BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
J. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan…
3. Spesifisitas metode uji an tioksidan…
Nilai RSD yang masih dapat diterima (%) >10 < 2 1-10 < 5 0, 1-1 < 10 <0, 1 < 20 3. Spesifisitas
Selektivitas atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam sampel atau sering juga diartikan spesifisitas adalah kemampuan untuk mengukur yang dituju secara tepat dan spesifik dengan adaya
komponen-komponen lain. Dalam artian metode preparasi sampel tidak boleh hanya
membawa jumlah yang terukur dari sampel tetapi komponen yang bersama-sama
dengan analit tidak boleh mengganggu dalam analisis (Ohanesian et al, 2002).
H. Landasan Teori
Antioksidan merupakan sebutan untuk zat yang berfungsi melindungi tubuh
dari serangan radikal bebas. Yang termasuk ke dalam golongan zat ini antara lain
vitamin, polifenol, karotin dan mineral. Secara alami, zat ini sangat besar peranannya
pada manusia untuk mencegah terjadinya penyakit. Antioksidan melakukan semua ini
Pada tanaman trembesi mengandung flavonoid dan senyawa fenolik yang
kemampuan menangkap radikal bebas. Tanaman trembesi telah digunakan sebagai
pengobatan tradisional di Venezuala dan biji trembesi biasa digunakan sebagai tempe
untuk mengganti kedelai.
Kadar fenolik pada sampel ditentukan oleh kemampuan sampel mereduksi
reagen Folin-Ciocalteu yang mengandung senyawa asam fosfomolibdat-fosfotungstat
berwarna kuning yang akan membentuk senyawa kompleks berwarna biru. Warna ini
dapat diukur intesitasnya dengan spektrofotometri visible.
I. Hipotesis
Fraksi air ekstrak etanol biji trembesi memiliki kandungan senyawa fenolik
yang dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat pergram fraksi air ekstrak etanol
22
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian yang dilakukan termasuk eksperimental dengan rancangan acak
sederhana karena subjek uji diberi perlakuan.
B.Variabel Penelitian
1. Variabel bebas berupa konsentrasi fraksi air ekstrak etanolik biji trembesi.
2. Variabel tergantung berupa aktivitas antioksidan fraksi air ekstrak etanolik biji
trembesi.
3. Variabel pengacau terkendali berupa tempat tumbuh tanaman, waktu pemanenan,
umur tanaman, dan cara panen.
4. Variabel pengacau tidak terkendali berupa cahaya matahari, iklim dan cuaca.
C.Definisi Operasional
1. Ekstrak etanolik biji trembesi adalah sari hasil proses maserasi biji trembesi
dengan penyari etanol 70 %.
2. Fraksi air adalah hasil fraksi ekstrak etanolik biji trembesi dengan menggunakan
air yang telah difraksinasi menggunakan washbensin dan etil asetat.
3. Persen inhibition concentration (%IC ) adalah persen yang menyatakan
kemampuan fraksi air ekstrak etanolik biji trembesi untuk menangkap radikal
4. Inhibition concentration 50 ( IC50) adalah nilai konsentrasi fraksi air ekstrak
etanolik biji trembesi yang menghasilkan penangkapan 50% radikal DPPH.
D. Bahan dan Alat Penelitian 1. Bahan penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: biji trembesi (Sa manea
saman (Jacq.) Merr ) yang terdapat di taman Universitas Sanata Dharma, kampus
III, Paingan (Yogyakarta); akuades (Laboratorium Kimia Analisis Instrumental
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma); bahan kualitas p.a. E. Merck, yaitu:
metanol, bahan kualitas p.a. Sigma Chem. Co., USA, yaitu: DPPH, reagen
Folin-Ciocalteu, asam galat, dan rutin; bahan kualitas teknis Brataco Chemica, yaitu:
wasbensin dan etil asetat; bahan kualitas teknis CV. General Laboratorium, yaitu:
etanol 70%; dan aluminium foil.
