BAB III METODE LOGI PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Determinasi tanaman apel beludru dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma menurut Morton (1987) dan United States Department of Agriculture NRCS (2013).
2. Pengumpulan dan penyiapan bahan (simplisia) a. Pengumpulan bahan
Kulit batang apel beludru diperoleh dari kawasan Kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta. Pemanenan dilakukan pada bulan Januari 2013 saat pagi hari. Pemanenan kulit batang apel beludru dilakukan dengan cara mengambil kulit batangbagian dasar pohon, yaitu dari bagian tanah 80-100 cm, kemudian dipotong melintang sepertiga dari besarnya kulit batang dengan tinggi 10 cm dan jarak pengambilan berikutnya sebesar 20 cm dari tanaman apel beludru dengan kondisi tanaman yang sedang berbuah dari kawasan Kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta.
b. Penyiapan bahan (simplisia)
Sebanyak 200 g kulit batang apel beludru ditimbang, dibersihkan , dicuci dengan air mengalir, lalu dikeringanginkan, kemudian dikeringkan pada oven dengan suhu 40-60oC. Kulit batang yang telah dikeringkan kemudian ditumbuk dan diserbuk menggunakan alat penyerbuk dan diayak dengan ayakan nomor mesh 40.
3. Ekstraksi simplisia
Simplisia yang telah dihaluskan ditimbang sebanyak 100 g dan dimasukkan ke dalam bejana maserasi, kemudian ditambah pelarut pertama berupa campuran metanol : air (9:1) sampai terendam sempurna dan dicampur homogen. Campuran dimaserasi dengan penggojogan pada orbital shaker pada suhu ruangan selama satu hari. Filtrat diperoleh melalui penyaringan menggunakan corong Buchner dengan bantuan pompa vakum. Ampas penyaringan dimaserasi dengan pelarut kedua yaitu campuran metanol : air (1:1) selama satu hari, lalu disaring. Filtrat hasil penyaringan pertama dan kedua digabungkan, kemudian filtrat diuapkan pelarutnya sehingga diperoleh ekstrak metanolik kulit batang apel beludru.
4. Pembuatan fraksi etil asetat
Ekstrak metanolik kulit batang apel beludru diekstraksi cair-cair menggunakan petroleum eter dengan perbandingan ekstrak cair : petroleum eter (1:1 v/v), kemudian didiamkan sampai terpisah sempurna. Hasil fraksinasi akan terbenruk dua lapisan, fase air akan berada pada paling bawah, sedangkan fase petroleum eter berada pada bagian atas. Dari hasil partisi diperoleh dua fraksi,
yaitu fraksi petroleum eter dan fraksi air. Selanjutnya, fraksi air diekstraksi cair-cair lagi menggunakan etil asetat dengan perbandingan larutan fraksi air : etil asetat (1:1 v/v) sehingga didapatkan fraksi air dan etil asetat. Setelah dipisahkan, fraksi etil asetat diuapkan dengan vacuum rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental kemudian dioven selama satu hari sehingga diperoleh ekstrak kering. Lalu hasil fraksi etil asetat tersebut digunakan untuk analisis lebih lanjut. 5. Pembuatan larutan DPPH, pembanding dan uji
a. Pembuatan larutan DPPH
Sebanyak 15,9 mg DPPH dilarutkan ke dalam metanol p.a sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.
b. Pembuatan larutan stok dan larutan intermediet kuersetin
Sebanyak 10,0 mg kuersetin dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL sebagai larutan stok. Kemudian dibuat larutan intermediet dengan mengambil 1 mL dari larutan stok kuersetin dan ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi sebesar 100,0
g/mL.
c. Pembuatan larutan pembanding
Diambil sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5 mL larutan kuersetin konsentrasi 100,0 g/mL kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar kuersetin sebesar 5; 7,5; 10; 12,5; 15 g/mL.
d. Pembuatan larutan uji
1) Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total
Sebanyak 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang, lalu ditambahkan metanol p.a 10 mL sampai diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 1000,0 µg/mL. Kemudian diambil 1,0 mL dari larutan tersebut kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 100,0 g/mL.
2) Larutan uji untuk aktivitas antioksidan
Sejumlah 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang dan ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL. Kemudian dibuat larutan intermediet dengan diambil 1 mL stok larutan uji lalu ditambahkan metanol p.a hingga 10,0 mL sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 100,0 g/mL. Diambil sebanyak 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75 mL larutan tersebut, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 7,5; 10; 12,5; 15; 17,5 g/mL.
