BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
1. Tahap preparasi lobster dan habitat
a. Persiapan alat dan bahan
Sebanyak 12 buah akuarium (60 x 30 x 50 cm) disiapkan dalam tempat terhindar dari cahaya. Lobster air tawar spesies Cherax quadricarinatus didapatkan dari peternak lobster Godean Yogyakarta dengan kriteria usia 3 bulan, panjang 5-5,5 cm dan berat 3-3,5 gram. Sedimen didapatkan dari peternak lobster air tawar Godean Yogyakarta.
b. Determinasi lobster
Lobster air tawar yang digunakan sebagai hewan uji dideterminasi oleh Laboratorium Taksonomi Hewan Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta dengan menggunakan sumber determinasi berjudul Cherax quadricarinatus oleh Jones dan Wingfield, The Freshwater and Land Crayfishes of Australia oleh Clark dan The Australian Freshwater Crayfish (Crustaceae:Decapoda:Parasticidae) with Descriptions of New Species oleh Riek.
c. Preparasi habitat lobster
Sedimen yang terkumpul dihomogenkan dan ditimbang sebanyak 100 gram, lalu dimasukkan dalam akuarium dan diisi air sumur setinggi 10 cm dari dasar akuarium(setara 14 liter). Rumah lobster dan aerator dimasukkan dalam akuarium (1 rumah dan aerator/akuarium). Lobster air tawar dimasukkan dalam akuarium (15 ekor/akuarium). Media ini selanjutnya digunakan untuk pemeliharaan lobster.
2. Tahap preparasi pakan lobster
a. Penetapan kadar tetrasiklin HCl (TCH) dalam kapsul Tetrasanbe® 1) Pembuatan stok standar TCH 1 mg/ml
Sebanyak 100 mg standar TCH ditimbang dan dimasukkan dalam labu takar 100 ml ditambahkan akuabides hingga batas tanda.
2) Validasi metode
Pembuatan seri baku TCH 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,45; dan 0,5 mg/ml.. Larutan stok standar TCH 1 mg/ml dibuat seri, diambil 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; dan 5,0 ml dimasukkan dalam labu takar 10 ml dan ditambahkan akuabides hingga batas tanda. Lalu dicek absorbansi dengan spektrofotometri uv pada spektrum 200-400 nm, dilakukan replikasi 3 kali pada sampel dan dibuat persamaan regresi linear dan nilai r (linearitas). Selain itu dilakukan penetapan akurasi dengan melihat %D, sensitivitas LOD dan LOQ, serta presisi didapat dari sampel yang direplikasi 3 kali lalu dicari %RSD.
3) Preparasi sampel kapsul
Sebanyak 10 kapsul TCH 500 mg dibuka dan dikeluarkan serbuknya, ditimbang kemudian digerus dan dihomogenkan dalam mortir. Sebanyak 25 mg sampel TCH ditimbang dan dimasukkan dalam labu takar 100 ml dan ditambahkan akuabides hingga batas tanda.
4) Penetapan kadar TCH dengan spektrofotometri uv
Blanko dibuat dari seluruh pelarut yang digunakan tanpa zat analit. Blanko dimasukkan dalam kuvet, dilakukan baseline terhadap spektrofotometri uv. Sampel dideteksi absorbansi dengan spektrofotometri uv pada spektrum 200-400 nm, dilakukan replikasi 3 kali pada sampel.
b. Optimasi dosis TCH
Sebanyak 4 akuarium kosong (A, B, C, D) disiapkan. Sedimen sebagai habitat awal lobster ditimbang masing-masing sebanyak 100 gram. Sedimen dimasukkan dalam akuarium dan diberi air yang telah disesuaikan dengan luas akuarium setinggi 10 cm dari dasar akuarium (setara dengan 14 liter), kemudian diaduk hingga homogen. Kincir air (aerator) dimasukkan ke dalam akuarium dan diaktifkan. TCH sebanyak 2,25 gram; 4,5 gram; dan 9 gram dimasukkan ke dalam akuarium B, C, dan D secara berurutan, ditunggu selama 1 hari. Setelah 1 hari dilakukan sampling pada pukul 06.00 WIB dan dilakukan pengecekan jumlah
populasi mikroba oleh Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta dengan metode perhitungan jumlah mikroba (cfu).
c. Pembuatan dan pola pemberian pakan berantibiotik 1) Pembuatan pakan berantibiotik
Berdasarkan prosentase pakan lengkap dengan berat udang 3-15 gram maka diberikan adalah 8-4%. Sesuai dengan berat lobster, digunakan prosentase sebesar 4% sehingga jumlah pakan lobster diberikan sebanyak 1,8 gram/hari. Selanjutnya jumlah pakan ini digunakan untuk membuat dosis pakan selama 5 hari. Sebanyak 0,2025 gram TCH ditimbang dan dilarutkan dalam akuabides sebanyak 25 ml dalam labu takar. Sebanyak 45 gram pakan lobster dilakukan penyemprotan dengan larutan TCH secara merata. Setelah penyemprotan, pelet pakan lobster dikering udarakan hingga kering (± 3jam) dengan menggunakan fan, dihindarkan dari cahaya.
