Regenerasi tanaman manggis in vitro dapat dilakukan melaui beberapa tipe regenerasi, yaitu perkecambahan biji, organogeneisis langsung dan organogenesis tidak langsung. Tujuan penelitian adalah mengembangkan tipe regenerasi tanaman yang efesien untuk menunjang pemuliaan mutasi in vitro pada manggis. Eksplan yang digunakan pada perkecambahan berupa biji, sedangkan organogenesis langsung berupa daun. Eksplan ditanam pada media MS (Murashige & Skoog) dengan konsentrasi (0,0; 11,1 ; 22,2 ; 33,3 ; 44,4) µM BAP (Benzilaminopurin). Pada organogenesis tidak langsung, induksi kalus nodular dari daun yang ditanam pada medium MS dengan konsentrasi BAP adalah 2,2 µM dan 4,4 µM, sedangkan konsentrasi TDZ (thidiazuron) adalah 1,14 µM, 2,27 µM, dan 4,54 µM. Kombinasi BAP dan TDZ digunakan sebagai perlakuan. Kalus nodular diregenerasikan membentuk tunas pada medium WPM (Woody Plant Medium) dengan konsentrasi (0,0 ;1,1 ; 2,2 ; 3,3; 4,4) µM BAP.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa medium optimal pembentukan tunas pada perkecambahan biji dan organogenesis langsung adalah medium MS dengan konsentrasi 22,2 µM BAP. Pada organogenesis tidak langsung, medium optimal induksi kalus nodular adalah MS dengan perlakuan kombinasi konsentrasi 2,2 µM BAP dan 2,27 µM TDZ, sedangkan medium optimum regenerasi tanaman pada medium WPM dengan konsentrasi BAP 2,2 µM.
Kata kunci : tunas adventif, perkecambahan biji, organogenesis langsung dan organogenesis tidak langsung
Pendahuluan
Dalam pemuliaan mutasi (mutation breeding) in vitro, tipe regenerasi tanaman yang baku sangat penting dalam upaya memperoleh mutan solid. Mutan solid dapat diperoleh secara langsung jika bahan tanaman yang mendapat perlakuan mutagen berupa kalus, embrio somatik, atau protoplas. Namun demikian, kelemahan bahan tersebut sangat sulit untuk diregenerasikan menjadi tanaman. Untuk mendapatkan mutan solid, dikembangkan tipe regenerasi tanaman dengan urutan prioritas sebagai berikut : (1) organogenesis tidak langs ung (pembentukan tunas melalui kalus nodular), (2) organogenesis langsung (pembentukan tunas langsung dari eksplan daun), (3) perkecambahan biji.
Regenerasi tanaman sangat dipengaruhi oleh pemilihan eksplan, medium yang digunakan, zat pengatur tumbuh dan kondisi lingkungan yang cocok (Hartmann et al., 1997). Pertumbuhan dan morfogenesis tanaman in vitro diregulasi oleh interaksi ekplan dan medium, serta keseimbangan zat pengatur tumbuh yang digunakan (George, 1993). Pada kultur in vitro, zat pengatur tumbuh auksin dan sitokinin sangat penting dalam mengatur arah pertumbuhan dan morfogenesis pembentukan organ tanaman (George, 1993). Beberapa spesies tanaman, tunas adventif dapat diinduksi dengan konsentrasi sitokinin yang tinggi dibandingkan auksin (Phillips et al., 1995).
Pada organogenesis tidak langsung, kalus harus bersifat morfogenik atau kompeten untuk membentuk tunas (George, 1993). Pada manggis, induksi kalus nodular dilakukan pada medium MS yang dilengkapi 2,22 µM TDZ dan 2,25 µM BA menghasilkan 34 % kalus nodular setelah tiga minggu, sedangkan regenerasi tanaman dari kalus nodular dilakukan pada medium WPM yang dilengkapi 0,44
µM BA menghasilkan rata-rata 8,39 tunas setelah tiga minggu (Te-chato & Lim, 2000). Eksplan daun manggis dapat membentuk tunas adventif pada medium WPM pada konsentrasi 5,0 mg l-1 (Goh et al., 1994). Hasil tesebut masih tergolong rendah, sehingga perlu optimasi untuk memperoleh jumlah tunas lebih banyak.
