotipe homosigot (KK). Jika diasumsikan bahwa sifat kopyor dikendalikan oleh satu gen sederhana, maka sesuai hukum segregasi Mendel pada selfing atau persilangan antar tanaman kopyor heterosigot Kk akan terjadi segregasi, sehingga berpeluang menghasilkan dua tipe buah yaitu buah normal dengan fenotipe endosperma normal dan buah kopyor dengan fenotipe endosperma yang abnormal (3:1). Secara genotipik, buah kopyor memiliki embryo dengan genotipe homosigot (kk) sedangkan pada buah normal terdapat dua kemungkinan yaitu buah dengan genotipe Kk dan buah yang bergenotipe KK dengan perbandingan 1:2:1 untuk genotipe kk:Kk:KK (Maskromo et al. 2015).
Hasil buah kopyor dari pohon kopyor heterosigot di lapang umumnya dipasarkan sebagai buah untuk konsumsi segar, sedangkan buah normal dijadikan bibit untuk perbanyakan bahan tanaman. Berdasarkan pola segregasi di atas, maka bibit kelapa kopyor alami yang dihasilkan oleh petani di lapang merupakan campuran antara bibit heterosigot Kk dengan bibit homosigot KK. Hingga saat ini belum ada metode atau teknologi yang akurat untuk membedakan bibit kopyor heterosigot Kk dengan bibit kelapa normal homosigot KK. Adanya ketidakpastian apakah bibit yang dijual akan menghasilkan buah kelapa kopyor (bibit kopyor heterosigot Kk) atau hanya menghasilkan buah kelapa normal (bibit normal homosigot KK) tersebut yang menyebabkan harga jual bibit kopyor seperti itu menjadi rendah (Sudarsono et al. 2013).
Masalah ketidakpastian menghasilkan buah kopyor pada bibit alami menyebabkan rendahnya kualitas bibit yang dihasilkan petani penangkar . Melalui persilangan dengan serbuk sari tanaman kelapa kopyor hasil kultur embryo yang
112 bergenotipe kk dapat dihasilkan benih atau bibit true-to-type kelapa kopyor Kk (Sudarsono et al. 2015). Namun demikian masih terbatasnya tanaman hasil kultur embrio saat ini, menjadi kendala penerapan metode tersebut secara luas di tingkat petani. Salah satu alternatif yang dapat dilakukan adalah mengembangkan metode seleksi pada tingkat bibit alami dengan bantuan marka molekuler. Penggunaan metode ini memungkinkan dilakukan saat ini, seiring dengan berkembangnya teknologi berbasis analisis molekuler pada tanaman.
Berbagai penelitian yang bertujuan mendapatkan metode seleksi sifat dengan bantuan marka molekuler dalam membantu program pemuliaan tanaman kelapa telah dilakukan oleh beberapa peneliti sebelumnya. Memanfaatkan metode analisis marka molekuler yang telah dikembangkan oleh Rohde et al. (1995) Perera et al. (1998); Rivera et al. (1999); Rohde et al. (1999); Perera et al.
(2000); Teulat et al. (2000); Manimekalay and Nagarajan (2004) dan Devakumar et al. (2010), telah dikembangkan pembuatan peta pautan dan analisis QTL menggunakan tetua Malayan Yellow Dwarf (MYD) x Laguna Tall (LAGT) yang menghasilkan 16 group pautan (Herran at al. 2000). Selanjutnya juga telah
dilakukan konstruksi peta pautan pada kelapa Dalam Renell dan analisis QTL untuk karakter komponen hasil (Lebrun et al. 2001), konstruksi dan pemanfaatan marka dan pembuatan peta genetik pada kelapa dan sawit (Rohde et al. 2002);
metode cepat pembuatan peta genetik pada kelapa dan kelapa sawit (Sniady et al.
2003); analisis QTL karakter komponen buah pada progeni individu kelapa Dalam Renell (Baudouin et al. 2006).