2. Alat penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: neraca analitik (Scaltec SBC
22, BP 160P), vacuum rotary evaporator (Junke & Kunkel), waterbath (labo-tech,
Heraeus), vortex (Janke & Kunkel), spektrofotometer UV-Vis (Perkin Elmer Lamda
20), blender, corong Buchner, oven, mikropipet 10-1000 L; 1-10 mL (Acura 825, Socorex), tabung reaksi bertutup, dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di
E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman
Determinasi tanaman trembesi dilakukan di Laboratorium Farmakognosi
Fitokimia, Fakultas Farmasi USD menurut Plantamor dan Ntbg (2013).
2. Pengumpulan bahan
Tanaman trembesi diperoleh dari koleksi tanaman milik Universitas Sanata
Dharma. Pengambilan biji dengan kriteria berwarna hitam.
3. Preparasi sampel
Buah trembesi dikupas dan biji dipisahkan dari daging buahnya kemudian bijinya
dibersihkan dengan air mengalir lalu dikeringkan di bawah sinar matahari dengan
ditutupi kain hitam. Sampel kemudian diblender untuk mengecilkan ukuran partikel.
4. Pembuatan fraksi air
Simplisia yang telah dihaluskan ditimbang sebanyak 30 g dan dituang
kedalam bejana maserasi, ditambah etanol sampai terendam sempurna, dan dicampur
homogen. Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama dua hari. Filtrat diperoleh
melalui penyaringan dengan corong Buchner. Ampas penyaringan diremaserasi
dengan etanol secukupnya selama 2 hari, kemudian disaring. Lalu filtrat diuapkan
pelarutnya hingga diperoleh ekstak etanol biji trembesi.
Ekstrak etanol biji trembesi ditambah 300 mL air hangat dan diekstraksi
cair-cair menggunakan wasbensin dengan perbandingan larutan ekstrak wasbensin (1:1
v/v), kemudian didiamkan hingga terpisah sempurna. Fase air akan berada pada
Dari hasil partisi diperoleh dua fraksi, yaitu fraksi wasbensin dan fraksi air.
Selanjutnya, fraksi air diekstraksi cair-cair lagi menggunakan etil asetat dengan
perbandingan larutan fraksi air-etil asetat (1:1 v/v) sehingga didapatkan fraksi air dan
etil asetat. Setelah dipisahkan fraksi air diuapkan dengan va cum rotary evaporator
hingga didapakan ekstrak kental. Lalu hasil fraksi tersebut digunakan analisis lebih
lanjut.
5. Pembuatan larutan DPPH,pembanding dan uji
a. Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total
Sebanyak 10 mg fraksi air ditimbang, kemudian diencerkan dengan metanol p.a
sampai 10 ml sehingga didapatkan konsentrasi sebesar 1000 g/ml.
b. Pembuatan larutan asam galat
Sebanyak 25 mg asam galat ditimbang dan diencerkan dengan metanol p.a :
aquadest (1μ1) sampai 50 ml sehinggga didapatkan konsentrasi 500 g/ml. Diambil
sebanyak 2; 3; 4; 5; 6 ml larutan tersebut kemudian diencerkan dengan metanol p.a :
aquadest (1:1) hingga 25 ml kemudian akan diperoleh larutan asam galat dengan
konsentrasi 40; 60; 80; 100; 120 g/ml.
c. Pembuatan larutan DPPH
Sejumlah DPPH dilarutkan ke dalam metanol p.a sehingga diperoleh larutan
DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil
dan dibuat selalu baru.
