BAB III. METODE PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Determinasi yang dilakukan adalah dengan mencocokkan ciri-ciri makroskopis buah P. americana Mill. yang diperoleh dari salah satu depot es di Yogyakarta dengan literatur berjudul “Suplement to Avocado Information
Kit” (Agrilink, 2001).
2. Pengumpulan bahan uji
Bahan uji yang digunakan adalah kulit P. americana Mill. yang masih segar dan tidak busuk yang diperoleh dari salah satu depot es di Yogyakarta pada bulan Juni-Juli 2014.
3. Pembuatan serbuk kulit P. americana Mill.
Kulit P. americana Mill. dicuci bersih dan dipisahkan dari daging buahnya. Setelah itu, kulit dipatah-patahkan kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 50oC selama 24 jam. Setelah kulit benar-benar kering, kulit
dihaluskan dengan blender dan alat penyerbuk lalu diayak dengan ayakan nomor 40.
4. Penetapan kadar air pada serbuk kulit P. americana Mill.
Penetapan kadar air serbuk kulit P. americana Mill. dilakukan dengan menggunakan alat moisture balance menggunakan metode susut bobot pengeringan. Serbuk dipanaskan pada suhu 105˚C sampai didapat bobot konstan. Serbuk ditimbang ulang dan dihitung sebagai bobot sesudah pemanasan. Selisih bobot sebelum pemanasan dan sesudah pemanasan merupakan kadar air dari sampel yang diteliti.
5. Pembuatan dekok serbuk kulit P. americana Mill.
Sebanyak 8,0 g serbuk kering kulit P. americana Mill. dimasukkan ke dalam 16,0 mL pelarut aquadest, kemudian ditambahkan lagi aquadest sebanyak 100,0 mL. Campuran dipanaskan pada suhu 90oC dan suhu dijaga agar tetap konstan selama 30 menit. Waktu 30 menit tersebut dihitung ketika suhu campuran mencapai 90oC. Setelah itu campuran tersebut diambil, diperas dengan kain flanel dan ditambahkan air panas secukupnya melalui ampas hingga didapatkan volume dekok kulit P. americana Mill. yang diinginkan yaitu 100 mL.
6. Pembuatan larutan karbon tetraklorida konsentrasi 50 %
Larutan karbon tetraklorida dibuat dengan perbandingan karbon tetraklorida : pelarut adalah 1 : 1, sehingga konsentrasi larutan karbon tetraklorida yang digunakan adalah 50% (Janakat dan Al-Merie, 2002). Pelarut yang digunakan dalam pembuatan larutan ini adalah olive oil.
7. Uji pendahuluan
a. Penetapan dosis hepatotoksik karbon tetraklorida
Dosis karbon tetraklorida yang digunakan untuk menginduksi kerusakan hati pada tikus jantan galur Wistar adalah 2 mL/kg BB yang diberikan secara intraperitonial satu kali sehari (lama perlakuan satu hari). Dosis karbon tetraklorida ini dipilih berdasarkan dosis hepatotoksiknya terhadap tikus yaitu 2 mL/kg BB. Dosis ini mampu merusak sel-sel hati pada tikus jantan yang ditunjukkan melalui peningkatan kadar ALT-AST tetapi tidak menimbulkan kematian pada hewan uji (Janakat dan Al-Merie, 2002).
b. Penetapan dosis dekok kulit Persea americana Mill.
Peringkat dosis didasarkan pada pengobatan yang biasa digunakan pada masyarakat, yaitu ± 2 sendok makan (4 g) serbuk biji P. americana Mill. yang direbus dengan 250 mL air. Maka dosis perlakuan yang digunakan adalah 4 g/70 kgBB manusia. Konversi dosis tikus (manusia 70 kg ke tikus 200g) = 0,018. Dosis untuk 200 g tikus = 0,018 x 4g = 0,072 g/200 g BB = 360 mg/kgBB. Dosis tersebut digunakan sebagai acuan dosis rendah (Yoseph, 2013).
Dosis tinggi perlakuan yang digunakan yaitu 1600 mg/KgBB yang ditentukan berdasarkan dosis maksimal dekok P. americana Mill. yang dapat dibuat yaitu 8 g/100 mL, dengan asumsi berat badan hewan uji adalah 200 g, dan volume maksimal pemberian dekok secara per oral yaitu 4 mL. Dosis maksimal dekok P. americana Mill. ini didapatkan
dari hasil orientasi sebelumnya dari penelitian Yoseph (2013) yang memperoleh konsentrasi maksimal serbuk biji P. americana Mill. yang mampu menghasilkan infusa adalah 8 gram dalam 100 mL aquadest. Dosis maksimal infusa biji alpukat ini kemudian digunakan sebagai acuan untuk menentukan dosis maksimal dekok kulit alpukat.