Perkembangan dalam teknologi marka molekuler dan pemanfaatannya pada pembuatan peta genetik untuk mendapatkan marka terpaut sifat tertentu seperti yang telah diuraikan di atas, menjadi dasar pelaksanaan penelitian untuk mendapatkan marka spesifik yang nantinya dapat digunakan dalam seleksi dini bibit kelapa kopyor. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi pola ko- segregasi antar lokus dari sejumlah marka molekuler yang telah dikembangkan untuk genom kelapa dan menganalisis keterpautan (linkage) antara sifat kopyor
dengan marka molekuler yang dievaluasi.
Bahan dan Metode
Penelitian dilakukan di Balai Penelitian Tanaman Palma (BalitPalma) Manado dan di Laboratorium Biologi Molekuler, Departemen Agronomi, Fakultas Pertanian, IPB, Bogor. Pelaksanaan penelitian dimulai bulan Juni 2011 sampai dengan Juni 2015.
Bahan Tanaman dan Sampel Penelitian
Bahan tanaman yang digunakan adalah bibit dan embrio progeni hasil
selfing tanaman F1 kelapa kopyor heterosigot hasil persilangan antara kelapa
Genjah Kuning Nias (homosigot normal KK) x kelapa Dalam kopyor hasil kultur embryo (homosigot kopyor kk). Persilangan untuk menghasilkan tanaman F1 kelapa kopyor heterosigot dilakukan pada tahun 2004 di Kebun Percobaan Pakuwon, Loka Penelitian Tanaman Sela Kelapa yang saat ini berubah nama menjadi Balai Penelitian Tanaman Industri dan Penyegar (Balittri). Tanaman F1 kelapa kopyor heterosigot Kk ditanam di Kebun Percobaan Kaiwatu, BalitPalma
113 Manado pada tahun 2005. Selfing tanaman F1 untuk mendapatkan progeni F2 mulai dilakukan pada tahun 2012 sampai tahun 2014. Buah normal hasil selfing
dikecambahkan kemudian dibibitkan di Kebun Percobaan Kaiwatu, BalitPalma, Manado, sedangkan buah kopyor diambil embrionya kemudian dikulturkan di Laboratorium Bioteknologi, BalitPalma, Manado. Sebanyak 108 bibit dan buah normal serta 13 planlet hasil kultur dan buah kopyor diambil sampel daun dan embrio untuk diisolasi DNA.
Isolasi DNA
DNA total tanaman diisolasi dari sampel daun bibit kelapa kopyor dan planlet hasil kultur embryo kelapa kopyor serta embrio buah normal dan buah kopyor. DNA yang didapat selanjutnya dikeringkan dan disuspensikan ke dalam
500 μl larutan TE (1×). Kontaminan RNA dihilangkan dengan menambahkan
RNAseke dalam suspensi DNA sehingga diperoleh konsentrasi akhir 1000 μg/ml.
Campuran diinkubasi pada suhu 370C selama 1 jam dan suspensi DNA diekstraksi berturut-turut dengan 1 volume senyawa fenol dan diikuti dengan 1 volume kloroform : isoamil alkohol = 24 : 1. Akhirnya, DNA diendapkan dan disuspensi ke dalam larutan TE.
Kuantitas dan kualitas atau kemurnian DNA diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 dan 280 nm. Konsentrasi DNA dihitung berdasarkan rumus pengenceran × nilai absorbansi 260 nm × 50 μg/ml.
Analisis SSR
Seleksi dilakukan tehadap 65 lokus SSR yang terdiri atas 49 CnCir marker (Baudoin 2002), 3 CNZ marker (Rivera 1999) dan 13 primer WCYZ (Xiao et al.
2013) untuk mendapatklan lokus yang heterosigot pada sampel DNA tanaman F1. Hanya primer yang menghasilkan alel heterosigot yang digunakan untuk mengamplifikasi sampel DNA progeni F2 kelapa kopyor yang diuji. Amplifikasi PCR (Polymerase Chain Reaction) untuk menghasilkan marka SSR dilakukan dengan menggunakan mesin Takara PCR Thermal Cycler model Dice 96 wells.