2) Frekuensi pemberian pakan
Pakan mengandung tetrasiklin diberikan pada lobster 3 kali sehari yaitu pada pagi hari 0,45 gram (25%), sore hari 0,45 gram (25%) dan malam hari 0,9 gram (50%).
3. Tahap persiapankelompok kontrol dan kelompok perlakuan
a. Pembuatan kelompok kontrol
Perlakuan pada 6 akuarium yaitu 1 akuarium sebagai blangko (0 hari) dan 5 akuarium perlakuan pemberian pakan biasa (tanpa tetrasiklin)
dengan lama pemberian 3 hari, 5 hari, 7 hari, 14 hari dan 28 hari. Pemberian pakan dilakukan 3 kali dalam sehari dengan jumlah pakan 25% pada pagi dan sore serta 50% pada malam hari.
b. Pembuatan kelompok perlakuan
Perlakuan pada 6 akuarium yaitu 1 akuarium sebagai blangko (0 hari) dan 5 perlakuan pemberian pakan berantibiotik dengan lama pemberian 3 hari, 5 hari, 7 hari, 14 hari dan 28 hari. Pemberian pakan berantibiotik dilakukan 3 kali dalam sehari dengan jumlah pakan 25% pada pagi dan sore serta 50% pada malam hari.
4. Tahap preparasi analit
a. Ekstraksi protein dalam sedimen
Proses ekstraksi pada penelitian ini mengacu pada penelitian oleh Mayer, Schick, dan Setchell (1986). Sedimen kering ditimbang sebanyak 0,2 gram dan dimasukkan dalam flakon lalu ditambahkan NaOH 0,1 N sebanyak 6 ml. Campuran dalam flakon ditutup, divortex lalu ditunggu selama 2 jam (OT) pada suhu 60oC di dalam oven. Setelah OT, campuran disentrifuge 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil sebanyak 4 ml dan pH dinetralkan dengan HCl 2,5 N hingga pH 7-8, lalu dimasukkan dalam labu takar 5 ml, ditambahkan PBS hingga tanda batas. Sampel ini selanjutnya dideteksi absorbansinya dengan menggunakan metode CBB dan spektrofotometer sinar tampak derivatif.
b. Ekstraksi tetrasiklin dalam daging lobster 1) Preparasi sampel ekstrak daging
Lobster pada perlakuan hari ke 14 (13,12 gram) dan 28 (9,02 gram) diambil daging pada abdomen dan dibersihkan dari cangkang kulit lobster. Daging dihaluskan menggunakan mortir dan ditimbang. Daging halus dimasukkan dalam campuran HCl dan akuabides dengan perbandingan 1 : 1 sebanyak 40 ml. Sampel ditutup dan disimpan dalam suhu rendah dan terhindar dari cahaya matahari. 2) Ekstraksi tetrasiklin
Ekstrak daging divortex dan diambil sebanyak 5 ml lalu disentrifuge 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil sebanyak 0,5 ml dimasukkan dalam flakon dan ditambahkan 3 ml asetonitril; 1,5 ml buffer McIlvaine; 1 ml NaOH (pH 4) kemudian divortex dan dievaporasi hingga asetonitril menguap seluruhnya (2 jam). Hasil evaporasi dimasukkan dalam labu takar 5 ml dan ditambahkan buffer McIlvaine hingga tanda batas. Sampel ini selanjutnya dipreparasi untuk deteksi dengan metode HPLC.
5. Tahap persiapan metode penetapan kadar
a. Metode penetapan kadar protein dalam sedimen
Kadar protein dalam sedimen ditetapkan dengan menggunakan metode CBB R dan spektrofotometri sinar tampak derivatif yang dikembangkan oleh Yolanda Novia Widyawati serangkaian dengan penelitian ini.
b. Metode penetapan kadar tetrasiklin
1) Orientasi panjang gelombang tetrasiklin
Standar tetrasiklin HCl (TCH) ditimbang sebanyak 50 mg dan dilarutkan dalam HCl : akuabides (1:1) ditambahkan hingga tanda batas dalam labu takar 10 ml. Larutan TCH sebanyak 0,5 ml diekstraksi. Kemudian hasil ekstraksi disaring dengan milipore dan dilakukan degassing lalu dicek absorbansi dengan spektrofotometri uv dengan interval panjang gelombang 200-400 nm.