Perhitungan dosis tinggi perlakuan, D x 200 g = 8 g / 100 mL x 4 mL D x 0,200 kg = 80 mg / mL x 4 mL
D = 1600 mg/kgBB
Untuk mendapatkan dosis tengah perlakuan, terlebih dahulu dihitung faktor kelipatan dari dosis rendah dan dosis tinggi yang sudah diperoleh. Perhitungan faktor kelipatan adalah sebagai berikut :
√
N = Jumlah peringkat dosis yang digunakan. Penelitian ini menggunakan 3 peringkat dosis maka n = 3, sehingga perhitungannya sebagai berikut :
√ = 2,1 (faktor kelipatan)
Berdasarkan faktor kelipatan yang diperoleh maka dosis tengah dan dosis rendah perlakuan ditentukan sebagai berikut, D = 1600 mg/kg BB : 2,1 = 761,90 ≈ 762 mg/kg BB (dosis tengah) dan D = 762 mg/kg BB : 2,1 = 362,86 ≈ 363 mg/kg BB (dosis rendah).
c. Penetapan waktu pencuplikan darah
Penetapan waktu pencuplikan darah ditentukan melalui orientasi pada tiga kelompok perlakuan waktu, yaitu pada jam ke – 0, 24 dan 48 setelah pemejanan karbon tetraklorida. Setiap kelompok perlakuan terdiri dari 5 hewan uji yang pengambilan darahnya dilakukan melalui pembuluh sinus orbitalis mata. Setelah itu diukur kadar serum ALT/SGPT.
8. Pengelompokkan dan perlakuan hewan uji
Hewan uji yang dibutuhkan sebanyak 30 ekor tikus jantan galur Wistar yang dibagi secara acak dalam 6 kelompok masing-masing sejumlah lima ekor tikus.
a. Kelompok I (kelompok kontrol hepatotoksin) diberi karbon tetraklorida yang dilarutkan dalam olive oil dengan dosis 2 mL/kg BB secara intraperitonial satu kali sehari (lama perlakuan satu hari).
b. Kelompok II (kelompok kontrol negatif) diberi olive oil dosis 2 mL/kg BB secara intraperitonial satu kali sehari (lama perlakuan satu hari).
c. Kelompok III (kelompok kontrol dekok) diberi larutan dekok kulit P.
americana Mill. dosis tinggi (1600 mg/kgBB) selama 6 hari berturut-turut
secara per oral.
d. Kelompok IV (dosis 363 mg/kgBB) diberi dekok kulit P. americana Mill. satu kali sehari selama 6 hari berturut-turut secara per oral.
e. Kelompok V (dosis 762 mg/kgBB) diberi dekok kulit P. americana Mill. satu kali sehari selama 6 hari berturut-turut secara per oral.
f. Kelompok VI (dosis 1600 mg/kgBB) diberi dekok kulit P. americana Mill. satu kali sehari selama 6 hari berturut-turut secara per oral.
Pada hari ke tujuh, kelompok perlakuan (IV-VI) diberi larutan karbon tetraklorida dengan dosis 2 mL/kg BB secara intraperitonial setelah pemberian dekok 6 hari berturut-turut. Dua puluh empat jam setelah induksi karbon tetraklorida, tikus diambil darahnya melalui sinus orbitalis mata untuk pengukuran kadar enzim ALP.
9. Pembuatan serum
Darah diambil melalui sinus orbitalis mata hewan uji, ditampung dalam tabung dan didiamkan selama 15 menit. Darah hewan uji yang ditampung pada tabung kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 15 menit, lalu diambil bagian supernatannya.
10. Pengukuran kadar ALT pada uji pendahuluan
Pengukuran kadar ALT serum hewan uji pada uji pendahuluan ini dilakukan dengan menggunakan alat Microlab 200 Merck®. Pengukuran kadar ALT ini dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Kadar ALT dinyatakan dalam U/L yang diukur pada panjang gelombang 340 nm, suhu 37oC.
Pengukuran kadar ALT dilakukan dengan mencampur 100 μL serum dengan 1000 μL reagen 1, kemudian divortex selama 5 detik dan didiamkan selama 2 menit. Campuran tadi kemudian ditambahkan dengan 250 μL reagen 2 dan divortex selama 5 detik selanjutnya didapatkan hasil kadar ALT setelah 1 menit.
11. Pengukuran kadar ALP
Pengukuran kadar ALP serum hewan uji dilakukan dengan menggunakan alat Architect c8000. Pengukuran kadar ALP ini dilakukan di Parahita Diagnostic Center Yogyakarta. Reagen yang digunakan adalah Reagen Kit yang terdiri dari reagen 1 dan reagen 2. Kadar ALP dinyatakan dalam U/L yang diukur pada panjang gelombang 405 nm, suhu 37oC.
Prosedur pengukuran kadar ALP ini menggunakan sistem Architect dan
Aeroset. Prosedur dilusi atau pengenceran dengan sistem ini secara otomatis
memperbaiki nilai aktivitas enzim dengan mengalikan hasilnya dengan faktor pengenceran yang tepat. Semua prosedur baik pengenceran, penambahan reagen maupun pencampuran bahan dilakukan secara otomatis oleh alat.
Langkah-langkah pengukuran kadar ALP ini adalah sebagai berikut, pertama serum dari sampel diambil sebanyak 100 μL kemudian dilakukan pengenceran secara otomatis oleh alat. Serum 100 μL yang telah diencerkan kemudian ditambah dengan 1000 μL reagen 1. Campuran tadi kemudian ditambahkan dengan 250 μL reagen 2. Hasil kadar yang didapatkan akan terbaca pada komputer yang terhubung dengan alat Architect c8000.