Sebanyak 2,5 mg stok rutin ditimbang dan ditambah metanol p.a hingga 10
ml.
e. Pembuatan larutan seri
Diambil 0,5; 1,0; 1,5; 2, dan 2,5 larutan stok rutin dan diencerkan dengan
metanol p.a hingga 25 mL pada labu ukur, sehingga akan diperoleh larutan dengan
konsentrasi 5; 10; 15; 20; 25 g/ml.
f. Pembuatan larutan uji aktivitas antioksidan dari ekstrak biji trembesi
Sebanyak 25 mg ekstrak ditimbang dan dilarutkan dengan metanol p.a
sampai 25 ml dan didapatkan konsentrasi 1 mg /ml. Dari larutan tersebut diambil
sebanyak 1; 2; 3; 4 dan 5 ml lalu di add dengan metanol p.a hingga 10 ml sehingga
didapat konsentrasi 100; 200; 3000; 400; 500 g/ml.
6. Uji pendahuluan
a. Uji fenolik
Sejumlah 0,5 ml larutan uji 1000 g/ml dan larutan pembanding asam galat
120 g/ml dimasukkan masing-masing dalam tabung reaksi dan ditambah 2,5 ml larutan reagen Folin-Ciocalteu yang diencerkan dengan aquadest (1:10 v/v). Larutan
tersebut kemudian ditambah dengan 7,5 ml natrium bikarbonat 1 M. Setelah 10 menit
warna larutan diamati.
b. Uji pendahuluan aktvitas antioksidan
Sebanyak 1 ml larutan DPPH dimasukkan dalam masing-masing 3 tabung
reaksi. Pada masing-masing tabung reaksi kemudian ditambahakan dengan 1ml
larutan uji konsentrasi 120 µg/ml. Selanjutnya diencerkan dengan 3 ml metanol p.a.
Larutan tersebut divortex 30 detik. Setelah 30 menit diamati perubahan warna yang
terjadi.
7. Optimasi metode penentuan kandungan fenolik total
a. Penentuan OT (Operating Time)
Dibuat larutan baku asam galat konsentrasi 40; 80; dan 120 µg/ml dan
masing-masing larutan diambil 0,5 ml dan ditambah dengan 5 ml reagen
Folin-Ciocalteu yang diencerkan dengan aquadest (1:1). Kemudian larutan tersebut
ditambah dengan 4 mL larutan natrium bikarbonat 1 M. Absorbansinya diukur pada
panjang gelombang 750 nm selama 30 menit. Pengerjaan dilakukan 3 kali replikasi.
Operating time tercapai ketika absorbansi larutan telah stabil.
b. Penentuan panjang gelombang maksimum
Dibuat larutan baku asam galat dengan konsentrasi 40; 80; dan 120 µg/ml
dan masing-masing diambil sebanyak 0,5 ml dan ditambah dengan 5 ml reagen
Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:1) kemudian larutan ditambah 4 ml
larutan natrium karbonat 1M. Didiamkan selama OT kemudian diukur absorbansinya
pada panjang gelombang 600-800 nm.
8. Penetapan kandungan fenolik total
a. Pembuatan kurva baku asam galat
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 40; 60; 80; 100; dan 120 µg/ml
v/v). Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 ml natrium bikarbonat1M. larutan
didiamkan selama OT, absorbansinya dibaca pada panjang gelombang maksimum
terhadap blanko yang terdiri atas akuades : metanol p.a. (1:1), reagen Folin-Ciocalteu,
dan larutan natrium bikarbonat 1M. Pengerjaan dilakukan 3 kali.
b. Validasi metode penetapan kandungan fenolik total
Hasil dari prosedur 10 a divalidasi berdasarkan parameter presisi (%CV),
linieritas (nilai r) serta spesifisitas (spektra kontrol).
c. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji
Diambil 0,5 mL larutan uji 1000 µg/mL, lalu dimasukkan ke dalam labu
ukur 10 ml, dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku
asam galat. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat
(mg ekivalen asam galat per gram fraksi air). Dilakukan 3 kali replikasi.
9. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan
a. Penentuan panjang gelombang maksimum
Pada 3 labu ukur 10 mL, dimasukkan masing- masing 0,4; 1,2; dan 2 ml
larutan DPPH 0,4 mM. Tiap labu ukur tersebut ditambah metanol p.a hingga tanda
batas sehingga didapatkan konsentrasi DPPH sebesar0,016; 0,048; dan 0,080 mM.