3) Pembuatan larutan baku asam galat
Sebanyak 10,0 mg asam galat ditimbang kemudian ditambahkan 10 mL akuades : metanol p.a (1:1) hingga didapatkan konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 1000,0 µg/mL. Diambil sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 dan 1,5 mL larutan tersebut, kemudian ditambahkan akuades : metanol p.a (1:1) sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50; 75; 100; 125; dan 150 µg/mL.
6. Uji pendahuluan
a. Uji keberadaan senyawa fenolik
Larutan uji dengan konsentrasi 200,0 g/mL dan larutan pembanding asam galat 150,0 g/mL diambil sebanyak 0,5 mL kemudian ditambahkan 2,5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v) ke dalam tabung reaksi lalu didiamkan selama 10 menit. Larutan natrium karbonat 1 M ditambahkan sebanyak 2 mL, kemudian amati warna larutan tersebut. Bandingkan dengan warna larutan yang berisi air : metanol (1:1) ditambah pereaksi, fraksi etil asetat dan asam galat tanpa diberi pereaksi.
b. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan
Larutan DPPH diambil sebanyak 1 mL kemudian dimasukkan ke dalam masing-masing tiga tabung reaksi. Larutan DPPH ditambahkan masing-masing dengan 1 mL metanol p.a, larutan pembanding kuersetin 37,5 g/mL, dan larutan uji 200,0 g/mL. Selanjutnya, larutan tersebut ditambahkan dengan 3 mL metanol p.a. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Setelah 30 menit, diamati warna pada larutan tersebut. Bandingkan juga dengan warna larutan fraksi etil asetat dan kuersetin tanpa ditambahkan DPPH.
7. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total
Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total ditentukan dengan menggunakan metode spektrofotometri sesuai dengan penelitian Nusarini ( 2007).
a. Penentuan operating time (OT)
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 g/mL ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan
akuades (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4 mL natrium karbonat 1 M. Setelah itu, dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 750 nm selama 30 menit. Dilakukan demikian juga untuk larutan uji 100 g/mL dengan waktu pengamatan selama 60 menit.
b. Penentuan panjang gelombang maksimum
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 g/mL ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4 mL natrium karbonat 1 M. Diamkan selama operating time, absorbansinya dibaca pada maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 600-800 nm.
8. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan
a. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
Pada 3 labu ukur 10 mL, dimasukkan masing-masing 0,5; 1,0; 1,5 mL larutan DPPH. Ditambahkan larutan tersebut dengan metanol p.a hingga tanda batas sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,020; 0,040; dan 0,080 mM. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Diamkan selama operating time, lalu dilakukan scanning panjang gelombang serapan maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400-600 nm.
b. Penentuan operating time (OT)
Sebanyak 2 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam masing-masing tiga labu ukur 10 mL, ditambahkan masing-masing dengan 2 mL larutan pembanding kuersetin 5,0; 10,0; 15,0 g/mL. Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex
selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 516 nm selama 1 jam. Dilakukan demikian juga untuk larutan uji 7,5; 12,5; 17,5 g/mL.
9. Penetapan kandungan fenolik total a. Pembuatan kurva baku asam galat
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 75; 100; 125; dan 150 g/mL ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1M. Setelah operating time, absorbansinya dibaca pada maksimum terhadap blanko yang terdiri atas akuades : metanolik p.a (1:1), reagen Folin-Ciocalteu dan larutan natrium karbonat 1M. Pengerjaan dilakukan tiga kali.
b. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji
Diambil 0,5 mL larutan uji 100 g/mL, kemudian dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku asam galat. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai gram ekivalen asam galat (mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat). Dilakukan tiga kali replikasi.
10. Uji aktivitas antioksidan
a. Pengukuran absorbansi larutan DPPH (kontrol)
Pada labu ukur 10 mL, dimasukkan sebanyak 2 mL larutan DPPH lalu ditambahkan metanol p.a hingga tanda batas. Kemudian larutan tersebut dibaca absorbansinya pada saat operating time dan panjang gelombang maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak 3 kali. Larutan ini digunakan sebagai kontrol untuk menguji larutan pembanding dan uji.
b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji
Sebanyak 2 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam tabung reaksi 10 mL kemudian ditambahkan dengan 2 mL larutan pembanding dan uji pada berbagai seri konsentrasi telah dibuat. Selanjutnya larutan tersebut ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian vortex selama 30 detik dan diamkan selama operating time. Larutan dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi. Pengujian dilakukan dengan tiga kali replikasi.
c. Estimasi aktivitas antioksidan
Hasil dari prosedur 8a dan 8b, dihitung nilai % IC dan IC50 untuk kuersetin dan fraksi etil asetat kulit batang apel beludru.