Daun
Memasukkan 200µL Protein Precipititation
Solution, selanjutnya disentrifuse, kemudian supernatant
diambil dan dimasukkan ke dalam microtube baru dan ditambahkan 600 µL isopropanol dan disentrifuse kembali
ELEKTROFORESIS
Gambar 7. Ekstraksi DNA pada daun jati dengan menggunakan metode Promega
DNA hasil ekstraksi yang telah dielektroforesis kemudian diwarnai dengan menggunakan larutan Ethidium Bromide (EtBr) selama kurang lebih 15 menit. Keberadaan pita DNA dapat dilihat dengan menggunakan alat ultraviolet transilluminator.
2. Ekstraksi DNA dari Kayu
Prosedur yang dilakukan dalam proses ekstraksi DNA kayu jati digunakan menggunakan metode Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB). Susunan buffer CTAB terdapat pada Lampiran 8. Prosedur ekstraksi DNA kayu jati berdasarkan metode Promega adalah sama seperti dengan prosedur ekstraksi DNA dari daun. Rincian tahapan ekstraksi DNA kayu jati berdasarkan metode CTAB dapat dilihat pada Gambar 8.
Sama halnya pada sampel daun, DNA hasil ekstraksi yang telah dielektroforesis diwarnai dengan menggunakan larutan Ethidium Bromide (EtBr) selama kurang lebih 15 menit. Keberadaan pita DNA dapat dilihat dengan menggunakan alat ultraviolet transilluminator.
DNA
DNA
Memasukkan 60 µL Etanol (di ulang sebanyak 2 kali)
Melakukan pengikatan DNA dengan cara menambahkan 100 µL DNA Rehydration Solution kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu 65°C
Melakukan uji kualitas DNA
DNA
Daun jati digerus lalu di vortex dan diinkubasi selama 1 jam di dalam waterbath
ELEKTROFORESIS
Gambar 8. Ekstraksi DNA pada kayu jati dengan menggunakan Metode CTAB
3. Seleksi Primer
Primer adalah rantai pendek DNA yang dihasilkan secara buatan biasanya terdiri antara 10-25 basa nukleotida (Finkeldey, 2005). Primer berfungsi sebagai titik awal terjadinya proses amplifikasi DNA. Sepasang primer yang sekuen targetnya ada pada rantai DNA nantinya digunakan dalam proses PCR. Segmen DNA diantara kedua titik pertemuan primer akan diamplifikasi dalam reaksi PCR. Primer berfungsi sebagai titik awal sintesis DNA oleh enzim Taq polymerase
yang diperoleh dari bakteri Thermus aquaticus. Enzim ini juga dikenal dengan
Taq DNA Polymerase. Enzim ini sesuai untuk proses amplifikasi karena dapat
bertahan pada suhu tinggi sampai 95ºC meskipun suhu optimum bagi aktifitas enzim adalah 72ºC.
Serbuk kayu selanjutnya digerus dan divortex, lalu diinkubasi selama 1 jam (dalam keadaan dishaker
secara terus menerus)
Tube yang berisi serbuk kayu selanjutnya ditambahkan Chloroform IAA sebanyak 300 µL dan larutan Fenol 20 µL, lalu disentrifuse dan diulang kembali (2 kali)
Tube kemudian ditambahkan larutan NaCl 300 µL dan Isopropanol dingin 500 µL
DNA Tube selanjutnya ditambahkan larutan Etanol 300
µL, kegiatan ini dilakukan sebanyak 2 kali
DNA Dilakukan uji kualitas DNA
Posisi Sampel
Kayu jati dibor dalam keadaan steril (ruang khusus) lalu diambil 3 bagian (gubal, transisi dan teras )pada setiap contoh uji kayu
Masing-masing bagian dari contoh uji diambil serbuk kayunya sebanyak 0,2 gram dan dimasukkan ke dalam tube
Pada penelitian ini dilakukan seleksi primer (screening primer) terhadap 30 primer produksi dari Operon Technology yaitu primer dari golongan OPO dan OPY. Primer dari golongan OPO yang digunakan untuk seleksi primer adalah primer yang memiliki kode O.1, O.2, O.4, O.5, O.6, O.7, O.8, O.9, O.10, O.11, O.12, O.13, O.14, O.15, O.16, O.18, O.19 dan O.20. Sedangkan primer dari golongan OPY yang digunakan dalam seleksi primer adalah dari golongan Y.2, Y.3, Y.6, Y.8, Y.9, Y. 11, Y.12, Y.13, Y.14, Y.15, Y.16 dan Y.17.
4. Amplifikasi DNA melalui RAPD
DNA hasil ekstraksi baik daun dan kayu diamplifikasi dengan menggunakan mesin PCR dengan teknik RAPD. DNA yang akan digunakan sebelumnya dilakukan pengenceran terlebih dahulu, dengan tujuan untuk menghindari hablurnya pita DNA pada saat elektroforesis. Pengenceran dilakukan dengan mengambil DNA tersebut sebanyak 1 uL dan ditambahkan 99 uL H2O
yang telah diautoklaf (aquabidest). Namun besarnya perbandingan antara DNA dengan aquabidest tergantung dari tebal tipisnya DNA genomik hasil ekstraksi.