Campuran reaksi PCR sebanyak 12,5 μl, terdiri atas 10 ng (2μl) DNA kelapa sebagai cetakan, 0,2 μM (0.625μl) primer foward dan primer reverse, 6,25 ul PCR
Mix (Kappa Biosystem) dan sisanya hingga 12,5 μl ditambahkan ultra-pure water
steril. Amplifikasi PCR diawali dengan tahap pre amplifikasi pada 95oC selama 3 menit, selanjutnya diikuti dengan amplifikasi sebanyak 35 siklus dengan tahapan denaturasi (95oC selama 15 detik), penempelan primer (52-55oC selama 15 detik), pemanjangan primer (72oC selama 5 detik), dan pemanjangan akhir (72oC 10 selama menit).
Untuk mengevaluasi keragaman alel masing-masing marka SSR, sebanyak
2,0 μl hasil amplifikasi PCR dianalisis menggunakan Polyacrylamide Gel Electro- phoresis (PAGE) 6 % secara vertikal, pada arus konstan 40mA selama 2-3 jam,
mengunakan buffer Sodium Boric Acid (SB) 1x (buffer (Brody and Kern 2004). Pewarnaan DNA dilakukan dengan perak nitrat mengikuti metode yang telah dimodifikasi Creste et al. (2001). Setelah pewarnaan, plat kaca dikeringanginkan
kemudian difoto sebagai dokumentasi. Setelah itu, dilakukan pengamatan alel yang muncul pada plat kaca. Genotipe yang memiliki satu alel pada posisi bagian atas diskor sebagai A (homosigot AA), genotipe yang memiliki satu alel pada
114 posisi bagian bawah diberi skor B (homosigot BB), sedangkan yang memiliki dua alel diberi skor H (heterosigot AB).
Analisis SNP
Seleksi dilakukan terhadap primer SNP marker WRKY sebanyak delapan pasang hasil sequencing dan disain dari sequnce WRKY yang diperoleh dari NCBI dan enam primer CnSUS, dua primer ABI3 serta tiga primer CocoSACPD yang didisain dari sequence terkait gen pembentuk endosperm kelapa kopyor hasil penelitian Sukendah (2009) (Sudarsono et al. 2013). Amplifikasi PCR (Polymerase Chain Reaction) untuk menghasilkan marka SNP dilakukan dengan mesin Takara PCR Thermal Cycler model Dice 96 wells menggunakan masing-
masing pasangan primer SNP. Hanya primer yang menghasilkan alel heterosigot pada sampel F1 kelapa kopyor yang digunakan untuk mengamplifikasi sampel DNA progeni F2 kelapa kopyor yang diuji. Produk PCR hasil amplifikasi dipisahkan menggunakan alat elektroforesis horisontal melalui media agarose 1%.
SNP dideteksi menggunakan primer spesifik alel pada reaksi PCR. Primer spesifik alel memiliki kemampuan padu-padan (mismatches) yang spesifik pada
ujung 3‟ sehingga kemampuan primer untuk mengamplifikasi satu alel terhadap yang lainnya menjadikan situs tersebut dapat dinilai sebagai polimorfisme pada subtitusi satu basa. Pada gambar 41A, primer P1 yaitu primer reference (F1) dan primer reverse (R1) akan menempel secara sempurna dengan alel spesifik (a1), tetapi tidak menempel pada alel non-spesifik (a2) pada ujung 3‟dari sekuen suatu gen. Primer F1R1 mengamplifikasi satu basa (a1) lebih efisien dibandingkan satu basa yang lain (a2) pada satu titik SNP. Hal ini terjadi karena proses penempelan primer pada alel non-spesifik di ujung 3‟ dari sekuen DNA target adalah perpanjangan dari DNA polimerase dengan efisiensi yang lebih rendah apabila dibandingkan dengan proses penempelan alel spesifik (Drenkard et al. 2000). Proses yang sama juga berlaku untuk primer P2. Primer P2 yaitu primer alternate
(F2) dan reverse (R2) membentuk padu-padan penempelan dengan a1 dan a2 dari sekuen DNA, dan sesuai untuk mengamplifikasi a2.