Larutan tersebut divortex 30 detik. Larutan kemudian didiamkan selama 30 menit.
Lalu dilakukan pengukuran absorbansinya dengan spektrofotometer visible pada
panjang gelombang antara 400-600 nm.
Sejumlah larutan DPPH 0,4 mM dimasukkan ke dalam labu ukur sebanyak
3 buah berukuran 5 ml.Kemudian masing-masing labu ukur ditambahkan dengan 1
ml larutan pembanding rutin 5; 15; dan 25 µg/ml kemudian ditambah metanol p.a
hingga tanda batas. Larutan tersebut divortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca
absorbansinya dengan spektrofotometri visible pada panjang gelombang hasil
pengukuran selama 1 jam. Perlakuan ini juga dilakukan untuk mencari OT dari
larutan uji fraksi fraksi air pada konsentrasi 100, 300, dan 500 µg/ml.
10. Pengujian aktivitas antioksidan
a. Pengukuran absorbansi larutan kontrol
Pada labu takar 5,0 ml, dimasukkan sebanyak 1,0 ml larutan DPPH 0,4 mM
kemudian ditambah metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut dibaca
absorbansinya pada saat OT dan panjang gelombang serapan maksimum. Pengerjaan
dilakukan sebanyak tiga kali. Larutan ini digunakan sebagai larutan kontrol untuk
menguji larutan pembanding dan larutan uji.
b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji
Sebanyak 1,0 ml larutan DPPH 0,4 mM dimasukkan ke dalam
masing-masing labu ukur 5,0 ml kemudian ditambah dengan 1,0 ml larutan pembandingan 5;
10; 15; 20; 25 g/ml dan larutan uji 100; 200; 300; 400; 500 g/ml. Selanjutnya tambahkan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex
selama 30 detik dan diamkan selama OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan
spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum. Pengerjaan dilakukan
c. Validasi metode uji aktivitas antioksidan
Hasil dari prosedur 7 a dan b divalidasi berdasarkan parameter presisi (%
RSD), linieritas (nilai r) serta spesifisitas (spektra kontrol).
d. Prosedur 8 a dan b kemudian dihitung % IC dan IC50 untuk rutin dan
fraksi air ekstrak etanol biji trembesi.
F. Analisis hasil
Kandungan fenolik total dalam fraksi air ekstrak etanol biji trembesi
dihitung sebagai massa ekivalen asam galat per gram fraksi air. Nilai absorbansi
larutan uji dimasukkan ke dalam persamaan kurva baku asam galat sehingga
diperoleh nilai ekivalensi larutan uji terhadap asam galat. Kemudian dilakukan
perhitungan lebih lanjut berdasarkan rumus di bawah.
Kandungan fenolik total =� �
Aktivitas penangkapan radikal DPPH (% IC) dihitung dengan rumus :
% IC = −
100%
Data aktivitas dianalisis dan dihitung nilai IC50 melalui persamaan
regresi linier dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun larutan
pembanding dan y adalah % IC. Untuk menentukan ada atau tidaknya perbedaan
bermakna antara IC50 antara larutan pembanding dan larutan uji kemudian dilakukan
31
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman dilakukan untuk memastikan bahwa tanaman yang
digunakan dalam penelitin sesuai dengan pustaka dan menghindari kekeliruan dalam
pengambilan bahan penelitian. Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium
Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta,
pada tanggal 4 September 2013 berdasarkan acuan dari Plantamor dan Ntbg (2013).
Hasil ( lampiran 1) determinasi menunjukkan bahwa memang benar tanaman yang
digunakan adalah Samanea saman (Jacq.) Merr.