Tujuan penelitian mengembangkan tiga tipe regenerasi tanaman manggis in vitro, yaitu perkecambahan biji, organogenesis langsung dan organogenesis tidak langsung, serta menentukan tipe regenerasi tanaman yang efesien. Hasil penelitian diharapkan tipe regenerasi tanaman yang efisien dapat menunjang pemuliaan mutasi pada tanaman manggis, variasi somaklonal, dan rekayasa genetik maupun untuk perbanyakan tanaman.
Bahan dan Metode Tempat dan Waktu Percobaan
Percobaan dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan dan Molekuler Pusat Kajian Buah-buahan Tropika (PKBT) IPB. Waktu percobaan dilaksanakan Juli 2002 sampai dengan Juni 2003.
Bahan Tanaman
Bahan tanaman berupa buah manggis masak fisiologis berasal dari pohon No.8 (umur > 40 tanun) Kebun Rakyat (milik Ade Sugema) di Wanayasa, Purwakarta. Bahan tanaman untuk perkecambahan manggis tersaji dalam Gambar 5.
Gambar 5. Pohon manggis No. 8 (A), Buah manggis (B).
Penelitian tentang studi regenerasi tanaman manggis in vitro, terdiri dari tiga tipe regenerasi, yaitu (1) Perkecambahan biji manggis in vitro, (2) organogenesis langsung, dan (3) organogenesis tidak langsung (Gambar 6).
Tipe regenerasi Perkecambahan Organogenesis Organogenesis tanaman biji langsung tidak langsung Eksplan biji daun daun
(2,2; 4,4) µ M BAP
Perlakuan (0; 11,1; 22,2; 33,3; 44,4) µM BAP (1,14; 2,27; 4,54) µM TDZ
kalus nodular
(0; 1,1; 2,2; 3,3; 4,4) µM BAP
Planlet tunas adventif
Gambar 6. Skema studi regenerasi tanaman manggis in vitro
Perkecambahan biji manggis in vitro
Biji dibersihkan dari kulit aril dengan sikat, kemudian biji direndam pada larutan Dithane (8 g/l) selama 30 menit dan dibilas dengan air mengalir. Selanjutnya biji direndam pada alkohol 70 % selama 15 menit, lalu direndam pada larutan HgCl (merkuri klorid) 0,1 % selama 20 menit, masing- masing dibilas dengan akuades steril sebanyak tiga kali. Biji dipotong menjadi empat segmen secara vertikal. Eksplan biji ditanam pada botol kultur yang berisi 20 ml medium MS yang dilengkapi 3 % gula pasir, 0,8 % agar, 1,39 µM PVP (Polyvinylpyrolidon) dan perlakuan konsentrasi BAP (0,0; 11,1 ; 22,2 ; 33,3 ; 44,4) µM. Media kultur diatur pada pH 5,7 – 5,8 dengan 0,1 M KOH dan diautoklaf pada temperatur 121 oC dan tekanan 1.1 kg cm2 selama 20 menit. Percobaan ditata dalam RAL (rancangan acak lengkap) terdiri dari lima perlakuan BAP, masing- masing perlakuan diulang 20 kali (botol), setiap botol kultur terdiri dari empat eksplan. Kultur dipelihara pada ruang kultur dengan penyinaran 16 jam terang pada suhu 22 oC. Subkultur dilakukan setiap empat minggu. Pengamatan dilakukan terhadap persentase eksplan membentuk tunas, kalus, akar, panjang tunas, dan waktu pembentukan tunas. Data ditransformasikan dengan x+0.5,
kecuali persentase eksplan membentuk tunas ditransformasikan dengan arcsin x.
Analisis statistik menggunakan uji F dan dilanjutkan dengan uji gugus berganda Duncan. Analisis data me nggunakan program SAS Release 6.12 (SAS Inst., 1996).