Fragmen DNA yang dihasilkan oleh analisis SNAP selanjutnya dinilai berdasarkan ada atau tidak adanya pita pada dua reaksi PCR pada setiap pasang primer. Marka SNAP bersifat heterosigot, jika kedua primer (P1 dan P2) mengamplifikasi fragmen DNA. Bersifat homosigot jika hanya salah satu primer yang mengamplifikasi fragmen DNA. Jika kedua primer gagal mengamplifikasi fragmen DNA, maka marka tersebut tidak bersifat bi-alel (Gambar 41B).
Analisis Data
Hasil analisis DNA progeni 2 kelapa kopyor menggunakan marka SSR dan SNP berupa pola pita DNA pada PAGE dan gel agarosa diskoring dalam format data genotipe. Data yang diperoleh disusun dalam format Excel. Pembuatan peta pautan data genotipe hasil skoring menggunakan parangkat lunak komputer MAPMAKER/EXP 3.0 (Lincoln and Landers, 1993). Peta genetik berupa linkage group yang dihasilkan dari analais menggunakan MAPMAKER tersebut, selanjutnya diinterpretasi berdasarkan jumlah linkage group yang
115 Gambar 41 Skema diagram genotyping marka SNAP yang digunakan untuk validasi marka putatif SNAP pada fragmen gen WRKY, SUS, SACPD dan ABI dari tanaman kelapa.
Hasil dan Pembahasan Sampel Populasi F2 yang Dianalisis
Sebanyak 121 sampel berupa bibit dan embryo buah hasil selfing tetua F1 kelapa kopyor heterosigot telah diisolasi DNA dan digunakan dalam analisis awal peta keterpautan marka SSR dan SNP dengan sifat kopyor. Komposisi fenotipe populasi F2 yang digunakan yaitu sebanyak 108 bibit dan embrio dari buah normal dan 13 planlet/embryo dari buah kopyor hasil selfing tetua F1 kelapa kopyor heterosigot. Komposisi jumlah sampel tersebut belum mengikuti pola segregasi Hukum Mendel I.
Pada penelitian ini F1 kelapa kopyor heterosigot yang digunakan merupakan persilangan antara dua tetua dengan satu sifat beda yaitu sifat kopyor, maka pada populasi F2 perbandingan ideal jumlah sampel buah normal : buah kopyor semestinya 3 : 1. Perbandingan tersebut didasarkan pada asumsi bahwa sifat kopyor dikendalikan oleh gen tunggal yang bersifat resesif terhadap sifat normal pada kelapa.
Hasil analisis Chi-Square terhadap perbandingan sampel bibit dan embrio
buah dari normal dan planlet/embrio dari buah kopyor yang digunakan dalam analisis ini diperoleh nilai X2 hitungan sebesar 13.11, sedangkan nilai X2 tabel pada selang kepercayaan 5 persen adalah 9.84. Hasil tersebut menunjukkan belum sesuainya komposisi segregasi fenotipe buah nomal dan buah kopyor yang digunakan. Komposisi ideal jumlah sampel sebanyak 121 adalah 91 buah normal : 30 buah normal. Jumlah ideal untuk populasi F2 yang digunakan untuk pemetaan genetik minimal 200 sampel. Prasetiyono et al. (2003) menggunakan sebanyak
190 sampel F2 untuk mempelajari mempejari marka mikrosatelit yang terpaut dengan sifat toleransi terhadap keracunan alumunium pada padi, dan Sanjaya et al
(2002) menggunakan populasi F2 sebanyak 365 individu untuk pemetaan QTL sifat ketahanan terhadap penyakit antraknosa pada Capsicum spp. Untuk
116 mendapatkan hasil yang optimal, penelitian ini memungkinkan untuk dilanjutkan dengan menambah jumlah sampel buah normal menjadi sebanyak 150 sampel berupa bibit atau embrio dari buah normal dan 50 planlet dan embrio dari buah kopyor.
