Bab 2. Tinjauan Pustaka
2.2. Spektrofotometri Ultraviolet – Visible (UV – Vis) 18
Spektrofotometri Sinar Tampak (UV-Vis) adalah pengukuran energi cahaya oleh suatu sistem kimia pada panjang gelombang tertentu (Day, 2002). Sinar ultraviolet (UV) mempunyai panjang gelombang antara 200-400 nm, dan sinar tampak (visible) mempunyai panjang gelombang 400-750 nm. Pengukuran spektrofotometri menggunakan alat spektrofotometer yang melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometer UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif. Spektrum UV-Vis sangat berguna untuk pengukuran secara kuantitatif. Konsentrasi dari analit di dalam larutan bisa ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Beer (Rohman, 2007).
Spektrofotometri UV – Vis melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometri UV – Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif. Spektrofotometri UV – Vis dapat melakukan penentuan terhadap sampel yang berupa larutan, das atau uap. Untuk sampel yang berupa larutan perlu diperhatikan beberapa persyaratan pelarut yang dipakai, antara lain:
a. Pelarut yang dipakai tidak mengandung sistem ikatan rangkap terkonjugasi pada struktur molekulnya dan tidak berwaran.
b. Tidak terjadi interaksi dengan molekul senyawa yang dianalisis. c. Kemurniannya harus tinggi atau derajat untuk dianalisi (Mulja,1995).
Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spectrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukuran intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsobsi. Pada fotometer filter, tidak mungkin diperoleh panjang gelombang yang benar – benar monokromatis, melainkan suatu trayek panjang gelombang 30 – 40 nm. Sedangkan pada spektrofotometer, panjang gelombang yang benar – benar terseleksi dapat diperoleh dengan bantuan alat pengurai cahaya seperti prisma (Khopkar, 2002).
Jika seberkas sinar putih dilewatkan melalui sebuah kuver yang telah diisi dengan larutan, radiasi sinar yang keluar lebih lemah daripada sinar yang masuk. Pengurangan kekuatan sinar tersebut biasanya disebut sebagai absorpsi dari energi radiasi oleh larutan (Ewing, 1985).
Pembagian spektrum dari sinar ultraviolet dan sinar tampak dapat dilihat pada tabel 2.2
Tabel 2.2 Pembagian Dari Spektrum Ultraviolet dan Sinar Tampak.
Warna Warna komplementer Panjang gelombang (nm)
Ultraviolet – vakum - 10 – 200
Ultraviolet – dekat - 200 – 380 Violet Kuning – Hijau 380 – 435 Biru Kuning 435 – 480 Hijau – Biru Jingga – Merah 480 – 500 Hijau Purple 500 – 560 Kuning – Hijau Violet 560 – 580
Kuning Biru 580 – 595
Jingga Hijau – Biru 595 – 650 Merah Biru – Hijau 650 – 780 Sumber : Braun (1987)
Spektra UV – Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif.
1. Aspek Kuantitatif
Data spectra UV – Vis secara tersendiri dapat digunakan untuk identifikasi kualitatif obat atau metabolitnya. Akan tetapi jika digabungkan dengan cara lain seperti sketroskopi infra merah, resonansi magnetic inti, dan spektroskopi massa, maka dapat digunakan untuk maksud identifikasi/analisis kualitatif
adalah panjang gelombang maksimal, intensitas, efek Ph, dan pelarut; yang kesemuanya itu dapat diperbandingkan dengan data yang sudah dipublikasikan. Dari spectra yang diperoleh dapat dilihat, misalnya:
a) Serapan (absorbansi) berubah atau tidak karena perubahan Ph. Jika berubah, bagaimana perubahannya apakah dari batokromik ke hipsokromik dan sebaliknya atau dari hipokromik ke hiperkromik, dan sebaliknya.
b) Obat – obatan yang netral misalnya kafein, kloramfenikol; atau obat – obat yang berisi auksukrom yang tidak terkonjugasi seperti amfetamin, siklizin, dan pensiklidin
2. Aspek Kuantitatif
Dalam aspek kuantitatif, suatu berkas radiasi dikenankan pada cuplikan (larutan sampel) dan intensitas sinar radiasi yang diteruskan dan diukur besarnya. Radiasi yang diserapoleh cuplikan ditentukan dengan membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya. Intensitas atau kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu satuan luas penampang perdetik. Perhatikan suatu larutan encer senyawa yang mampu menyerap sinar pada panjang gelombangterpilih untuksuatu percobaan dengan menggunakan pelarut yang tidak menyerap sinar pada panjang gelombang yang terpilih tersebut.
maka penurunan intensitas sinar (dl) karena melewati lapisan larutan tersebut berbanding langsung dengan intensitas radiasi (I), konsentrasi spesies yang menyerap (c), dan dengan ketebalan lapisan larutan (db). Secara sistematis, pernyataan ini dapat dituliskan seperti pada persamaan (1) :
-dl = kIcdb……… (1)
Persamaan diatas dapat disusun ulang dan diintegralkan dengan batasan (intensitas sinar mula – mula) dan I (intensitas sinar setelah melalui larutan dengan ketebalan b).
