BAB III METODE PENELITIAN
D. Cara Kerja
2. Tahap Pelaksanaan
a. Sterilisasi Alat dan Media
Sebelum melakukan penelitian, semua alat yang akan digunakan disterilisasi menggunakan autoklaf dan setelah disterilisasi alat tersebut diletakkan dalam oven atau refgenerator. Hal ini dimaksudkan agar alat yang akan digunakan tidak terkontamisasi dengan bakteri atau mikroorganisme lain. Sterilisasi alat dengan autoklaf dilakukan pada tekanan 1 atm, suhu 1210C selama 15 menit. Untuk bahan yang akan digunakan seperti daun Keji Beling dapat dicuci hingga bersih kemudian direndam dengan
natrium karbonat selama 15 menit setelah itu dibilas dengan aquades. Sedangkan untuk sterilisasi media dapat dilakukan menggunakan autoklaf selama 10 menit. Untuk alat yang tidak tahan panas dapat dilakukan sterilisasi menggunakan alkohol atau pembakaran di atas api bunsen (Jutono dkk, 1980).
b. Pembuatan Ekstrak Daun Keji Beling
Dalam pengambilan sampel tidak diperlukan penanganan khusus karena bahan yang digunakan hanya daun yang sudah tua (berwarna hijau tua). Daun Keji Beling dipetik satu persatu secara manual dan dicuci bersih menggunakan air mengalir kemudian dipisahkan antara daun yang baik dan yang rusak. Kriteria baik adalah daun segar, daun berwarna hijau tua pada bagian atas permukaan dan berwarna hijau muda pada bagian bawah permukaan dan tidak terdapat bercak, Sedangkan kriteria rusak adalah daun layu, terdapat bercak pada bagian permukaan daun dan diserang hama. Daun Keji Beling dengan kriteria baik disterilkan secara kimia. Sterilisasi dilakukan dengan melarutkan 10 ml Natrium hipoklorit dalam 3 liter aquades dan merendam daun selama 15 menit, kemudian dibilas dengan menggunakan aquades.
Ekstrak Keji Beling diperoleh dengan melakukan metode ekstraksi dimana sampel ditimbang, untuk pembuatan ekstrak 10% digunakan daun Keji Beling sebanyak 3,5 gr yang ditambahkan
aqudes sebanyak 35 ml. Sedangkan konsentrasi 25% digunakan daun Keji Beling sebanyak 5 gr yang ditambahkan aquades sebanyak 12,5 ml. Konsentrasi 50% daun Keji Beling yang digunakan sebanyak 6 gr yang ditambahkan aquades sebanyak 12 ml. Untuk konsentrasi 75% daun Keji Beling dibutuhkan sebanyak 9 gr yang ditambahkan 13,5 ml, dan konsentrasi terakhir yaitu 100% digunakan daun Keji Beling sebanyak 10 gr yang ditambahkan aquades sebanyak 10 ml. Permukaan daun diperkecil dengan cara dipotong menjadi kecil secara manual menggunakan tangan dan direbus dengan aquades steril dalam erlenmeyer hingga mendidih.
Pembuatan stok ekstrak yang digunakan untuk penelitian dapat dilihat dalam tabel di bawah ini:
Tabel 3.1 Pembuatan Ekstrak Daun yang Digunakan Untuk Stok Konsentrasi Ekstrak
Konsentrasi (%) Daun Keji Beling (gr) Aquades (ml)
10 3,5 35
25 5 12,5
50 6 12
75 9 13,5
Berikut adalah dokumentasi pembuatan ekstrak daun Keji Beling (Strobilanthes crispa Bl.) :
(a) (b)
Gambar 3.1 Konsentrasi Ekstrak Daun (a) & Sterilisasi Daun dengan Natrium Hipoklorit (b)
c. Pembuatan Media Uji Nutrient Agar (NA)
Pembuatan media uji Nutrient Agar (NA) dilakukan sesuai dengan takaran pada kemasan yaitu dengan mencampurkan 2 gram NA dalam 100 ml aquades kemudian dipanaskan dengan Hot Plate Stirrer. Pengadukan dilakukan dengan magnetic strirrer. Media
NA bisa diangkat apabila sudah berwarna jernih. Selanjutnya media harus disterilkan dengan autoklaf. Media NA pada cawan petri yang digunakan untuk menguji aktivitas antibakteri berisi masing-masing 10 ml. Sedangkan media pada agar miring untuk meremajakan bakteri biakan murni yang digunakan sebagai media kultur bakteri masing-masing 5 ml (Maria, 2011).