Seleksi Lokus SSR dan Primer SNP
Analisis peta keterpautan genetik pada penelitian ini menggunakan dua marka molekuler yaitu marka SSR dan SNP. Penggunaan kedua marka tersebut didasarkan pada sifatnya yang kodominan, yaitu mampu membedakan genotipe heterosigot dan homosigot. Lebrun et al. (2001) telah menggunakan lokus SSR
untuk konstruksi peta keterpautan untuk karakter produksi buah kelapa Dalam Rennell, dan Baudouin et al. (2006) untuk karakter komponen buah pada varietas kelapa yang sama. Marka SNP telah digunakan oleh Akond et al. (2013) untuk
membuat peta keterpautan genetik pada kedelai dan Lee at al. (2015) telah mengidentifikasi SNP Genom-wide dan QTL untuk ketahan penyakit Black rot pada tanaman kubis.
Lokus SSR dan SNP diseleksi pada tahap awal berdasarkan keberhasilan amplifikasi terhadap sampel DNA tanaman F1, selanjutnya diuji melalui pemisahan produk PCR pada gel akrilamid untuk lokus SSR dan pada gel agarose untuk marka SNP. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa tidak semua lokus yang digunakan menghasilkan alel yang heterosigot pada tanaman F1 yang diuji. Lokus SSR yang heterosigot ditunjukkan dengan adanya dua alel, sedangkan yang homosigot hanya menghasilkan satu alel pada pemisahan produk PCR pada gel akrilamid 6%. Seleksi marka SNP dilakukan berdasarkan keberhasilan pasangan primer mengamplifikasi sampel DNA F1 yang diuji. Primer yang menghasilkan dua alel pada kedua pasangan dikategorikan sebagai primer yang heterosigot, sedangkan yang hanya menghasilkan amplifikasi pada salah satu pasang primer dikategorikan homosigot. Seleksi lokus SSR disajikan pada Gambar 42.
Gambar 42 Seleksi tujuh lokus SSR (A) CnCir_147, (B) CnCir_47, (C) CiCir_73, (D) CiCir_109, (E) CnCir_192, (F) CnCir_206, ((G) CnCir_H4 pada sampel DNA F1 dan F2 kelapa kopyor
Hasil seleksi terhadap 65 lokus SSR dan 17 pasang primer SNP diperoleh 19 lokus SSR dan dua marka SNP yang menghasilkan alel heterosigot pada sampel DNA tanaman F1 kelapa kopyor heterosigot Kk. Masing-masing lokus menghasilkan produk PCR dengan ukuran basa dengan kisaran tertentu. Lokus
M 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 61 2 3 4 5 6 1 2 A B C D E F G
117 SSR dan marka SNP yang digunakan untuk mengamplifikasi semua sampel progeni F2 kelapa kopyor yang diuji disajikan pada Tabel 17 dan Tabel 18.
Amplifikasi lokus SSR pada progeni F2 kelapa kopyor menghasilkan variasi alel pada masing-masing genotipe yang diuji. Contoh hasil pemisahan produk PCR pada gel poliakrilamid untuk lokus CNZ_21, CNZ_51 dan CnCir_A9 disajikan pada Gambar 43 sedangkan hasil analisis menggunakan marka SNP Sus#3 di tunjukkan pada Gambar 44.