Organogenesis langsung
Organogenesis langsung menggunakan eksplan daun muda yang berasal dari bibit berumur tiga bulan (Gambar 7-A). Proses sterilisasi eksplan daun dilakukan dengan membersihkan daun dan merendam eksplan pada alkohol 70 % selama 15 menit kemudian dibilas dengan akuades steril sebanyak tiga kali. Eksplan direndam pada larutan HgCl 0,1 % selama 20 menit lalu dibilas dengan akuades steril sebanyak tiga kali. Eksplan daun muda dipotong berserta tulang daun dengan ukuran (1cm x 1cm), eksplan ditanam di dalam botol kultur berisi 20 ml media MS yang dilengkapi 3 % gula pasir, 0,8 % agar, dan 1,39 µM PVP. Eksplan ditanam dalam posisi
Gambar 7. Bahan tanaman untuk organogenesis langsung. Bibit manggis (A), Ekslan daun dalam posisi abaksial (B)
Perlakuan organogenesis langsung adalah perbedaan konsentrasi BAP, yaitu (0,0; 11,1 ; 22,2 ; 33,3 ; 44,4) µM. Media kultur diatur pada pH 5,7–5,8 dengan 0,1 M KOH dan diautoklaf pada temperatur 121 oC dan tekanan 1.1 kg cm2 selama 20 menit. Percobaan ditata dalam RAL yang diulang 20 kali (botol). Setiap botol kultur terdiri dari empat eksplan. Kultur dipelihara di ruang kultur dengan fotoperiodisitas 16 jam terang dan suhu 22 oC. Subkultur dilakukan setiap empat minggu. Pengamatan dilakukan terhadap persentase eksplan membentuk tunas, jumlah tunas per eksplan, jumlah pasang daun per tunas, waktu pembentukan tunas dan total jumlah tunas per botol. Pengamatan jumlah tunas dikelompokkan menjadi tiga kelompok: tunas yang panjangnya 1-5 mm, tunas yang panjangnya 6-10 mm dan tunas yang panjangnya > 10 mm. Data ditransformasikan dengan x+0.5, kecuali
persentase eksplan membentuk tunas ditransformasik an dengan arcsin x. Analisis
statistik menggunakan uji F dan dilanjutkan dengan uji gugus berganda Duncan. Analisis data menggunakan program SAS Release 6.12 (SAS Inst., 1996).
Organogenesis tidak langsung a. Induksi kalus nodular
Daun muda manggis diambil dari tunas in vitro berasal dari perkecambahan biji. Daun di potong berikut tulang daunnya menjadi empat bagian. Eksplan ditanam
dalam posisi abaksial dalam botol kultur yang berisi 20 ml media MS padat yang dilengkapi dengan 3 % gula pasir, 1,39 µM PVP, 0,8 % agar murni. Zat pengatur tumbuh yang digunakan adalah BAP dengan konsentasi 2,2 µM dan 4,4 µM, sedangkan TDZ dengan konsentrasi 1,14 µM, 2,27 µM, dan 4,54 µM. Kombinasi konsentrasi BAP dan TDZ dijadikan sebagai perlakuan, sehingga terdapat enam kombinasi perlakuan dan diulang 20 kali (botol kultur), setiap botol kultur terdiri dari empat eksplan. Media kultur diatur pada pH 5,7 – 5,8 dengan 0,1 N KOH dan diautoklaf pada temperatur 121 oC dan tekanan 1.1 kg cm2 selama 20 menit. Percobaan ditata dalam RAL. Kultur dipelihara pada penyinaran 16 jam terang dan suhu 22 oC. Subkultur dilakukan setiap empat minggu. Setelah empat minggu dilakukan pengamatan terhadap persentase eksplan membentuk kalus nodular, jumlah kalus nodular per eksplan, bentuk dan warna kalus nodular serta waktu pembentukan kalus nodular.