B. Pengumpulan Bahan
Bahan biji trembesi diperoleh pada tanggal 23 November 2012 dari
tanaman inventaris milik Universitas Sanata Dharma, Kampus III, Paingan,
Yogyakarta. Tanaman yang digunakan merupakan tanaman yang sengaja ditanam
dilingkungan Kampus III, Universitas Sanata Dharma, Paingan, Yogyakarta yang
berfungsi sebagai penyerapan karbon dioksida, suasana menjadi teduh dan asri.
Pemilihan sumber tanaman dengan tumbuhan trembesi didalam lingkungan kampus
Universitas Sanata Dharma dan mudah ditemukan serta dirawat secara khusus
sebagai tanaman taman. Selain itu, spesies tanaman lebih mudah dipastikan karena
Waktu pemanenan yang tepat akan menghasilkan simplisia yang mengandung
bahan yang optimal. Kandungan kimia dalam tumbuhan tidak sama sepanjang waktu.
Kandungan kimia akan mencapai kadar optimum pada waktu tertentu. Ketentuan
pemanenan buah yang baik yakni pada saat buah telah matang. Buah telah matang
dipeti . Kemudian dikupas kulit buahnya dengan pisau kemudian biji dikumpulkan
dan dicuci.
Setelah dilakukan pencucian biji trembesi selanjutnya dilakukan proses
pengeringan. Pengeringan merupakan proses pengawetan simplisia sehingga
simplisia tahan lama dalam penyimpanan. Selain itu pengeringan akan menghindari
penguraian kandungan kimia karena pengaruh enzim. Pengeringan yang cukup akan
mencegah pertumbuhan mikroorganisme atau jamur (kapang). Proses pengeringan
dilakukan sampai diperoleh simplisia kering . Menurut persyaratan OT pengeringan
dilakukan sampai kadar air tidak lebih dari 10% (Agoes, 2007) .
Pengeringan untuk bahan yang akan terekstraksi harus dalam keadaan
terawasi untuk mencegah terjadinya perubahan kimia yang terlalu banyak. Bahan
harus dikeringkan secepat-cepatnya, tanpa menggunakan suhu tinggi, lebih baik
dalam aliran udara yang baik (Harborne,1987).
Biji trembesi yang sudah kering diserbuk halus penyerbukan bertujuan untuk
memperluas permukaan simplisia sehingga proses ekstrasi lebih efektif. Permukaan
yang luas memungkinkan interaksi yang lebih banyak antara simplisia dengan cairan
C.Hasil Ekstraksi
Ekstrak etanolik biji trembesi dibuat dari maserasi serbuk menggunakan
etanol 70% dalam bejana tertutup. Proses dianggap paling tepat karena simpilsia
yang sudah halus memungkinkan untuk direndam dalam cairan penyari sampai
meresap dan melunakkan susunan sel. Hal ini memungkinkan zat-zat yang mudah
larut akan melarut .
Etanol digunakan sebagai cairan penyari karena berapa kelebihan antara lain
tidak beracun, netral dan merupakan pelarut universal artinya baik senyawa polar dan
non polar dapat tersari di dalamnya. Hal ini berkaitan dengan gugus fungsi yang
dimiliki etanol yaitu polar (gugus OH) dan non polar (gugus R), sehingga flavonoid
,saponin dan tannin berdasarkan sifat kepolaran masing-masing dapat tersari dalam
etanol 70%. Etanol 70 % sangat efektif dalam menghasilkan jumlah bahan aktif yang
optimal (Voigt, 1995).
Dalam biji trembesi terkandung berbagai macam senyawa yang beberapa
diantaranya dapat membantu kelarutan senyawa lain (bertindak sebagai co-solvent).
Hal ini dapat menyebabkan hampir semua bahan dapat terekstraksi ke dalam etanol.