d. Penyiapan Mikroorganisme Uji
Pada mikroorganisme uji yang diperoleh dilakukan perbanyakan kultur murni. Kultur murni diambil menggunakan jarum ose, kemudian digoreskan pada media agar miring secara aseptis. Setelah itu dilakukan inkubasi selama 24 jam pada suhu 37,50C (Misnadiarly, Husjain. 2014). Sebelum digunakan untuk menguji potensi daya hambat dari ekstrak daun Keji Beling, dilakukan pengenceran bertingkat pada kultur bakteri untuk mengendalikan populasi bakteri. Satu ose biakan murni disuspensikan dengan 10 ml aquades steril pada tabung reaksi. Tabung kedua berisi 9 ml aquades steril dan 1 ml suspensi yang diambil dari tabung pertama. Begitu seterusnya hingga pengenceran 10-7 cfu/mL. Suspensi bakteri pada pengenceran 10-7 cfu/mL diinokulasikan dalam media NA padat dengan metode spread plate, sebanyak 0,3 ml suspensi bakteri diteteskan ke dalam
cawan petri berisi media NA, dan diratakan dengan trigalski (Volk, 1993).
e. Uji Kemurnian Mikroorganisme Uji
Mikroorganisme uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah Salmonella typhi.
1) Pengamatan Morfologi Koloni
Bentuk-bentuk koloni bakteri digunakan untuk mempermudah identifikasi dan determinasi suatu biakan bakteri. Morfologi-morfologi koloni bakteri dapat dibedakan atas bentuk, ukuran, tekstur, warna koloni. Proses untuk melihat morfologi koloni dalam media NA dalam cawan petri adalah dengan menginokulasikan 0,1 ml kultur bakteri dengan memperhatikan pengenceran pada media NA dalam cawan petri secara spread plate kemudian diinkubasikan secara terbalik pada suhu kamar selama 48 jam, kemudian amati pertumbuhan koloni bakteri tersebut (Maria, 2011).
2) Pengamatan Morfologi Sel
Mikroorganisme uji diambil sebanyak satu ose, kemudian diinokulasikan secara goresan pada media NA miring dan diinkubasi pada suhu 37,50C selama 24 jam. Morfologi sel mikroorganisme uji diamati dengan menggunakan pengecatan negatif, dimulai dengan membersihkan gelas benda dan gelas penutup dengan alkohol, selanjutnya biakan mikroorganisme uji ambil sebanyak satu ose secara aseptis dan diletakkan di atas gelas benda. Tinta cina diambil dan diteteskan pada salah satu ujung gelas benda kemudian gelas benda yang lain diletakkan di atas suspensi dengan kemiringan 450 lalu ditarik
permukaannya dari ujung satu ke ujung lain hingga cat menjadi rata, sehingga menjadi lapisan tipis. Selanjutnya diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10x100 dan dilakukan pengambilan gambar menggunakan optilab (Alexander dkk, 2003)
3) Pengecatan Gram
Proses pengecatan Gram dimulai dengan membuat sediaan bakteri Salmonella typhi pada gelas benda kemuadian ditetesi kristal violet selama 1 menit, bilas dengan air mengalir selama 5 detik dan dikeringkan, kemudian tetesi lugol diamkan selama 1 menit, bilas dengan air mengalir selama 5 detik dan keringkan, setelah itu tetesi alkohol 96% dan diamkan selama 20 detik kemudian bilas dengan air mengalir diamkan selama 5 detik dan keringkan, terakhir tetesi safranin dan diamkan selama 1 menit setelah itu bilas dengan air mengalir dan dikeringkan.
Hasil pewarnaan ditutup dengan gelas penutup dan ditetesi minyak emersi lalu diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat, kemudian di foto dengan menggunakan optilab. Setelah diamati bakteri Gram positif akan berwarna ungu dan bakteri Gram negatif akan berwarna merah (Maria, 2011).