b. Pembentukan tunas dari kalus nodular
Kalus nodular dari perlakuan kombinasi 2,2 µM BAP dan 2,27 µM TDZ diregenerasikan menjadi planlet dengan menanam kalus nodular pada medium WPM ditambahkan 1,39 µM PVP, 0,8 % agar murni, 3 % gula pasir. Perlakuan pembentukan tunas dari kalus nodular adalah BAP dengan konsentrasi 0,0 µM; 1,1
µM; 2,2 µM; 3,3 µM dan 4,4 µM. Percobaan ditata dalam RAL, perbedaan konsentrasi BAP dijadikan sebagai perlakuan dan diulang 20 kali (botol kultur), masing- masing botol kultur ditanam empat inokulum. Kultur dipelihara pada penyinaran 16 jam terang dan suhu 22 0C. Pengamatan jumlah tunas dikelompokkan menjadi tiga kelompok: tunas yang panjangnya 1-5 mm, tunas yang panjangnya 6-10 mm dan tunas yang panjangnya > 10 mm. Data ditransformasikan dengan x+0.5,
kecuali persentase jumlah kalus nodular yang membentuk tunas ditransformasikan dengan arcsin x. Analisis statistik menggunakan uji F dan dilanjutkan dengan uji
gugus berganda Duncan. Analisis data menggunakan program SAS Release 6.12 (SAS Inst., 1996).
Pengamatan histologi dilakukan pada kalus nodular yang mulai beregenerasi membentuk tunas. Proses pembuatan irisan transversal mengikuti metode parafin (Sass, 1957). Daun disayat menggunakan mikrotom putar (rotary microtom) dengan tebal sayatan 10 µm, kemudian diwarnai dengan safranin 1 % dan fastgreen 0,5 %.
Hasil dan Pembahasan
Tanaman manggis termasuk tanaman tropik yang mengandung senyawa polifenol tinggi. Ketika eksplan biji atau daun dipotong dan ditana m pada medium, maka eksplan mengeluarkan eksudat berupa getah kuning yang mengandung senyawa polifenol sehingga menyebabkan media menjadi hitam (blackening) dan eksplan mengalami pencoklatan (browing) dan akhirnya mati. George & Sherington (1984) mengatakan beberapa spesies tanaman tropik banyak mengandung senyawa polifenol yang tinggi dan akan teroksidasi ketika sel mengalami pelukaan. Lebih lanjut, senyawa polifenol atau tanin dapat menghambat aktivitas enzim pada tanaman sehingga pembentukan tunas me njadi terhambat (George & Sherington, 1984). Untuk mengatasi senyawa fenolik ditambahkan 1,39 µM PVP, hasilnya media menjadi jernih dan eksplan dapat berkembang dengan baik menjadi tunas. Penggunaan PVP dalam kultur jaringan sebagai absorpsi senyawa polifenol atau tanin melalui ikatan hidrogen sehingga mencegah proses oksidasi (George & Sherington, 1984). Selain itu, PVP juga dapat meningkatkan regenerasi tanaman pada kultur anter Datura innoxia (Tyagi et al., 1981 cit. George & Sherington, 1984). Ada cara lain untuk mengatasi senyawa polifenol, yaitu dengan penambahkan 3 g/l arang aktif (activated charcoal) pada medium (George & Sherington, 1984).
Tingkat kontaminasi kultur berkisar antara 5 % – 15 %. Kontaminasi kultur disebabkan oleh jamur dan bakteri. Hal ini disebabkan oleh proses sterilisasi eksplan yang kurang sempurna, sehingga menyebabkan mikroorganisma terbawa dalam kultur. Pada saat subkultur dan pemisahan tunas dari eksplan kecenderungan kultur mengalami kontaminasi. Oleh karena, pada kondisi ini dilakukan sangat hati- hati sekali.
Pengaruh BAP terhadap pembentukan tunas manggis in vitro
Tidak semua segmen biji yang ditanam pada media MS mengalami proliferasi membentuk tunas atau kalus. Bakal tunas muncul dari permukaan biji, seperti tersaji dalam Gambar 8-A. Eksplan yang tidak responsif terhadap perlakuan BAP mengalami pencoklatan (browning) dan mati. Tunas yang muncul dari permukaan biji berbentuk multipel. Contoh tunas multipel perlakuan 22,2 µM BAP dapat tersaji pada Gambar 8-B.