Penyari simplisia biji trembesi menggunakan metode maserasi karena metode
ini mempunyai beberapa kelebihan dibandingkan metode ekstraksi yang lain. Metode
ini sangat sederhana, mudah dilakukan dan cepat pelaksanaannya. Maserasi
dilakukan dalam bejana tertutup agar etanol tidak menguap karena etanol mudah
menguap pada suhu kamar. Di samping itu, juga untuk mencegah masuknya
tertentu yang mudah teroksidasi oleh oksigen dari udara seperti fenol yang dapat
teroksidasi sehingga membentuk polimer.
Maserasi dilakukan dalam bejana tertutup dibungkus dengan alumunium foil
agar tidak kena cahaya dan terhindar dari paparan sinar matahari untuk menghindari
penguapan etanol dan menghindari oksidasi terhadap senyawa aktif. Pada penelitian
ini maserasi dilakukan pada serbuk biji trembesi dalam etanol 70% selama 2 hari,
sambil sekali diaduk setiap harinya. Pengadukan penting dilakukan agar sel yang
kontak dengan cairan penyari lebih banyak sehingga difusi senyawa cairan dalam
penyari juga banyak dan penyarian dapat berjalan optimal. Setelah 2 hari dilakukan
penyaringan dengan menggunakan vakum, kemudian dimaserasi kembali
menggunakan etanol 70 % lalu didiamkan selama 2 hari. Filtrat kemudian disaring
dan dicampurkan dengan filtrat sebelumnya.
Penyaringan dilakukan dengan bantuan pompa vakum karena jumlah bahan
yang banyak sehingga akan membutuhkan waktu yang lama jika disaring secara
biasa. Filtrat etanol dapat diendapkan dengan tujuan untuk mengendapkan zat-zat
yang tidak larut etanol, yang ikut lolos dalam proses penyaringan. Ada beberapa zat
tidak larut dalam etanol seperti amilum, lipid, organel-organel sel, zat tersebut dapat
menjadi senyawa pengganggu. Penelitian ini menggunakan serbuk simplisia kering.
Dalam proses penyerbukan kemungkinan dapat terjadi pemecahaan vakuola sel dan
Ekstrak etanol hasil pengendapan selanjut disaring dan maserat
diuapkan menggunakan vaccuum rotary evaporator. Dalam penguapan larutan penyari digunakan vaccuum rotary evaporator dengan tujuan untuk menghindari kontak dengan panas berlebihan yang dapat merusak sebagian komponen senyawa
kimia yang terkandung didalamnya. Tekanan rendah, etanol akan menguap pada suhu
dibawah titih didih normalnya. Penguapan dilakukan sampai tidak menetes lagi
pelarut etanol dalam vaccuum rotary evaporator, diperoleh ekstrak kental (diasumsikan tidak terdapat lagi pelarut etanol). Hasil dari penguapan ini diperoleh
ekstrak etanolik kental biji trembesi, kemudian dihitung persen rendemen. Hal ini
bertujuan untuk mengetahui perbandingan berat ekstrak yang tersari dengan berat
bahan mula-mula. Hasil proses maserasi dari serbuk kering biji trembesi, diperoleh
rendemen ekstrak sebesar 13,9885 g.
D.Hasil Fraksinasi
Dari hasil ekstrak dilakukan partisi ekstrak etanol dengan beberapa pelarut.