= k ……… (2)
-ln = kbc……….. (3)
I = ... (4) Dengan merubah menjadi logaritma basis 10, maka akan didapatkan persamaan seperti pada persamaan (5) :
I = ……… (5)
Yang mana = a, maka persamaan (5) di atas dapat diubah menjadi persamaan (6): log ………. (6) A = abc……… (7) Yang mana : A = absorban a = absorptivitas
c = konsentrasi
Persamaan (7) dikenal dengan hokum Lambert – beer.
Hukum Lambert – Beer menyatakan behwa intensitas yang diteruskan oleh larutan zat penyerap berbanding lurus dengan tebal dan konsentrasi larutan. Dalam hukum Lambert – Beer tersebut ada beberapa pembatasan yaitu:
Sinar yang digunakan dianggap monokromatis
Penyerapan terjadi dalam suatu volume yang mempunyai penampang luas yang sama
Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak tergantung terhadap yang lain dalam larutan tersebut
Tidak terjadi peristiwa fluoresensi atau fosforisensi
Indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi larutan (Sudjadi, 2008).
Baik spektrofotometer berkas – tunggal maupun berkas – rangkap, dan instrument yang beroperasi dalam berbagai daerah spectrum, semuanya mempunyai komponen – komponen penting ini, meskipun rinciannya sangat berlainan delam beberapa hal. Berikut merupakan komponen – komponen yang ada dalam spektrofotometer UV – Vis.
a) Sumber
Sumber energi radiasi yang biasa untuk daerah tampak (dari) spektrum itu maupun daerah ultraviolet dekat dan inframerah dekat adalah sebuah lampu
pijar dengan kawat rambut terbuang dari wolfram. Pada kondisi operasi biasa, keluaran lampu wolfram ini memadai dari sekitar 325 nm atau 350 nm hingga sekitar 3 µ m. energi yang dipancarkan oleh kawat yang dipanaskan itu beraneka sekali menurut panjang gelombangnya. Distribusi energi merupakan fungsi temperatur kawat, yang selanjutnya bergantung pada voltase yang disuplai kepada lampu; kenaikan temperatur operasi menaikan keluaran energi total dan menggeser puncak ke panjang gelombang yang lebih pendek.
b) Monokromator
Ini adalah peranti optis untuk mengisolasi suatu berkas radiasi dari suatu sumber berkesinambungan, berkas mana mempunyai kemurnian spektral yang tinggi dengan panjang gelombang apa saja yang diinginkan. Komponen yang hakiki (esensial) dari sebuah monokromator adalah suatu sistem celah dan suatu unsur dispersif. Radiasi dari sumber difokuskan ke celah masuk, kemudian disejajarkan oleh sebuah lensa atau cermin sehingga suatu berkas sejajar jatuh ke unsur pendispersi, yang berupa prisma atau suatu kisi difraksi. Dengan memutar prisma atau kisi itu secara mekanis, aneka porsi spektrum yang dihasilkan oleh unsur dispersif dipusatkan pada celah keluar, dari situ, lewat jalan optis lebih jauh, porsi – porsi itu menjumpai sampel.
c) Sel
Kebanyakan spektrofotometri melibatkan larutan, dan kerenanya kebanyakan wadah sampel adalah sel untuk menaruh cairan ke dalam berkas cahaya spektrofotometer. Sel itu haruslah meneruskan energi radiasi dalam daerah
kaca silika tinggi istimewa untuk daerah ultraviolet dan garam dapur alam untuk inframerah. Sel tampak dan ultraviolet yang khas mempunyai panjang lintasan 1 cm, namun tersedia sel dengan ketebalan yang sangat beraneka, mulai dari lintasan yang sangat pendek, kurang daripada 1 milimeter, sampai 10 cm atau bahkan lebih.
d) Detektor
Dalam sebuah detekor untuk suatu spektrofotometer, kita menginginkan kepekaan yang tinggi dalam daerah spektral yang diminati, respon yang linear terhadap daya radiasi, waktu proses yang cepat, dapat digandakan, dan kestabilan tinggi atau tingkat “noise” yang rendah, meskipun dalam praktiknya perlu untuk mengkompromokan faktor – faktor ini. Kepekaan yang tinggi misalnya, dapat dicapai dengan menerima noise yang meningkat. Macam – macam detaksi yang telah digunakan paling meluasa, didasarkan pasa perubahan fotokimia (terutama forografi), efek fotolistrik, dan efek termolistrik. Forografi tidak lagi digunakan dalam spektrofotometri biasa; secara umum, detektor fotolistrik digunakan dalam daerah tampak dan ultraviolet, dan detektor yang didasarkan pada efek termal digunakan dalam inframerah (Day,2002).