Gambar 8. Bakal tunas adventif mulai muncul dari permukaan biji (tanda panah) (A); tunas multipel berasal dari perlakuan 22,2 µM BAP (B)
Berdasarkan analisis varians setiap perlakuan BAP menunjukkan berbeda nyata pada semua variabel yang diamati (Lampiran 3).
Gambar 9 menunjukkan bahwa persentase pembentukan tunas bervariasi antara 4,41 % - 53,75 %. Persentase pembentukan tunas paling tinggi terdapat pada perlakuan konsentrasi BAP 22,2 µM (53,75 %), sedangkan yang paling rendah pada perlakuan BAP 0,0 µM (4,41 %). Begitu juga, rata-rata jumlah tunas paling banyak terdapat pada perlakuan BAP pada konsentrasi 22,2 µM (3,25 tunas) dan paling sedikit pada perlakuan 0,0 µM BAP (tanpa BAP) (0,23 tunas). Jumlah tunas per eksplan dapat mencapai 25 tunas. Biasanya jumlah tunas tersebut berkaitan erat dengan persentase kultur yang membentuk tunas. Pada umumnya, persentase kultur
yang membentuk tunas dan jumlah tunas paling tinggi terdapat pada perlakuan 22,2 µM BAP (Gambar 10). 0 10 20 30 40 50 60 0 11,1 22,2 33,3 44,4 Konsentrasi BAP Pembentukan tunas (%)
Gambar 9. Pengaruh konsentrasi BAP terhadap persentase pembentukan tunas pada perkecambahan manggis dalam media MS setelah tiga minggu kultur
Keterangan : Nilai rata-rata yang diikuti oleh huruf yang sama pada diagram batang menunjukkan tidak berbeda nyata berdasarkan uji gugus berganda Duncan pada taraf 5 %.
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 0 11,1 22,2 33,3 44,4 Konsentrasi BAP
jumlah tunas per eksplan
Gambar 10. Pengaruh konsentrasi BAP terhadap jumlah tunas per eksplan pada perkecambahan manggis dalam media MS setelah tiga minggu kultur
Keterangan : Nilai rata-rata yang diikuti oleh huruf yang sama pada diagram batang menunjukkan tidak berbeda nyata berdasarkan uji gugus berganda Duncan pada taraf 5 %.
4,4 c 31,2 b 53,7 a 26,2 b 19,4 bc (µM) (µM) 0,2 c 1,2 b 3,3 a 1,2 b 0,8 bc
Waktu pembentukan tunas bervariasi rata-rata antara 17 – 25 hari setelah kultur. Waktu yang paling cepat kultur mulai membentuk tunas terdapat pada perlakuan 22,5
µM BAP (17,28 hari), sedangkan waktu yang paling lama pembentukan tunas terdapat pada perlakuan BAP 44,4 µM (25,33 hari) (Gambar 11).
Berdasarkan uji gugus berganda Duncan, jumlah tunas per eksplan pada perlakuan 22,2 µM BAP berbeda nyata dengan perlakuan la innya (Gambar 11). Panjang tunas berkaitan pula dengan jumlah tunas yang terbentuk. Perlakuan 22,2
µM BAP menunjukkan panjang tunas paling tinggi rata-rata 1,7 cm, sedangkan paling rendah pada perlakuan 0,0 µM BAP dengan rata-rata 0,2 cm. Perbedaan nilai rata-rata tersebut didukung oleh hasil uji gugus berganda Duncan yang menunjukkan berbeda nyata antara perlakuan (Gambar 12).
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 0 11,1 22,2 33,3 44,4 Konsentrasi BAP W a k tu p e m b e n tu k a n t u n a s ( h a ri )
Gambar 11. Pengaruh konsentrasi BAP terhadap waktu pembentukan tunas pada perkecambahan manggis dalam media MS setelah tiga minggu kultur
Keterangan : Nilai rata-rata yang diikuti oleh huruf yang sama pada diagram batang menunjukkan tidak berbeda nyata berdasarkan uji gugus berganda Duncan pada taraf 5 %.
