BAB III METODELOGI PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Determinasi tanaman menggunakan ciri-ciri yang terdapat pada tanaman
M.tanarius yang dilakukan secara benar berdasarkan buku acuan Flora of Java di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Pengumpulan bahan
Daun M.tanarius yang telah dipanen dan dikumpulkan, didapatkan dari Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta dengan daun yang digunakan adalah daun yang berwarna hijau segar, tidak berlubang serta tidak terdapat kotoran binatang kecil.
3. Pembuatan simplisia
Pembuatan simplisia daun M.tanarius dilakukan dengan cara yaitu daun yang telah dipanen dan telah dikumpulkan dicuci dengan menggunakan air mengalir kemudian ditiriskan untuk meniadakan air pada daun serta kembali dikeringkan dengan menggunakan oven dengan suhu 30-45˚C hingga daun benar-benar kering dan dapat diserbuk dengan mesin penyerbuk. Serbuk simplisia yang didapatkan diayak kembali menggunakan ayakan no. 40 4. Pembuatan ekstrak metanol-air daun M. tanarius
Ekstrak metanol-air daun M.tanarius diperoleh dengan mengambil 30 gram serbuk kering daun M.tanarius dilarutkan dalam 150 ml metanol-air 50% pada erlenmeyer bersumbat, kemudian diekstraksi secara maserasi selama lima hari terlindung dari cahaya sambil sesekali diaduk dan disaring,
kemudian ampas dari serbuk daun M.tanarius sebelumnya dilakukan remaserasi dengan dilarutkan kembali dalam jumlah dan volume pelarut yang sama selama dua hari dan terlindung dari cahaya kemudian disaring untuk mendapatkan filtrat. Hasil dari filtrat maserasi dan filtrat remaseri disatukan dan dibiarkan selama satu hari kemudian pelarut ekstrak diuapkan dengan menggunakan oven hingga didapatkan ektrak kental dengan bobot yang tetap. 5. Pembuatan larutan NaCl fisiologis 0,9%
Larutan NaCl fisiologis 0,9% dibuat dengan melarutkan 0,9 g NaCl dalam sedikit aquadest dalam gelas beker kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL selanjutnya ditambahkan dengan aquadest hingga tanda.
6. Pembuatan konsentrasi karagenin dan orientasi pemberian karagenin Karagenin 1% dibuat dengan melarutkan 1 g karagenin dalam sedikit NaCl fisiologis 0,9% dalam gelas beaker kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL selanjutnya ditambahkan dengan NaCl fisiologis 0,9% hingga tanda.
Karagenin 0,5 % dibuat dengan melarutkan 0,5 g karagenin dalam sedikit larutan NaCl fisiologis 0,9% dalam gelas beaker kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL selanjutnya ditambahkan dengan larutan NaCl Fisiologis 0,9% hingga tanda.
Karagenin 1,5 % dibuat dengan melarutkan 1,5 g karagenin dalam sedikit larutan NaCl fisiologis 0,9% dalam gelas beaker kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL selanjutnya ditambahkan dengan larutan NaCl Fisiologis 0,9% hingga tanda.
Mencit yang digunakan sebanyak 3 ekor. Satu ekor mencit untuk pemberian karagenin 0,5 %, 1 ekor mencit untuk pemberian karagenin 1% dan 1 ekor mencit untuk pemberian karagenin 1,5% dengan masing-masing volume pemberian 0,1 mL secara subkutan. Kulit punggung mencit diukur terlebih dahulu sebelum diinjeksikan dengan karagenin dan diukur kembali setelah diinjeksikan karagenin setiap 1 jam selama 6 jam. Edema pada kulit punggung mencit dari pemberian karagenin yang menunjukkan penebalan sebesar 2-3 kali dari tebal awal dipilih sebagai konsentrasi penginduksi inflamasi.
7. Pembuatan ekstrak metanol air daun M.tanarius 1,67; 2,5; dan 3,75% Ekstrak metanol-air daun M.tanarius 1,67; 2,5; dan 3,75% dibuat dengan menimbang ekstrak metanol-air daun M.tanarius seberat 0,167; 0,25; dan 0,375 g dan dilarutkan dalam 10 g basis Biocream®.
