BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA
G. Spektrofotometri visibel
Spektrofotometri visibel merupakan suatu teknik spektroskopik menggunakan sumber radiasi elektromagnetik sinar tampak (380-780 nm) dengan menggunakan spektrofotometer. Pengukuran absorbansi dalam spektrofotometri sinar tampak digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif (Khopkar, 1990). Sinar tampak memberikan energi yang cukup untuk terjadinya transisi elektronik. Transisi yang terjadi pada suatu molekul dengan struktur yang berbeda adalah tidak sama satu dengan molekul lain sehingga spektra absorpsinya juga berbeda. Dengan demikian dapat bermanfaat sebagai analisis kualitatif. Banyaknya sinar yang diabsorpsi pada panjang gelombang tertentu sebanding dengan banyaknya molekul yang menyerap radiasi sehingga dapat juga digunakan sebagai analisis kuantitatif (Rohman dan Gandjar, 2007).
Suatu molekul dapat memberikan serapan REM jika memiliki gugus kromofor yaitu gugus penyerap dalam molekul. Pada senyawa organik dikenal pula gugus auksokrom yaitu gugus tidak jenuh yang terikat langsung pada kromofor. Gugus auksokrom dapat mengubah panjang gelombang serapan dan intensitas serapan maksimum (Sastrohamidjojo, 2002).
Ikatan terkonjugasi merupakan ikatan rangkap yang berselang-seling dengan satu ikatan tunggal. Dalam orbital molekul, elektron π mengalami delokalisasi lanjut dengan adanya ikatan terkonjugasi. Adanya efek delokalisasi ini akan menyebabkan penurunan tingkat energi π* dan memberikan pengurangan karakter antiikatan. Sebagai konsekuensinya, panjang gelombang molekul yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
mempunyai ikatan rangkap terkonjugasi akan mengalami pergeseran batokromik (Rohman dan Gandjar, 2007).
Besarnya REM yang dapat diserap oleh kromofor dapat digambarkan oleh dua hukum yaitu hukum Lambert dan Beer. Hukum Lambert menyatakan bahwa bila cahaya monokromatik melewati medium tembus cahaya, laju berkurangnya intensitas oleh bertambahnya ketebalan berbanding lurus dengan intensitas cahaya. Hukum Beer menyatakan bahwa intensitas berkas cahaya monokromatik berkurang secara eksponensial dengan bertambahnya konsentrasi zat penyerap linier (Bassett, Denney, Jeffery, dan Medham, 1994).
H. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) 1. Definisi dan instrumentasi KCKT
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan salah satu metode kromatografi cair yang memanfaatkan kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sensitif sehingga kromatografi kolom cair dapat menjadi sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Teknologi kolom didasarkan pada penggunaan kolom dengan diameter dalam antara 2mm hingga 5mm dan isi kolom berupa partikel dengan diameter 3µm hingga 50µm. Teknologi kolom partikel kecil ini membutuhkan sistem tekanan tinggi sampai 300 atmosfer agar tercapai laju alir fase gerak beberapa ml tiap menit. Sering digunakan jumlah zat uji dalam jumlah yang kecil karena diameter kolom yang cukup kecil sehingga dibutuhkan detektor yang sensitif. Adanya teknologi ini, pemisahan dapat terjadi dalam waktu cepat dengan keuntungan
19
dapat memisahkan zat-zat yang tidak menguap atau tidak tahan panas tanpa perlu membuat derivat yang mudah menguap (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995).
Pada KCKT menggunakan sistem kromatografi partisi dengan polaritas yang berbeda dari fase diam dan fase geraknya. Bila fase gerak bersifat polar dan fase diam bersifat non-polar maka dikenal dengan kromatografi fase balik (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995). Peralatan KCKT dapat dilihat pada gambar 7.