19,0 b 18,7 b
17,3 b
23,6 a 25,3 a
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 0 11,1 22,2 33,3 44,4 Konsentrasi BAP Panjang tunas (cm) Gambar 12. Pengaruh konsentrasi BAP terhadap panjang tunas pada
perkecambahan manggis dalam media MS setelah tiga minggu kultur
Keterangan : Nilai rata-rata yang diikuti oleh huruf yang sama pada diagram batang menunjukkan tidak berbeda nyata berdasarkan uji gugus berganda Duncan pada taraf 5 %.
Pada eksplan biji, media MS tanpa BAP kurang menstimulasi proliferasi tunas. Hal tersebut menunjukkan bahwa pengaruh BAP sangat besar dalam merangsang pembentukan tunas. Seperti diungkapkan oleh Normah et al. (1990), penggunaan media MS pada manggis dengan konsentrasi 40 µm BAP pada tanpa NAA menghasilkan lebih banyak tunas (6,5 tunas), sedangkan penggunaan NAA saja tidak dapat merangsang pembentukan tunas (Goh et al., 1988). Pada manggis, perlakuan biji yang dipotong menjadi enam lebih banyak menghasilkan tunas jika dibandingkan dipotong tiga, selain itu fotoperiodisitas 8 jam lebih baik dari 12 jam dalam merangsang pembentukan tunas adventif (Normah et al., 1990). Harahap (2005) menyatakan eksplan biji pada perlakuan 5 ppm BAP menghasilkan 91,43 % tunas dan jumlah tunas tertinggi rata-rata 8,71 tunas per eksplan pada 12 minggu setelah tanam. Embrio biji manggis kemungkinan terdapat di sepanjang permukaan biji (Yacob & Tindall, 1995), sehingga biji manggis bersifat poliembrioni (Richards, 1990a). 0,2 c 1,6 a 1,7 a 1,1 ab 0,6 bc (µM)
Kultur yang membentuk akar hanya pada konsentrasi 11,1 µM BAP (0,6 %), dan 22,2 µM BAP (0,2 %), sedangkan kultur pada konsentrasi 0,0 µM BAP, 33,3
µM BAP dan 44,4 µM BAP tidak terbentuk akar. Akar yang terbentuk biasanya dari segmen biji bagian ujung, karena memang secara alami sudah terdapat primordia akar dan biasanya tidak terbentuk tunas, sedangkan segmen biji yang membentuk tunas tidak membentuk akar. Goh et al. (1988) menyatakan segmen kotiledon manggis membentuk akar hanya 7 % pada medium 4,4 µM BAP dan 5,3 µM NAA. Harahap (2005) menyatakan eksplan membentuk akar pada media MS ½ N + IBA 3mg/l + NAA 4 mg/l menghasilkan 85 % dengan jumlah akar 1,05 dan panjang akar 1,49 cm.
Kalus hanya terbentuk pada segmen biji pada medium yang diberi perlakuan BAP. Persentase kultur yang membentuk kalus paling tinggi pada perlakuan 22,2 µM BAP (12,5 %), sedangkan kultur pada perlakuan 0,0 µM BAP tidak terbentuk kalus. Kalus muncul dari bagian segmen biji bekas pelukaan, kalus berwarna putih, strukturnya sangat remah, rapuh dan cepat mengering. Kalus pernah disubkultur pada medium yang sama kecenderungan mengering. Hal tersebut sesuai dengan pendapat Normah et al. (1990), kalus yang terbentuk dari segmen biji pada medium MS dengan konsentrasi 90,5 - 135,7 µM 2,4-D tidak dapat berorganogenesis.
Organogenesis langsung
Eksplan daun yang responsif terhadap medium mulai na mpak membentuk bakal tunas setelah 12 minggu. Pada medium tanpa BAP (0,0 µM) eksplan tidak mengalami pertumbuhan, berwarna coklat dan mengering. Eksplan yang responsif pada media memperlihatkan kondisi eksplan daun tetap hijau dan berproliferasi membentuk tunas adventif. Tunas adventif muncul dari tulang daun yang mengalami pelukaan (Gambar 13-A). Pembentukan tunas dari tulang daun terjadi juga pada tanaman lain, seperti pistasia (Barghchi & Alderson, 1983) dan apel (Liu et al., 1983). Menurut Goh et al. (1994), BAP yang terdapat di dalam medium dapat diserap oleh jaringan daun manggis melalui pelukaan, sehingga dapat merangsang
pembentukan tunas. Sedangkan daun manggis yang utuh tidak dapat membentuk tunas pada medium yang mengandung BAP. Ternyata pelukaan dapat menyebabkan kontak jaringan meristematis pada berkas pembuluh dengan medium yang mengandung BAP sehingga mengakibatkan jaringan meristem tersebut mengalami diferensiasi membentuk tunas adventif.