2) Penentuan puncak tetrasiklin a) Pembuatan larutan blangko
Larutan HCl : akuabides (1:1) disiapkan sebanyak 5 ml, diambil 0,5 ml lalu diberi perlakuan ekstraksi sama seperti perlakuan sampel.
b) Pembuatan larutan standar TCH
Larutan TCH 0,2 ppm dalam asetonitril : buffer McIlvaine disiapkan dan dideteksi dengan menggunakan HPLC. c) Pembuatan larutan standarTC
Larutan standar TCH dalam HCl : akuabides disiapkan dan diekstraksi hingga didapat konsentrasi 0,2 ppm dan dideteksi dengan menggunakan HPLC.
3) Optimasi fase gerak HPLC a) Kondisi HPLC
(1) Fase diam : kolom C18 (oktadesil silika) (2) Detektor : uv-sinar tampak
(3) Fase gerak :
(a) Asetonitril : buffer McIlvaine (pH 4) 50:50%
(b) Metahol : buffer McIlvaine (pH 4; asam sitrat dan natrium bifosfat) 50:50%
(4) Panjang gelombang : 270 nm (hasil orientasi) (5) Flow rate : 0,5 ml/menit
b) Pembuatan fase gerak
(1) Pembuatan metanol : buffer McIlvaine (pH 4)
Fase gerak dan pelarut yang digunakan adalah hasil optimasi fase gerak yaitu campuran metanol dan buffer McIlvaine dengan perbandingan 50:50% v/v. Metanol dan buffer McIlvaine yang telah dibuat, masing-masing disaring menggunakan solvent membrane filter sesuai sifat pelarut dengan bantuan pompa vakum. Kemudian diletakkan dalam chamber fase gerak HPLC lalu dilakukan proses degassing menggunakan ultrasonikator selama 15 menit.
(2) Pembuatan asetonitril : buffer McIlvaine (pH 4)
Fase gerak dan pelarut yang digunakan adalah hasil optimasi fase gerak yaitu campuran asetonitril dan buffer McIlvaine dengan perbandingan 50:50% v/v. Asetonitril dan buffer
McIlvaine yang telah dibuat, masing-masing disaring menggunakan solvent membrane filter sesuai sifat pelarut dengan bantuan pompa vakum. Kemudian diletakkan dalam chamber fase gerak HPLC lalu dilakukan proses degassing menggunakan ultrasonikator selama 15 menit.
c) Persiapan instrumen HPLC
Kolom HPLC dicuci dengan menggunakan metanol (HPLC grade) selama 1 jam kemudian dilakukan conditioning dengan fase gerak selama 1 jam dan dicek baseline hingga kolom siap digunakan. Vial berisi standar TCH 20 ppm dimasukkan dalam tray dan dicek AUC menggunakan HPLC detektor UV dengan waktu elusi 13 menit.
6. Tahap validasi metode penetapan kadar
a. Validasi spektrofotometri sinar tampak derivatif 1) Linearitas
a) Pembuatan stok albumin (BSA) 40 mg/ml
Sebanyak 2 gram albumin (BSA) dimasukkan dalam labu takar 50 ml dan ditambahkan PBS hingga tanda batas.
b) Pembuatan seri baku albumin (BSA)
Sebanyak 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, dan 1000 µl dimasukkan dalam labu takar 10 ml dan ditambahkan PBS
hingga tanda batas. Konsentrasi dibuat 0,80; 1,20; 1,60; 2,00; 2,40; 2,80; 3,40; 3,60; dan 4,00 mg/ml.
c) Analisis dengan spektrofotometri sinar tampak derivatif
Sebanyak 1 ml diambil dari setiap seri baku dimasukkan dalam labu takar 5 ml dan ditambahkan reagen CBB hingga tanda batas dan ditunggu selama 15 menit. Sampel dicek spektrum dengan menggunakan spektrofotometri sinar tampak pada 400-800 nm.
d) Pembuatan kurva baku solven
Hasil spektrum yang keluar setiap seri baku dilakukan derivatisasi kedua. Setiap konsentrasi pada hasil spektrum derivatisasi diplotkan dan dicari nilai r dari persamaan regresi liniernya.