Proses amplifikasi DNA (RAPD), pada intinya adalah proses perbanyakan DNA secara enzimatis. Pada tahap ini terdapat tiga proses, yaitu (1) proses denaturasi DNA pada suhu 950 C, (2) proses penempelan DNA (annealing) dan (3) proses ekstensi. Pada suhu tinggi pita ganda tersebut berpisah menjadi dua utas tunggal. Apabila pita ganda DNA telah terpisah, maka pada tahap kedua terjadi penempelan primer pada kedua ujung DNA sebagai titik awal pembacaan dan perbanyakan basa-basa DNA. Selanjutnya dilakukan proses pemanjangan dan pembentukan utas DNA yang baru (ekstensi). Adapun bahan-bahan yang dicampurkan dalam satu microtube pada proses amplifikasi RAPD disajikan pada Tabel 3.
Tabel 3. Komposisi Bahan dalam Proses Amplifikasi RAPD
No Bahan Kimia 1 x Reaksi
1 H2O 2.0 uL
2 Enzim Taq DNA polymerase 7.5 uL
3 Primer oligonukleid 1.2 uL
Proses PCR dilakukan dengan menggunakan primer hasil seleksi. Hasil proses PCR kemudian dianalisis dengan melakukan elektroforesis yaitu menggunakan 2 % gel agarose dalam larutan buffer 1x TAE dan distaining di dalam Ethidium Bromide. Pengaturan suhu pada mesin PTC-100 untuk proses RAPD didasarkan pada penelitian Parthiban et al. (2001) dalam ITTO (2003) seperti yang disajikan dalam Tabel 4.
Tabel 4. Tahapan-tahapan suhu dalam proses RAPD
Tahapan Suhu Waktu Jumlah Siklus
Initial denaturation 95°C 15 menit 1 Denaturation 95°C 1 menit 45 Annealing 36°C 1 menit 45 Extension 72°C 2 menit 45
Final Extension 72°C 10 menit 1
Stand By 4°C infinity
Sumber : Parthiban et al. (2001) dalam (ITTO, 2003)
Analisis Data 1. Analisis Variasi Genetik
Hasil elektroforesis akan menunjukkan beberapa pita atau band. Sebelum melakukan analisis diperlukan data scoring dari pita yang muncul pada setiap lokus. Scoring dimulai dari lokus yang paling atas yaitu DNA yang memiliki berat molekul paling ringan. Pita yang muncul diberi nilai 1 (satu) dan pola pita yang tidak muncul diberi tanda 0 (nol) seperti disajikan dalam Gambar 9. Hasil scoring
kemudian dianalisis dengan menggunakan software POPGENE versi 3.2 dan NTSYS 2.02 (Rohlf , 1998).
Lokus Individu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 L-1 L-2 L-3 L-4 Lokus Individu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 L-1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 L-2 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 L-3 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 1 L-4 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1
Gambar 9. Cara penilaian pita dengan sistem skoring (1 = ada pita, 0 = tidak ada pita)
Parameter genetik yang diukur dalam penelitian ini adalah variasi genetik di dalam populasi dan antar populasi. Untuk keragaman genetik di dalam populasi parameter yang diukur adalah :
1. Persentase Lokus Polimorfik (PLP) = ((N(LP)/((N(LP) +(N(LM))) x 100% Keterangan :
N(LP) : jumlah lokus polimorfik N(LM) : jumlah lokus monomorfik
2. Jumlah alel yang diamati (na) = jumlah semua lokus/jumlah lokus yang diamati 3. Jumlah alel yang efektif (ne) = 1 / Σ(jumlah frekuensi alel (p))2
4. Heterozigitas harapan (He) = 1- Σ(jumlah frekuensi alel (p))2
Sedangkan parameter yang diamati untuk keragaman genetik antar populasi digunakan cluster analysis untuk menduga ada tidaknya hubungan kekerabatan berdasarkan jarak genetik yang diperoleh.
2. Analisis Fragmen pada Kayu
Hasil analisis pada kayu nantinya dipakai untuk menduga berapa besar DNA yang ada serta tingkat degradasi DNA pada kayu tersebut. Contoh ilustrasi analisis fragmen DNA pada kayu jati disajikan pada Tabel 5.
Tabel 5. Fragmen dominan secara manual dan hasil tabulasi
Fragmen Ukuran Basa (bp) Kontrol (Daun) S1 S2 S3 S4 1 100 - - 2 300 x - 3 500 - x 4 1000 - x 5 1500 - x 6 2000 x x 7 2500 - x Total 5400 1900 400 % Fragmen 100% 400 X 100 % 1900
Keterangan = S1-S4 : Sampel kayu no 1 sampai no 4 - : DNA yang muncul band atau pitanya X : DNA yang tidak muncul band atau pitanya
80x
10x 100x
20x