Gambar 13. Bakal tunas muncul dari tulang daun (A). Tunas adventif dari perlakuan 22,2 µM BAP (B)
Analisis varian menunjukkan bahwa perlakuan BAP berbeda nyata untuk semua variabel yang diamati pada taraf 5 % (Lampiran 4), artinya perlakuan BAP berpengaruh nyata terhadap pembentukan tunas. Selanjutnya analisis statistik dilanjutkan dengan uji gugus berganda Duncan pada taraf 5 %..
Gambar 14 menunjukkan bahwa pengaruh konsentrasi BAP terhadap persentase pembentukan tunas bervariasi antara 0,0 – 39,8 %. Pada konsentrasi 22,2
µM BAP, persentase eksplan membentuk tunas paling tinggi (39,8 %), sedangkan pada perlakuan 0,0 µM BAP, eksplan daun mengalami pencoklatan dan selanjutnya mengering. Pada konsentrasi 22,2 µM BAP sangat baik digunakan untuk pembentukan tunas dibandingkan perlakuan lain. Pembentukan tunas tersebut tergolong masih rendah. Hal ini menunjukkan bahwa daun manggis termasuk tanaman yang sulit berorganogenesis. Seperti diungkapkan oleh Goh et al .(1988), kebanyakan daun tanaman berkayu mengalami kesulitan dalam organogenesis langsung membentuk tunas. Hal sama juga dijumpai pada apel (Liu et al., 1983),
A
B
mulberry (Mhatre et al., 1985), pistasia (Barghchi & Alderson, 1983). Ekspan daun manggis yang berwarna kehijauan persentasenya sangat rendah menghasilkan tunas dan kalus yang tidak dapat berorganogenesis.
Gambar 15 menunjukkan bahwa pengaruh konsentrasi BAP terhadap jumlah tunas per eksplan bervariasi rata-rata antara 0,0 – 1,3 tunas. Pada konsentrasi 22,2
µM BAP ditemukan jumlah tunas maksimum per eksplan tiga tunas, kebanyakan jumlah tunas per eksplan hanya satu atau dua tunas. Pada konsentrasi 33,3 µM BAP jumlah tunas per eksplan rata-rata hanya 0,6 tunas (Gambar 15).
0 10 20 30 40 50 11,1 22,2 33,3 44,4 Konsentrasi BAP
Eksplan membentuk tunas (%)
Gambar 14. Pengaruh konsentrasi BAP terhadap pembent ukan tunas pada organogenesis langsung dalam media MS setelah 16 minggu kultur
Keterangan : Nilai rata-rata yang diikuti oleh huruf yang sama pada diagram batang menunjukkan tidak berbeda nyata berdasarkan uji gugus berganda Duncan pada taraf 5 %.
22,4 ab
39,8 a
20,0 b 21,3 b
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 11,1 22,2 33,3 44,4 Konsentrasi BAP
Jumlah tunas per eksplan
Gambar 15. Pengaruh konsentrasi BAP terhadap jumlah tunas per eksplan pada organogenesis langsung dalam media MS setelah 16 minggu kultur
Keterangan : Nilai rata-rata yang diikuti oleh huruf yang sama pada diagram batang menunjukkan tidak berbeda nyata berdasarkan uji gugus berganda Duncan pada taraf 5 %.
0 20 40 60 80 100 120 11,1 22,2 33,3 44,4 Konsentrasi BAP
Waktu membentuk tunas (hari)
Gambar 16. Pengaruh konsentrasi BAP terhadap waktu pembentukan tunas pada organogenesis langsung dalam media MS setelah 16 minggu kultur
Keterangan : Nilai rata-rata yang diikuti oleh huruf yang sama pada diagram batang menunjukkan tidak berbeda nyata berdasarkan uji gugus berganda Duncan pada taraf 5 %.
