BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
F. Spektroskopi Ultra Violet
Bercak-bercak yang ditunjukan dari kromatografi kertas dua arah ( KKt 2A) dipotong kecil-kecil kemudian dipisahkan sesuai warna masing-masing bercak. Didapatkan tiga macam bercak yang telah dikelompokan sesuai warna yang tampak
pada KKt 2A sebelum dan sesudah diuapi amonia (NH3), yaitu bercak warna kuning
(bercak IID); bercak warna biru (bercak IIE, IIF, IIG); dan bercak warna ungu (bercak IIA dan IIB). Sedangkan bercak warna coklat (bercak IIC), tidak bisa diinterpretasikan sebagai senyawa flavonoid sehingga tidak dapat digunakan untuk bahan pemeriksaan flavonoid. Dalam pustaka acuan, tidak ada senyawa flavonoid yang menunjukan warna bercak coklat pada KKt2A dibawah sinar UV 366 nm sebelum dan sesudah diuapi amonia (Mabry et al., 1962). Setelah itu potongan kertas
hasil KKt2A yang telah dikelompokan sesuai warna masing-masing bercak dimasukan dalam falkon dan dilarutkan dengan 10 ml metanol p.a. untuk dianalisis secara spektroskopi UV. Sebelum melakukan analisis spektroskopi UV harus dipersiapkan pereaksi-pereaksi geser yang akan digunakan lebih dahulu. Pereaksi- pereaksi geser yang digunakan adalah Natrium metoksida (NaOMe) atau Natrium
hidroksida (NaOH) 2M, Aluminium klorida (AlCl3), Asam klorida (HCl) Natrium
asetat (NaOAc), dan Asam borat (H3BO3). Analisis dilakukan dengan
membandingkan spektrum yang diperoleh dari berbagai pereaksi geser diatas dengan diinterpretasikan kemungkinan struktur flavonoidnya berdasarkan literatur.
Langkah-langkah untuk menginterpretasikan spektrum sehingga diperoleh
suatu struktur flavonoid adalah dengan memperhatikan data yang diperoleh dari KKt 2A, bentuk umum dari spektrum isolat flavonoid dalam MeOH, dan panjang gelombang pita serapan yang diperoleh dari spektrum yang dihasilkan setelah penambahan pereaksi-pereaksi geser. Untuk interpretasi akhir identifikasi flavonoid dilakukan dengan cara menggabungkan data hasil spektroskopi UV dengan hasil pemetaan KKt 2A dan identifikasi warna pendahuluan.
Spektrum isolat flavonoid dalam metanol ditambah dengan pereaksi geser NaOH 2M merupakan spektrum flavonoid yang gugus hidroksi fenolnya sampai batas tertentu terionisasi, sehingga spektrum ini merupakan petunjuk pola hidroksilasi untuk mendeteksi gugus hidroksi yang lebih asam dan tidak tersubstitusi. Adanya
kemungkinan degradasi atau pengurangan kekuatan spektrum setelah waktu tertentu merupakan petunjuk adanya gugus yang peka terhadap basa.
Spektrum isolat flavonoid dalam metanol ditambah pereaksi geser AlCl3 dan
AlCl3/HCl karena membentuk komplek tahan asam antara gugus hidroksi dan keton
yang bertetangga dan membentuk komplek tidak tahan terhadap asam dengan gugus orto dihidroksi, maka pereaksi ini dapat digunakan untuk mendeteksi kedua gugus tersebut. Spektrum isolat flavonoid dalam metanol ditambah dengan pereaksi geser
AlCl3 merupakan penjumlahan pengaruh semua komplek terhadap spektrum,
sedangkan spektrum isolat flavonoid dalam metanol ditambah dengan pereaksi geser AlCl3/HCl hanya merupakan pengaruh komplek hidroksi-keto.
