METODE PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitan 1. Determinasi tanaman
Determinasi tanamanM. tanariusmenggunakan biji, bunga, daun, buah dan batang yang dilakukan secara benar sesuai dengan buku acuan. Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta (Lampiran 5).
2. Pengumpulan bahan
Daun M. tanarius diperoleh dari Kebun Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Daun yang diambil adalah daun segar berwarna hijau, tidak sedang berbuah, tidak berlubang dan tidak terlalu tua dan muda (diambil daun yang berada tidak dipangkal dan diujung batang).
3. Pembuatan simplisia
Pembuatan simplisia daun M. tanarius yang telah dikumpulkan, dicuci dengan air mengalir, kemudian ditiriskan pada sinar matahari, untuk meniadakan air pada daun. Selanjutnya daun dikeringkan kembali menggunakan oven pada suhu 50°C selama 24 jam dan diserbuk menggunakan mesin penyerbuk di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Kemudian serbuk simplisia diayak menggunakan ayakan dengan nomor mesh 40.
4. Pembuatan EMMT
Pembuatan EMMT dilakukan dengan cara menyari serbuk kering daun M. tanarius secara maserasi. Serbuk daun M. tanarius seberat 10,0 g direndam dengan 100 ml pelarut metanol 50% di dalam erlenmeyer selama 72 jam (Puteri dan Kawabata, 2010) dengan kecepatan 150 rpm pada suhu kamar. Setelah dimaserasi, hasil maserasi tersebut disaring dengan kertas saring. Hasil saringan kemudian
dievaporasi dengan evaporator. Hasil dari evaporasi kemudian dipindahkan ke gelas piala yang telah ditimbang sebelumnya, dengan maksud untuk mempermudah perhitungan rendemen ekstrak kental yang akan diperoleh. Selanjutnya, gelas piala tersebut dimasukkan dalam oven untuk diuapkan dengan suhu 50°C agar mendapatkan EMMT yang kental dengan bobot ekstrak yang tetap.
5. Penetapan konsentrasi ekstrak pekat dan dosis EMMT
Konsentrasi pekat EMMT diperoleh berdasarkan penelitian sebelumnya oleh Andrianto (2010), yaitu sebesar 0,384g/mL atau 384 mg/ml atau 38,4% b/v.
6. Penetapan dosis kombinasi EMMT dan insulin
a. Penetapan dosis EMMT. Dosis EMMT yang digunakan adalah dosis yang memberikan LDDK0-240 yang terkecil berdasarkan penelitian sebelumnya oleh Setiawan (2012), yaitu sebesar 0,44g/Kg BB tikus.
b. Penetapan dosis insulin. Dosis insulin yang digunakan untuk hewan uji adalah sebesar 1 U. Dosis insulin yang digunakan ini merupakan hasil orientasi yang dilakukan sebelum penelitian.
c. Penetapan kombinasi dosis. Kombinasi dosis EMMT dan insulin yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebesar 1:1 dan 0,5:1
7. Preparasi bahan
a. Pembuatan CMC 1%. CMC 1% dibuat dengan mendispersikan 1 g CMC yang telah ditimbang seksama dengan air panas sampai volume 100 mL. CMC 1% ini digunakan untuk melarutkan ekstrak kental metanol-air daun M. tanarius.
b. Pembuatan larutan glukosa monohidrat 15%.Sebanyak 3,75g glukosa monohidrat dilarutkan dalam aquadest sampai tanda pada labu takar 25 mL.
8. Uji pendahuluan
a. Adaptasi pada hewan uji sebelum pengujian. Sebelum hewan uji digunakan untuk penelitian, hewan uji diadaptasikan dengan lingkungan laboratorium selama + 1 minggu terlebih dahulu.
b. Penetapan waktu pemberian EMMT. Sebanyak 2 kelompok dengan masing-masing 3 ekor tikus diberi EMMT pada menit ke 0 dan 15 sebelum pemberian glukosa monohidrat. Pengambilan cuplikan darah dilakukan sesaat sebelum perlakuan glukosa monohidrat sebagai menit ke-0 dan pada menit ke-15, 30, 45, 60, 90, 180, dan 240 setelah pembebanan glukosa. Kadar glukosa darah kemudian diukur dengan metode GOD-PAP dan kemudian dibuat kurva UTGO serta perhitungan harga LDKK0-240. Penentuan waktu pemberian EMMT didasarkan pada harga LDKK0-240terendah.