Gambar 16 menunjukkan bahwa waktu pembentukan tunas sangat lambat sekali berkisar 60–110 hari. Pada konsentrasi 22,2 µM BAP waktu membentuk tunas rata-rata 80,7 hari dan yang paling lama pada konsentrasi 33,3 µM BAP rata-rata
1,1 a 1,3 a 0,6 a 0,8 a (µM) 98,6 ab 80,7 b 109,4 a 105,0 a (µM)
109,4 hari. Hal ini disebabkan karena pada manggis proses pembelahan sel secara alami sangat lambat, sehingga menyebabkan laju pertumbuhan tanaman sangat lambat (Wiebel, 1993). Eksplan yang berasal dari tahap juvenil lebih mudah membentuk organ pada kultur in vitro dan lebih cepat menghasilkan tunas (3-4 minggu) dibandingkan dari pohon dewasa (9 minggu) (Goh et al., 1990). Hal ini, mungkin disebabkan oleh level zat pengatur tumbuh endogen pada tanaman (Goh et al., 1990).
Rata-rata jumlah pasang daun yang paling tinggi terdapat pada perlakuan konsentrasi 22,2 µM BAP rata-rata 1,2 pasang daun, sedangkan yang paling rendah pada perlakuan 44,4 µM BAP rata-rata 0,6 pasang daun. Jumlah tunas yang panjangnya 1-5 mm paling tinggi terdapat pada perlakuan 22,2 µM BAP rata-rata 1,3. Begitupun juga untuk jumlah tunas yang panjangnya 6-10 mm dan > 10 mm masing- masing 0,8 dan 0,3. Sedangkan jumlah tunas yang panjangnya 1-5 mm yang paling rendah terdapat perlakuan 11,1 µM BAP, begitu juga jumlah panjang tunas 6- 10 mm dan > 10 mm terdapat pada perlakuan 44,4 µM BAP (Tabel 4).
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 11,1 22,2 33,3 44,4 Konsentrasi BAP
Jumlah pasang daun
Gambar 17. Pengaruh konsentrasi BAP terhadap jumlah pasang daun pada organogenesis langsung dalam media MS setelah 16 minggu kultur
Keterangan : Nilai rata-rata yang diikuti oleh huruf yang sama pada diagram batang menunjukkan tidak berbeda nyata berdasarkan uji gugus berganda Duncan pada taraf 5 %.
0,7 b
1,2 a
0,6 b 0,6 b
Tabel 4. Nilai rata-rata dan hasil uji gugus berganda Duncan pada jumlah tunas pada organogenesis langsung dalam media MS setelah 16 minggu kultur
Jumlah tunas yang panjangnya Perlakuan BAP (µM ) Jumlah kultur 1-5 mm 6-10 mm >10 mm total/botol 11,1 19 0,4 b 0,6 a 0,1 b 1,1 22,2 19 1,3 a 0,8 a 0,3 a 2,4 33,3 20 0,5 b 0,4 ab 0,2 ab 1,1 44,4 20 0,8 ab 0,4 ab 0,1 b 1,3
Keterangan :Nilai yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata dengan uji gugus berganda Duncan pada taraf 5 %.
Goh et al. (1988) menyatakan pembentukan tunas dipengaruhi oleh ukuran dan sumber eksplan. Eksplan daun utuh tidak menghasilkan tunas, sedangkan daun yang dibagi menjadi dua menghasilkan tunas lebih banyak, bahkan ukuran eksplan mencapai 3 mm menghasilkan jumlah tunas lebih banyak (Goh et al., 1994). Sumber eksplan dari lapangan mempunyai kemampuan organogenik lebih tinggi dibandingkan dari tunas in vitro (Goh et al., 1994). Lebih lanjut, pembentukan bakal tunas dari eksplan daun dipengaruhi oleh pelukaan pada daun dan konsentrasi BA di