Gambar 7. Peralatan KCKT (Kazakevich and Nair, 1996)
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam analisis menggunakan KCKT, yaitu fase gerak, kolom, dan detektor.
a. Fase gerak
Fase gerak pada sistem KCKT sangat berpengaruh pada tambatan sampel dan pemisahan komponen dalam campuran zat. Bila digunakan sistem kromatografi fase terbalik maka kandungan utama fase geraknya ialah air (Munson, 1994).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
b. Kolom
Kolom yang digunakan pada KCKT ialah kolom kemasan fase terikat. Fase diam yang biasanya digunakan pada sistem kromatografi fase terbalik ialah oktadesilsilan (ODS) (Munson, 1984)
c. Detektor
Persyaratan detektor KCKT adalah sensitifitas harus tinggi (10-8 – 10-15 g analit/detik); kestabilan dan reprodusibilitas yang baik; memberikan respon yang linier terhadap konsentrasi analit; dapat bekerja pada temperatur kamar sampai 400°C; tidak terpengaruh oleh perubahan temperatur dan kecepatan fase gerak; mudah didapat dan mudah dioperasikan; selektif terhadap berbagai macam analit di dalam fase gerak; tidak merusak analit; dapat menghilangkan “zone broadening” dengan adanya pengaruh minimal internal volume (Mulja dan Suharman, 1995).
2. Kromatografi Partisi Fase Terbalik
Prinsip kromatografi partisi adalah partisi analit di antara dua fase yang tidak saling campur, karena adanya perbedaan koefisien distribusi dari masing-masing senyawa. Pada kromatografi partisi digunakan fase gerak dan fase diam dengan polaritas yang berbeda. Jika fase gerak bersifat polar dan fase diam non polar, dikenal dengan fase terbalik (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995).
21
Dalam kromatografi, K didefinisikan sebagai perbandingan konsentrasi analit dalam fase diam (Cs) dan dalam fase gerak (Cm) (Rohman dan Gandjar, 2007).
(1)
Kolom yang biasa digunakan dalam kromatografi partisi fase terbalik adalah kolom dengan kemasan fase terikat yang memiliki sifat stabil karena fase diamnya terikat secara kimia pada penyangga, sehingga tidak mudah terelusi oleh fase gerak. Penyangga pada fase terikat biasanya terbuat dari silika yang sudah diseragamkan, berpori, dan umumnya mempunyai diameter 3,5 atau 10 µm (Skogg dkk., 1998).
Pada KCKT partisi fase terbalik biasanya mengandung bagian organik yang terikat secara kimia dengan gugus silanol pada permukaan silika. Bagian organik tersebut umumnya hidrokarbon rantai panjang, sehingga fase gerak umumnya polar. Gugus silanol permukaan dapat direaksikan dengan berbagai cara menempelkan berbagai jenis gugus organik. Kemasan fase terikat dengan tipe ikatan siloksan (Si-O-Si-O) dibuat dengan mereaksikan organoklorosilan dengan gugus silanol pada permukaan silika gel. Reaksi pembuatan kolom oktadesilsilan (ODS) gugus silanol dan oktadesilklorosilan dapat dilihat pada gambar 8.
Si OH Cl Si (CH2)17CH3 Si O Si (CH2)17CH3 HCl Gambar 8. Reaksi pembuatan kolom oktadesilsilan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Gugus yang ditempelkan pada silanol pada umumnya adalah hidrokarbon rantai panjang. Panjang pendeknya rantai karbon mempengaruhi tertambatnya senyawa pada fase diam.
Gugus silanol yang tidak bereaksi karena adanya halangan sterik dapat memberikan kepolaran yang tidak dikehendaki dan menyebabkan pengekoran pada puncak kromatogram. Untuk mengurangi jumlah gugus silanol yang masih bebas, reaksi dilanjutkan dengan penambahan trimetilklorosilan yang dapat mencapai gugus silanol karena ukurannya yang lebih kecil dibandingkan organoklorosilan lain. Penambahan trimetilklorosilan dapat menutupi banyak gugus silanol yang masih bebas, namun tidak semua gugus tersebut dapat tertutupi (Skoog dkk., 1998).
Fase gerak yang sering digunakan adalah campuran metanol atau asetonotril dengan air atau dengan larutan buffer. Untuk analit yang bersifat asam atau basa lemah, peranan pH sangat penting karena jika pH fase gerak tidak diatur maka analit akan mengalami ionisasi sehingga ikatan dengan fase diam akan menjadi lemah jika dibandingkan dengan bentuk tidak terionisasi, spesies yang terionisasi akan terelusi lebih cepat (Rohman dan Ganjar, 2007).