Spektrum isolat flavonoid dalam metanol ditambah dengan pereaksi geser NaOAc menyebabkan pengionan pada gugus hidroksi flavonoid yang paling asam, pereaksi ini digunakan untuk mendeteksi adanya gugus 7-hidroksi bebas. Spektrum isolat flavonoid dalam metanol ditambah dengan pereaksi geser NaOAc/H3BO3 menjembatani kedua gugus hidroksi pada gugus orto dihidroksi dan digunakan untuk mendeteksi gugus orto dihidroksi.
Tabel XIII. Data hasil Spektroskopi UV dari isolat warna kuning (K) Serapan ( λ )
nm
Pergeseran Pereaksi
Pita II Pita I Pita II Pita I
Interpretasi struktur flavonoid
MeOH 212 274 bh Tidak bisa diinterpretasikan
NaOH 217 289 bh +5 +15 Tidak bisa diinterpretasikan
AlCl3 218 272 bh +6 -2 Tidak bisa diinterpretasikan
AlCl3/HCl 211 273 bh -1 -1 Tidak bisa diinterpretasikan
NaOAc 224 271 bh +12 -3 Tidak bisa diinterpretasikan
Keterangan bh : bahu
Pada analisis UV, isolat K dalam metanol serapannya 274 nm (pita I) dan 212 nm (pita II), tidak dapat diinterpretasikan karena tidak termasuk dalam rentang serapan spektrum UV-tampak flavonoid berdasarkan acuan pustaka (Markham, 1988). Hal ini menunjukan bahwa isolat K tidak dapat diidentifikasi jenis flavonoidnya.
Tabel XIV. Data hasil Spektroskopi UV dari isolat warna ungu (U) Serapan ( λ ) nm Pergeseran
Pereaksi
Pita II Pita I Pita II Pita I
Interpretasi struktur flavonoid
MeOH 246 283 bh Isoflavon
Isoflavon (5-deoksi-6,7- dioksigenasi)
Khalkon Auron
NaOH 220 322 bh -26 +39 Tidak bisa diinterpretasikan
AlCl3 218 279 bh -28 -4 Tidak bisa diinterpretasikan
AlCl3/HCl 217 278 bh -29 -5 Tidak bisa diinterpretasikan
NaOAc 217 279 bh -29 -4 Tidak bisa diinterpretasikan
NaOAc/H3BO3 274 282 bh +28 -1 o-diOH pada cincin A (6,7 atau
7,8) Keterangan bh : bahu
Pada analisis UV, isolat U dalam metanol serapannya 283 nm (pita I) dan 246 nm (pita II) menunjukan bahwa isolat U mengalami metilasi/glikosilasi (terutama 3,5,7 dan 4’-hidroksil) yang mengakibatkan pergeseran pita ke panjang gelombang yang lebih rendah. Selain itu dengan adanya puncak kedua dalam pita II (bahu) sebagai bukti bahwa pada flavon dan flavonol ada sistem 3’,4’-diOH. Dengan melihat hasil dari pita II, data spektrum ini menunjukan bahwa isolat U mengarah pada golongan Isoflavon, Isoflavon (5-deoksi-6,7-dioksigenasi), Khalkon, Auron. Pada
penambahan NaOH 2M pita serapan 220 nm, 322 nm. Pergeseran hipsokromik pada pita II sebesar -26 nm (dari 246 nm ke 220 nm) dan pergeseran batokromik pada pita I sebesar +39 nm (dari 283 nm ke 322 nm), pergeseran ini tidak bisa diinterpretasikan.
Pada penambahan AlCl3 dalam isolat U pita serapan 218 nm, 279 nm terjadi pergeseran hipsokromik pada pita II sebesar -28 nm (dari 246 nm ke 218 nm) dan pada pita I terjadi pergeseran hipsokromik sebesar -4 nm (dari 283 nm ke 279 nm), pergeseran ini tidak bisa diinterpretasikan. Hal ini dapat dijelaskan bahwa tidak ada gugus orto dihidroksi pada cincin B dan tidak ada gugus hidroksi pada C-5.