2) Pembuatan kurva adisi
Sedimen ditimbang masing-masing 0,2 gram dimasukkan dalam flakon (A, B, C, D, E, F) ditambahkan albumin 10, 30, 50, 70, dan 90 mg dalam flakon (B, C, D, E, F) secara berurutan. Kemudian dilakukan preparasi dan ekstraksi sesuai dengan sampel sedimen lalu dilakukan pengecekan tinggi derivat dengan menggunakan CBB dan spektrofotometri sinar tampak derivatif.
3) Akurasi
Akurasi dinyatakan dalam bentuk %D dari kurva adisi. Nilai %D yang baik adalah kurang dari 20%
4) Presisi
Presisi didapatkan dari kurva adisi yang direplikasi sebanyak 3 kali dan dihitung %RSD. Nilai %RSD yang baik adalah kurang dari 20% 5) Limit Of Quantification (LOQ)
LOQ didapatkan dari kurva adisi dengan menggunakan rumus : LOQ = 3,3 x SD/slope
b. Validasi metode HPLC 1) Linearitas
a) Pembuatan stok tetrasiklinHCl (TCH) 500 ppm
Sebanyak 5 mg TCH dimasukkan dalam labu takar 10 ml dan ditambahkan HCl : akuabides (1:1) hingga tanda batas.
b) Pembuatan seri TC
Seri konsentrasi TC dibuat 2, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 96, dan 120 ppm. Sebanyak 20, 120, 240, 360, 480, 600, 720, 960 dan 1200 µl dari stok TCH (500 ppm) dimasukkan dalam labu takar 5 ml ditambahkan HCl : akuabides hingga tanda batas. Tiap seri baku diambil 0,5 ml dan diekstraksi. Hasil evaporasi dimasukkan labu takar 5 ml dan ditambahkan buffer hingga tanda batas.
c) Analisis dengan HPLC
Setiap seri baku dimasukkan dalam vial HPLC. Sampel dicek dengan menggunakan HPLCdengan kondisi optimasi.
d) Pembuatan kurva baku solven
Hasil kromatogram berupa AUC pada pengecekan seri baku diplotkan dan dicari nilai r serta persamaan regresi liniernya y = bx+a.
2) Pembuatan kurva adisi a) Pembuatan seri TC
Daging lobster bebas tetrasiklin dihaluskan dengan menggunakan mortar dan stamper. Daging ditimbang masing-masing 1 gram dimasukkan dalam flakon A, B, C, D, E. Sebanyak 20, 100, 300, 700, 1000 µl dari stok TCH 500 ppm dimasukkan dalam flakon B, C, D , E. HCl : akuabides (1:1) ditambahkan sebanyak 4980 (A), 4900 (B), 4700(C), 4300(D), 4000(E) µl dengan micropipette ke dalam flakon.
b) Analisis tetrasiklindengan HPLC
Masing-masing seri baku (A,B,C,D,E) dalam flakon divortex selama 3 menit lalu ditambahkan NaCL 0,1 g dan dilakukan sentrifuge 3000 rpm selama 20 menit. Supernatant sampel A,B,C,D,E diambil sebanyak 0,5 ml dimasukkan dalam flakon lalu diekstraksi. Hasil evaporasi dimasukkan dalam labu takar
5 ml ditambahkan buffer hingga batas tanda. Larutan disaring dengan milipore dan dilakukan degassing untuk diinjeksikan ke HPLC.
c) Pembuatan kurva adisi
Hasil kromatogram berupa AUC pada pengecekan seri adisi diplotkan dan dicari nilai r serta persamaan regresi liniernya y = bx+a. Kurva adisi dibandingkan dengan kurva baku solven. 3) Akurasi
Akurasi didapatkan dari perhitungan %D kurva adisi. 4) Presisi
Presisi didapat dari perhitungan %RSD 3 replikasi kurva adisi. 5) Selektivitas
Selektivitas dilihat dari nilai resolusi pada pengecekan AUC kurva adisi.