Tabel 17. Daftar lokus SSR kelapa hasil seleksi pada individu F1 kelapa kopyor
No Nama Lokus Urutan Basa Nukleotida (5‟- 3‟) Jumlah Basa TM (oC) Ukuran Produk PCR (bp) 1 CNZ_21 F ATGTTTTAGCTTCACCATGAA 21 550C 260-280 CNZ_21 R TCAAGTTCAAGAAGACCTTTG 21 2 CNZ_51 F CTTTAGGGAAAAAGGACTGAG 21 550C 170-190 CNZ_51 R ATCCATGAGCTGAGCTTGAAC 21 3 CnCir_56 F AACCAGAACTTAAATGTCG 19 550C 210-230 CnCir_56 R TTTGAACTCTTCTATTGGG 19 4 CnCir_C5F ACCAACAAAGCCAGAGC 17 550C 120-140 CnCir_C5 R GCAGCCACTACCTAAAAAG 19 5 CnCir_1 F TTGGTCTATTGCATGTTC 18 550C 150-170 CnCir_1 R TGGCATTGAGAGGGT 15 6 CnCir_A9 F AATGTTTGTGTCTTTGTGCGTGTGT 25 600C 80-110 CnCir_A9 R TCCTTATTTTTCTTCCCCTTCCTCA 25 7 CnCir_73 F TAGAAGGAAAGGGAGATG 18 580C 240-255 CnCir_73 R GTCCATCACTAAGATAGATCA 21 8 CnCir_87 F ATAACATCCTCCAACCTG 18 550C 170-185 CnCir_87 R GACTGAATCCAACCCTT 17 9 CnCir_A3 F AATCTAAATCTACGAAAGCA 20 550C 250-260 CnCir_A3 R AATAATGTGAAAAAGCAAAG 20 10 CnCir_H11 F TCATTCAGAGGACAAAAGTT 20 460C 190-210 CnCir_H11 R TAAAAATTCATAAAGGTAAAA 21 11 CnCir_2 F AGTCCTAAAAGTGTTGGC 18 550C 230-250 CnCir_2 R GTAATCCTATGGCTGCTT 18 12 CnCir_226 F CTGAAGATATGTGTTTATGC 20 580C 270-290 CnCir_226 R TGTTCCAGATTGAGGTT 17 13 CnCir_H4 F TTAGATCTCCTCCCAAAG 18 550C 220-240 CnCir_H4 R ATCGAAAGAACAGTCACG 18 14 CnCir_167 F GGTGGGTAAGTGAACATC 18 550C 165-185 CnCir_167 R GTGATACAACGAACCCTC 18 15 CnCir_47 F ATAGCCTCTCTCTGATGGT 19 600C 160-180 CnCir_47 R TGAATCGTGGTGTGCT 16 16 CnCir_121 F GGACACTGGGTTCTGTT 17 550C 213-230 CnCir_121 R CTCTGTAATCTGCGGG 16 17 CnCir_J2 F CCATTGTCATTGTTATTTTG 20 520C 220-240 CnCir_J2 R GTCACCATCTTCTCAGTTTC 20 18 CnCir_51 F TCTCGTGGATCTCGTC 16 580C 185-210 CnCir_51 R GCTCTTCCAGTTACGTTT 18 19 WCYZ_1721 F ACCGTACTTACATCCTCACCCA 22 550C 230-240 WCYZ_1721 R CACTCTTCCCTTTGCTCTTCAC 22
118 Tabel 18. Daftar primer SNP kelapa hasil seleksi pada individu F1 kelapa kopyor
No Nama Primer
Urutan Basa Nukleotida Jumla
h Basa TM (oC) Ukuran Produk PCR 1 WRKY2- P#1Ref TCAAAAGTCGTACGTGAACCACGGG 25 66,7 280 WRKY2- P#1Rev GCCCTCTCAACGTGCTTCCGG 21 67,0 WRKY2- P#1Alt CATCAAAAGTCGTACGTGAACCAGG GA 27 66,7 310 2 CNSUS 1 P#3 Ref
5'-GAA TGA GAT GCT ACA AAG AAT AAA TAA G-3'
28 56 260
CNSUS 1 P#3 Rev
5'-TCT GTT CTA AAT GGA ACG CG-3' 20 56 CNSUS 1
P#3 Alt
5'-GAA TGA GAT GCT ACA AAG AAT AAA TAA A-3'
28 56 300
Gambar 43 Hasil analisis SSR terhadap 25 genotipe populasi F2 kelapa kopyor menggunakan lokus (A) CNZ_21, (B) CNZ_51 dan (C) CnCir_A9
Gambar 44 Hasil analisis SSR terhadap 25 genotipe populasi F2 kelapa kopyor menggunakan marka SNP Sus#3
+ + - + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + H B H H H H H H B H H H M H H H B B H A H H H A H H A B H H A H A A B H B M A M H B H H H H B A H H B H H A H H H H H ? H A H H M B M H B B B B H A H B H H H H B B H H H B B A H H B M C
119 Adanya variasi alel heterosigot H berasal dari tetua kelapa Dalam kopyor