Pada penambahan HCl pada isolat U yang sudah ditambah AlCl3 (AlC3/HCl) diperoleh pita 217 nm, 278 nm terjadi pergeseran hipsokromik pada pita II sebesar - 29 nm (dari 246 nm ke 217 nm), hal ini tidak bisa diinterpretasikan. Dapat dijelaskan bahwa tidak ada gugus hidroksi pada C-3 maupun pada C-5 yang bisa bereaksi dengan gugus keton membentuk komplek stabil dengan AlC3.
Pada penambahan NaOAc pita serapan 217 nm, 279 nm (untuk deteksi gugus 7-OH). Pada isolat U terjadi pergeseran hipsokromik pada pita II sebesar -29 nm (dari 246 nm ke 217 nm), pergeseran ini tidak bisa diinterpretasikan. Hal ini menunjukan tidak adanya gugus hidroksi pada C-7.
Pada penambahan H3BO3 ke isolat U yang sudah ditambah dengan NaOAc
dihasilkan pita serapan pada 274 nm, 282 nm, terjadi pergeseran batokromik pada pita II sebesar +28 nm (dari 246 nm ke 274 nm) dan pergeseran hipsokromik pada
pita I sebesar -1 nm (dari 283 nm ke 282 nm), hal ini menunjukan adanya gugus orto dihidroksi pada cincin A (6,7 atau 7,8).
Berdasarkan dari hasil interpretasi spektrum pada spektroskopi UV dapat disimpulkan bahwa isolat U merupakan suatu senyawa isoflavon yang mempunyai gugus orto dihidroksi pada cincin A (6,7 atau 7,8) tanpa gugus hidroksi pada C-5. Hal ini didukung dengan hasil dari kromatogram KKt 2A bahwa bercak U merupakan senyawa isoflavon, dan dilihat dari daerah sebaran bercak KKt 2A termasuk flavon C- dan C-/O-glikosida dengan interpretasi isoflavon7-O-diglikosida, isoflavon 7-O- monoglikosida dan flavonol tri-O-glikosida (3,7).
Tabel XV. Data hasil Spektroskopi UV dari isolat warna biru (B).
Serapan ( λ ) nm Pergeseran
Pereaksi
Pita II Pita I Pita II Pita I
Interpretasi struktur flavonoid
MeOH 226 278bh Tidak bisa diinterpretasikan
NaOH 220 - -6 - Tidak bisa diinterpretasikan
AlCl3 221 - -5 - Tidak bisa diinterpretasikan
AlCl3/HCl 220 - -6 - Tidak bisa diinterpretasikan
NaOAc 227 - +1 - Tidak bisa diinterpretasikan
NaOAc/H3BO3 228 - +2 - Tidak bisa diinterpretasikan
Keterangan bh : bahu
Pada analisis UV, isolat B dalam metanol serapannya 226 nm (pita I) dan 278 nm (pita II), tidak dapat diinterpretasikan karena tidak termasuk dalam rentang serapan spektrum UV-tampak flavonoid berdasarkan acuan pustaka (Markham, 1988). Hal ini menunjukan bahwa isolat B tidak dapat diidentifikasi jenis flavonoidnya. Hasil spektrofotometri ini dipengaruhi oleh faktor pencampuran warna bercak yang sama (biru) dari hasil kromatografi dua arah sehingga hasil spektrofotometri UV yang diperoleh menjadi kurang valid.
A. KESIMPULAN
Senyawa flavonoid yang mungkin terdapat dalam fraksi eter perasan daging buah Makuta dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.), yaitu isoflavon tanpa gugus hidroksi pada C-5 yang mempunyai gugus orto dihidroksi pada cincin A (6,7 atau 7,8). Rumus strukturnya sebagai berikut:
OH HO O O 2 3 4 5 6 7 8 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ HO atau OH HO O O 2 3 4 5 6 7 8 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ HO B. SARAN
1. Perlu dilakukan analisis struktur lengkap dari flavonoid dengan menggunakan spektroskopi resonansi magnet inti (RMI), spektroskopi massa (MS).