6) Limit Of Quantification (LOQ)
LOQ didapatkan dari kurva adisi dengan menggunakan rumus : LOQ = 3,3 x SD/slope
7. Analisis sampel
a. Analisis kuantitatif jumlah populasi mikroba pada sampel air
1) Preparasi sampel air kelompok kontrol dan kelompok perlakuan a) Sampling air dilakuakan pada pukul 06.00 WIB. Air dalam
hingga partikel sedimen mengendap kemudian dilakukan pengambilan air, 2 cm diatas sedimen secara random dengan spuit yang telah dimodifikasi (100 ml), dimasukkan dalam botol steril yang disediakan oleh Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta.
b) Penetapan jumlah populasi mikroba dilakukan oleh Bagian Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta dengan menggunakan metode perhitungan jumlah mikroba (cfu) dengan colony counter.
b. Analisis kuantitatif protein pada sampel sedimen 1) Preparasi NaOH 0,1 N dan HCl 2,5 N
NaOH (kualitas p.a) ditimbang sebanyak 0,4 gram, ditambahkan akuabides dalam labu takar 100 ml hingga batas tanda. HCl (kualitas p.a) diambil 2,083 ml diencerkan dengan akuabides dalam labu takar 10 ml hingga batas tanda.
2) Preparasi phosphate buffer saline(PBS)
Sebanyak 4 gram NaCl, 0,2 gram KCl, 0,72 gram Na2HPO4, dan 0,12 gram KH2PO4 ditimbang dan dimasukkan dalam labu takar 500 ml, ditambahkan akuabides hingga tanda batas.
3) Preparasi reagen coomasie brilliant blue
Sebanyak 10 mg CBB ditimbang dan dilarutkan dalam 20 ml PBS dan 10 ml etanol, disebut campuran A. Sebanyak 3 ml campuran A
dimasukkan dalam labu takar 100 ml. Ditambahkan 8 ml PBS dan 3,75 ml etanol kemudian ditambahkan akuabides hingga tanda batas. 4) Preparasi protein dalam sedimen
Air akuarium didekantir dan sedimen diambil seluruhnya, dimasukkan dalam botol sampel. Sedimen disaring menggunakan corong Buchner dan pompa vacuum hingga kering. Sedimen kering dimasukkan dalam mortir dan digerus dengan stamper hingga homogen. Sedimen ditimbang sebanyak 0,2 gram dimasukkan dalam flakon dan ditambahkan NaOH 0,1 N sebanyak 6 ml dengan menggunakan makropipet. Campuran diaduk dan divortex hingga homogen lalu dimasukkan dalam oven dengan suhu 600C, ditunggu selama 2 jam. Setelah 2 jam, dikeluarkan dari oven dan disentrifuge dengan kecepatan putar 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil sebanyak 4 ml ditambahkan HCl 2,5 N hingga pH 7-8 kemudian dimasukkan dalam labu takar 5 ml ditambahkan PBS hingga tanda batas.
5) Analisis kuantitatif protein
Blanko dibuat dari seluruh pelarut dan reagen yang digunakan tanpa ada sampel. Blanko dimasukkan dalam kuvet, dilakukan baseline terhadap spektrofotometer sinar tampak. Sampel dalam labu takar diambil sebanyak 1 ml dimasukkan dalam labu takar 5 ml. Reagen CBB ditambahkan dalam labu takar hingga tanda batas dan
dilakukan operating time hingga 15 menit. Setelah 15 menit, campuran dimasukkan dalam kuvet dan dicek absorbansi dengan spektrofotometer sinar tampakpada spektrum 400-800 nm. Spektra yang keluar diderivatisasi level kedua kemudian dilakukan pengukuran tinggi puncak derivat.
c. Pengukuran panjang dan berat lobster
Lobster yang ada dalam akuarium dikeluarkan seluruhnya dan ditimbang berat serta diukur panjangnya. Pengukuran berat dengan menggunakan timbangan analitik dan pengukuran panjang dengan mengukur dari ujung kepala sampai ekor. Kelompok kontrol dan perlakuan dibandingkan nilai slope dari kurva hubungan hari perlakuan dengan selisih panjang dan berat lobster hari ke 0.
d. Analisis kuantitatif tetrasiklin dalam daging lobster
Ekstrak daging divortex dan diambil sebanyak 5 ml lalu disentrifuge 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil 0,5 ml dimasukkan dalam flakon lalu ditambahkan asetonitril sebanyak 1,5 ml kemudian ditambahkan 1,5 ml buffer McIlvaine (pH 4). pH campuran dinaikkan dengan menggunakan NaOH 2,5 N sebanyak 1 ml lalu ditambahkan asetonitril 1,5 ml. Campuran dievaporasi dengan rotary evaporator dengan suhu 40oC selama 2 jam. Hasil evaporasi dimasukkan dalam labu takar 5 ml dan ditambahkan PBS hingga tanda batas, lalu disaring dengan
milipore dan dilakukan degassing selama 5 menit lalu dimasukkan dalam vial. Sampel dideteksi dengan HPLC.