3. Waktu retensi dan resolusi
Waktu tambat atau waktu retensi adalah selang waktu yang diperlukan linarut (solut) mulai saat injeksi sampai keluar dari kolom dan sinyalnya ditangkap oleh detektor dan dinyatakan sebagai tR (Mulja dan Suharman, 1995).
23
Resolusi (Rs) adalah jarak antara dua puncak dibagi dengan rata-rata lebar dasar puncak dapat diukur dengan persamaan:
(2)
Harga tR1 dan tR2 merupakan waktu retensi senyawa yang dapat diukur pada titik maksimum puncak, harga w1 dan w2 merupakan lebar alas puncak (Mulja dkk, 1995). Untuk pemisahan yang baik R harus ≥ 1,5 karena berarti pemisahan senyawa ≥ 99,7% (Sastrohamidjojo, 2002).
Gambar 9. Pemisahan dua senyawa (Meyer, 2004)
4. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif
a. Analisis Kualitatif. Analisis kualitatif dapat dilakukan dengan membandingkan waktu retensi senyawa murni dan waktu retensi zat uji dalam sampel. Respon yang dihasilkan berupa tinggi peak maupun luas area peak
selanjutnya dapat digunakan untuk analisis kuantitatif (Noegrohati, 1994).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
b. Analisis Kuantitatif. Analisis kuantitatif menggunakan kromatogram yang dihasilkan dari pemisahan KCKT. Cara analisis kuantitatif KCKT yang digunakan yaitu dapat berdasarkan tinggi puncak dan berdasarkan luas puncak. Tinggi dan luas puncak berkaitan secara proporsional atas kadar ataupun jumlah analit tertentu yang terdapat dalam sampel. Apabila kromatogram yang dihasilkan mengalami pelebaran puncak maka analisis berdasarkan tinggi puncak menjadi tidak teliti lagi. Cara yang tepat dalam perhitungan kuantitatif yaitu berdasarkan luas pucak. Analisis kuantitatif berdasarkan luas puncak lebih disukai karena tidak dipengaruhi oleh pelebaran pita (Noegrohati, 1994).
I. Landasan Teori
Kurkumin merupakan senyawa fitokimia yang berwarna kuning-orange yang secara praktis tidak larut dalam air. Kurkumin terdapat dari ekstrak tanaman bergenus Curcuma sp. Kurkumin tidak larut dalam air namun larut dalam etanol atau dimetilsulfoksida. Kurkumin mudah terdegradasi dalam kondisi pH tertentu. Obat herbal terstandar (OHT) ialah sediaan obat tradisional yang berasal dari ekstrak atau penyarian bahan alam yang dapat berupa tanaman obat, binatang, maupun mineral. Obat herbal terstandar (OHT) Rheumakur® merupakan obat herbal terstandar yang diproduksi oleh PT Phytochemindo dengan sediaan berbentuk kapsul lunak. Komposisi Rheumakur® sendiri terdiri atas 10 mg ekstrak kurkuminoid yang telah distandardisasi dan 100 mg minyak atsiri kunyit dan temulawak. Rheumakur® berkhasiat membantu mengatasi timbulnya rasa nyeri yang sering dikeluhkan penderita penyakit rheumatik.
25
Cara Pembuatan Obat Tradisional yang Baik (CPOTB) bertujuan untuk menjamin agar produk yang dihasilkan senantiasa memenuhi persyaratan yang berlaku. Dilakukan langkah-langkah agar obat tradisional yang dihasilkan aman, bermanfaat, dan bermutu; keamanan dan mutu obat tradisional tergantung pada bahan baku, bangunan, prosedur dan pelaksanaan proses pembuatan, peralatan yang digunakan, pengemas termasuk bahannya serta personalia yang terlibat
Metode KCKT digunakan untuk menetapkan kadar kurkumin dalam sediaan obat herbal terstandar (OHT) karena memiliki sensitifitas dan selektifitas yang tinggi. Metode KCKT dapat digunakan sebagai analisis kualitatif dan kuantitatif.