2. Perlu dilakukan analisis flavonoid lebih lanjut pada fase air dengan KLT2A dan spektroskopi UV.
Anonim, 1987, Analisis Obat Tradisional, jilid I, Departemen Kesehatan RI, Jakarta. Anonim, 1987, Materia Medika Indonesia, Ed. II, Departemen Kesehatan RI, Jakarta. Anonim, 2001, Herbal Drugs and Phytopharmaceuticals, Ed. II, 115-117, CRC Press,
Boca Raton, London, New York, Washington, D.C.
Backer, C.A., Van Den Brink, R.C.B, 1963, Flora of Java (Spermatophyta Only), volume I, 943, N.V.P. Noordhoff-Groningen, Netherlands.
Dharma, A.P, 1991, Indonesia Medicinal Plants, 76,77, Balai Pustaka, Jakarta.
Djumidi, Sutjipto,S., Nurhadi, M., Widyastuti, Y., Wahyono, S., dan Prapti, I. Y., 1999, Inventaris Tanaman Obat Indonesia, edisi 5, 147-149, DepKes RI, Jakarta.
Fessenden & Fessenden, 1999, Organic Chemistry, diterjemahkan oleh Aloysius Hadyana, jilid 2, cetakan keempat, 436-438, penerbit Erlangga, Jakarta. Geissman, T.A., 1962, The Chemistry of Flavonoids Compounds, 70, The Mac Millan
Company, New York.
Gritter, R.J., Bobbitt, J.M., Schwarting, A.E., 1991, Introduction to Chromatography, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, Ed. Ii, 43-45, Penerbit ITB, Bandung.
Harborne, 1973, Phytochemical Methods, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro, terbitan II, 10, 11, 47, ITB Bandung.
Mabry, T.J., Markham, K.R., Thomas, M.B., 1970 The Systematical Identification of Flavonoid Compound, 11-55, 165-171, Springer Verlag, New York- Heidelberg-Berlin.
Markham, K.R., 1988, The Techniques of Flavonoid Identification, terjemahan Padmawinata, K., 1-27, 38-51, Penerbit ITB, Bandung.
Sastrohamidjoyo, H., 1985, kromatografi, Ed I, 26-30, Liberty, Indonesia.
Soedibyo, M., 1998, Alam Sumber Kesehatan dan Kegunaan, 168,169, Balai Pustaka, Jakarta.
Stahl, E., 1985, Drugs Analysis by Chromatography and Microscopy: a Practical Supplement to Pharmacopoias, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro, 6,7,16,17, Penerbit ITB, Bandung.
LAMPIRAN 1
LAMPIRAN 2
Foto Hasil Kk Satu-Arah Fase Diam Kertas Whatmann No.1
Foto I. Hasil KK Satu Arah dari Perasan daging Buah Makuta dewa dideteksi dibawah sinar tampak
Foto 2. Hasil KK Satu Arah dari Perasan daging Buah Makuta dewa dideteksi dibawah sinar UV 366 nm
LAMPIRAN 3
Foto Hasil Kk Dua-Arah Fase Diam Kertas Whatmann No.1
Fase Pengembang I (TBA) Dan Fase Pengembang Ii Asam Asetat 15%
Foto 3. Hasil KK Dua Arah dari Fraksi Eter Perasan Daging Buah Makuta dewa dengan Pengembang I (TBA) dan Pengembang II Asam Asetat 15% dideteksi dibawah sinar UV 366 nm
Foto 4. Hasil KK Dua Arah dari Fraksi Eter Perasan Daging Buah makuta dewa dengan Pengembang (TBA) dideteksi dibawah sinar UV 366 nm
LAMPIRAN 4
LAMPIRAN 5
Foto Tanaman Makuta Dewa, Buah Makuta Dewa dan Perasan Daging Buah Makuta Dewa