8. Penyiapan hewan uji
Hewan uji yang dibutuhkan sebanyak 33 ekor mencit betina galur Swiss, umur 2-3 bulan, berat badan 20-25 g. Hewan uji dibagi secara acak menjadi dua kelompok. Kelompok untuk pra-studi sebanyak 3 ekor mencit dan kelompok perlakuan sebanyak 30 ekor mencit. Kelompok perlakuan terdiri dari enam kelompok perlakuan yaitu kelompok kontrol negatif, kelompok kontrol positif, kelompok kontrol Biocream®, kelompok tiga seri konsentarasi ekstrak
M.tanarius (1,67; 2,5; dan 3,75%) dan masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor mencit. Penelitian dengan menggunakan hewan uji ini telah mendapatkan
Medical and Health Research Ethics Committe (MHREC) Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada dengan Ref : KE/FK/908/EC (lampiran 6.)
9. Pengujian dengan ekstrak metanol-air daun M.tanarius
Sebanyak 30 ekor mencit betina dibagi secara acak menjadi enam kelompok perlakuan. Kelompok 1 (kontrol negatif), kelompok 2 (kontol Biocream®), kelompok 3 (kontol positif), kelompok 4 (ekstrak metanol-air daun M.tanarius dengan konsentrasi 1,67%), kelompok 5 (ekstrak metanol-air daun M.tanarius dengan konsentrasi 2,5%), dan kelompok 6 (ekstrak metanol-air daun M.tanarius dengan konsentrasi 3,75%) dengan masing-masing 5 ekor mencit, dicukur bulu pada bagian punggungnya dan dibiarkan selama satu hari kemudian diinjeksi dengan karagenin dengan konsentrasi 1,5% dan diukur edema yang muncul dengan jangka sorong setiap jam selama 6 jam. Mencit kelompok 1 hanya diinjeksikan dengan karagenin, mencit kelompok 2 dioleskan dengan Biocream® (basis ekstrak), mencit kelompok 3 dioleskan dengan Callacort® yang mengandung krim hidrokortison asetat 2,5% sedangkan mencit kelompok 4, 5, dan 6 dioleskan dengan tiga peringkat seri konsentrasi ekstrak daun M.tanarius serta dilihat penghambatan inflamasinya dengan mengukur edema yang mengempis dengan jangka sorong setiap jam selama enam jam. Masing-masing dari ekstrak metanol-air daun M.tanarius
dengan tiga seri konsentrasi (1,67; 2,5; 3,75%) dan krim hidrokortison asetat 2,5% ditimbang seberat 0,1 g dan dioleskan pada area suntikan karagenin dengan luas area 2,25 cm2 (1,5 x 1,5 cm). Skema jalannya penelitian dapat dilihat pada gambar 7.
Didiamkanselama satu hari
Gambar 7. Skema jalannya penelitian
Keterangan :
Kel. I : Injeksi karagenin 1,5%
Kel. II : Injeksi karagenin + diolesi Callacort®
Kel. III : Injeksi karagenin + diolesi basis ekstrak (Biocream®)
Kel. IV : Injeksi karagenin + diolesi ekstrak M.tanarius 1,67%
Kel. V : Injeksi karagenin + diolesi ekstrak M.tanarius 2,5%
Kel. VI : Injeksi karagenin + diolesi ekstrak M.tanarius 3,75%
30 ekor mencit dibagi menjadi enam kelompok
Masing masing mencit terlebih dahulu dicukur bulu punggung mencit
Diukur kulit normal mencit sebelum di injeksi dengan karagenin 1,5% dengan jangka sorong digital
Mencit diinjeksikan dengan larutan karagenin 1,5% secara subkutan pada
Kel. I Kel. II Kel. III Kel. IV Kel. V Kel. VI
Edema diukur menggunakan jangka sorong digital setiap 1 jam selama 6 jam
Dihitung selisih edema kulit punggung mencit yang terinduksi karagenin dengan kulit normal mencit yang
tidak terinduksi karagenin
Setelah 24 jam, dilakukan pengamatan histopatologi kulit sebagai data pendukung
10. Pengamatan secara histopatologi
Pada saat akhir penelitian (24 jam setelah pengukuran jam ke enam) dilakukan nekropsi dengan cara dislokasi tulang leher mencit dan dilakukan pembedahan organ bagian kulit yang ingin diamati. Pembedahan dilakukan pada papan bedah. Pemotongan kulit diambil dengan ukuran 1 x 1 x 1 cm dan potongan organ diletakkan pada container yang telah berisikan larutan fiksatif yaitu formalin 10% hingga organ kulit tersebut terendam dengan sempurna. Organ yang telah diawetkan dilakukan pengecatan hematoksilin dan eosin (HE) dan dibaca histologinya di bawah mikroskop dengan perbesaran 200x.