Proses partisi sangat diperlukan mengingat senyawa aktif dalam tanaman sangat
bervariasi struktur sesuai dengan golongan dan subsituennya. Perbedaan golongan
dan subsituen inilah yang menyebabkan perbedaan polaritas. Akibatnya kelarutan
senyawa aktif dalam tanaman sulit ditentukan kelarutannya secara umum dan
diperlukaan pelarut bertingkat polaritasnya untuk menekstrasksi senyawa aktif dalam
tanaman. Partisi bertingkat akan memisahkan komponen aktif ke dalam fraksi non
Dalam penelitian ini, fraksi yang diteliti adalah fraksi air. Sebelum fraksi,
ekstrak etanol kental dilarutkan dengan air hangat agar mudah difraksi. Fraksi diawali
dengan pencucian ekstrak dengan washbensin 1:1 untuk mengekstraksi senyawa non
polar seperti lemak, minyak, vitamin dan aglikon flavonoid yang non polar misalnya
aglikon isofalvon dan termetoksilasi (Harborne,1987). Kemudian wasbensin dan
ekstrak menggunakan prinsip ekstraksi cair-cair. Ekstraksi cair-cair prinsip like
dissolve like sehingga zat yang nonpolar akan terbawa dalam pelarut nonpolar dan
pelarut polar akan terbawa dalam pelarut polar. Fraksi air dan fraksi washbensin
akan terpisah dalam corong pisah itu terjadi karena perbedaan berat jenis antar
cairan. Dimana washbensin memiliki berat jenis lebih kecil dibandingkan air,
sehingga akan berada diatas permukaan air. Fase air kemudian diambil dan fase
washbensin dibuang, dan fase air siap difraksi dengan etil asetat.
Dengan menggunakan proses yang sama seperti pada proses diatas
kemudian difraksinasi kembali dengan etil asetat. Fraksi air dan etil asetat dicampur
dengan corong pisah. Etil asetat berada diatas permukaan air karena berat jenis yang
lebih kecil. Senyawa polar yang larut air seperti antosianin, fenolik dan glikosida
akan terbawa dalam fase air sedangkan senyawa yang semipolar larut dalam etil
asetat seperti isoflavon, flavonon dan flonol. Fraksi air yang dihasilkan berupa
cairan. .Fraksi air yang diperoleh diuapkan dengan vacuum rotary evaporator. Fraksi
E.Uji Pendahuluan
Uji pendahuluan bertujuan untuk menentukan ada tidaknya keberadaan suatu
aktivitas antioksidan dan senyawa fenolik dalam fraksi air dengan mereaksikan suatu
sampel uji dengan reaktan tertentu sehingga menunjukkan sifat fisik berupa warna
tertentu sebagai indikator. Uji pendahuluan yang dilakukan disebut juga uji tabung
karena uji kualitatif dilakukan dengan tabung reaksi.
1. Hasil uji kualitatif fenolik
Gambar 2 . Uji kualitatif fenolik. A= asam galat, B= blanko, C= fraksi uji
Uji kualitatif fenolik bertujuan untuk mengetahui kandungan senyawa fenolik
dalam fraksi air ekstrak etanol biji trembesi. Pengujian kualitatif sangat penting
untuk menentukan langkah selanjutnya, yakni uji kuantitatif kandungan senyawa
dengan fraksi air biji trembesi maka akan terjadi perubahan warna menjadi biru.
Intensitas warna biru ditentukan dengan banyaknya kandungan fenolik dalam fraksi
air biji termbesi. Semakin banyak konsentrasi senyawa fenolik dalam fraksi air biji
trembesi maka akan semakin biru yang terlihat. Menurut Singleton dan Rossi
(1965), warna biru yang teramati berbanding lurus dengan konsentrasi ion fenolat
yang terbentuk. Semakin besar konsentrasi senyawa fenolik maka semakin banyak
fenolat yang terbentuk sehingga warna biru yang dihasilkan semakin pekat. Fenolat
hanya terdapat dalam larutan basa, tetapi dengan pereaksi Folin-Ciocalteu dan produk
tidak stabil pada kondisi basa. Penambahan natrium karbonat pada uji fenolik
bertujuan untuk membentuk suasana basa agar terjadi reaksi reduksi Folin-Ciocalteu
oleh gugus hidroksi dari fenolik di dalam fraksi air biji trembesi.
Pengujian ini menggunakan pembanding berupa asam galat dan metanol.
metanol sebagai kontrol negatif dan asam galat sebagai kontrol positif. Hasil yang
diperoleh dari uji kualitatif menunjukkan terjadi perubahan warna menjadi biru tua
dalam fraksi air biji trembesi, setelah ditambahkan reagen Folin Ciocalteu dan