c. Penetapan waktu pemberian insulin. Sebanyak 6 ekor tikus dibagi menjadi 2 kelompok, kemudian masing-masing kelompok diberi perlakuan insulin dengan dosis 1 U pada menit ke 0 (bersamaan) dan 15 setelah pemberian glukosa monohidrat. Pengambilan cuplikan darah dilakukan sesaat sebelum perlakuan glukosa monohidrat sebagai menit ke-0 dan pada menit ke-15, 30, 45, 60, 90, 180, dan 240 setelah pembebanan glukosa. Kadar glukosa darah kemudian diukur dengan metode GOD-PAP dan kemudian dibuat kurva UTGO serta perhitungan harga LDKK0-240. Penentuan waktu pemberian insulin didasarkan pada persen perbedaan harga LDKK0-240dengan kontrol negatif yang paling tinggi..
9. Pengelompokan dan perlakuan hewan uji
Hewan percobaan yang digunakan sebanyak 30 ekor tikus putih jantan galur Wistar yang telah diadaptasikan terlebih dahulu selama 1 minggu di laboratorium. Kemudian dibagi secara acak dalam 6 kelompok perlakuan, yaitu:
a. Kelompok I adalah perlakuan dengan menggunakan insulin glargine
Lantus®dengan dosis 1U (kontrol positif) secara subkutan.
b. Kelompok II adalahperlakuan dengan menggunakanCMC 1% secara per oral (kontrol negatif)
c. Kelompok III adalahperlakuan dengan menggunakanEMMT dengan dosis 0,22 g/Kg BB secara peroral sebagai kontrol 0,5 bagian EMMT.
d. Kelompok IV adalahperlakuan dengan menggunakanEMMT dengan dosis 0,44 g/Kg BB secara peroral sebagai kontrol 1 bagian EMMT. e. Kelompok V adalah perlakuan dengan menggunakan kombinasi
EMMT secara per oral dan insulin glargine Lantus® secara subkutan masing-masing dengan perbandingan 0,5:1 (0,22 g/Kg BB : 1 U). f. Kelompok VI adalah perlakuan dengan menggunakan kombinasi
EMMT secara peroral dan insulin glargine Lantus® secara subkutan masing-masing dengan perbandingan 1:1(0,44 g/Kg BB : 1 U). Sebelum diberikan perlakuan, semua hewan uji diberikan glukosa monohidrat secara bersamaan dengan pemberian perlakuan. Kemudian sampel darah dasri setiap hewan uji diambil pada menit ke 0, 15, 30, 45, 60, 90, 180, dan
240, kemudian kadar glukosa darah diukur dengan menggunakan mikrovitalab dengan metode enzimatik GOD-PAP
10. Pengukuran kadar glukosa dalam darah
a. Pembuatan serum. Darah tikus diambil melalui vena lateralis ekor dan ditampung dalam tabung mikro melalui dinding, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit dan diambil serumnya.
b. Pengukuran kadar glukosa. Alat yang digunakan untuk menganalisis kadar glukosa darah adalah mikrovitalab. Kadar glukosa dinyatakan dalam mg/dL. Pengukuran kadar glukosa serum dilakukan di laboratorium Farmakologi-Toksikologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Analisis dilakukan dengan mencampurkan bahan seperti pada tabel I, lalu divortexdan dibaca serapannya setelahoperating time(OT) selama 20 menit.
Tabel 1. Volume bahan untuk pengukuran kadar glukosa
Bahan
Volume (µL) Aquabidest Larutan baku
glukosa Supernatan Pereaksi GOD-PAP Blangko 10 - - 1000 Standart - 10 - 1000 Sampel - - 10 1000
Selanjutnya dibuat kurva dengan mem-plot-kan nilai kadar glukosa darah lawan waktu ke-0 sampai menit ke 240, dan kemudian dihitung nilai LDDK0-240 dengan metode trapezoid. Rumus yang digunakan adalah sebagai berikut:
LDDK = t − t 2 × (C + C ) + t − t 2 × (C + C ) + t − t 2 × (C + C ) +t − t 2 × (C + C ) Keterangan: t = waktu (menit)
C = konsentrasi zat dalam darah (mg/ml)