Pengaruh pemberian pakan berantibiotik pada populasi mikroba air, kadar protein sedimen dan akumulasi tetrasiklin dengan menggunakan pengembangan metode analisis tetrasiklin serta pengaruhnya pada laju pertumbuhan lobster air tawar (Cherax quadricarinatus

(1)

1

PENGARUH PEMBERIAN PAKAN BERANTIBIOTIK PADA POPULASI

MIKROBA AIR, KADAR PROTEIN SEDIMEN DAN AKUMULASI

TETRASIKLIN DENGAN MENGGUNAKAN PENGEMBANGAN

METODE ANALISIS TETRASIKLIN SERTA PENGARUHNYA PADA

LAJU PERTUMBUHAN LOBSTER AIR TAWAR (Cherax quadricarinatus)

ADITYA CHRISTIAN FIRMANTO, SRI NOEGROHATI

Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Abstract: The freshwater lobster cultivation is one of the natural resources

utilization which has been interested by many people in community because it is simple to do, even it has good prospect for future business in Indonesia and foreign countries. The problem is that there is antibiotic accumulation in meat because antibiotics usage in feeding lobster to maintain their health and productivity of cultivated lobster. Surely, antibiotics usage in aquaculture will influence the water quality, therefore the analysis of microbial population in water and amount of protein in sediment as the parameter of the water quality, antibiotics accumulation in meat and its effect to growth rate of freshwater lobster are needed. In this study, treatment had been given by feeding lobster using food containing antibiotics (tetracycline HCl) and food without antibiotics as control for a period of 3, 5, 7, 14 and 28 days. Microbial population in water was analysed by using colony forming unit method, the amount of protein in sediment by using CBB R method and spectrophotometry visible derivative, and antibiotics accumulation in meat by using reverse-phase HPLC. The result was analysed by comparing the amount of microbial population and protein, also length and weight of freshwater lobter both control group and treatment group.The result in this study showed fluctuation of microbial population in water but there was no increasing or decreasing of log microbial population in polynomial trend. The amount of protein in sediment, length and waeight of freshwater lobster had been increasing but it showed no difference both control group and treatment group. In treatment group, the accumulation of antibiotics in meat was 53,0970 µg/g.

Keywords : Freshwater lobster, sediment, tetracycline, spectrophotometry visible,

(2)

2

Intisari: Budidaya lobster air tawar (Cherax quadricarinatus) merupakan

pemanfaatan sumber daya alam yang cukup diminati masyarakat karena mudah dilakukan bahkan memiliki prospek yang baik di Indonesia dan manca negara. Yang menjadi masalah adalah adanya akumulasi antibiotik dalam daging lobster akibat penggunaan antibiotik untuk menjaga kesehatan dan produktivitas lobster dari penyakit. Tentunya penggunaan antibiotik dalam akuakultur akan mempengaruhi kualitas air, maka perlu dilakukan analisis pengaruh pakan berantibiotik pada populasi mikroba dalam air dan kadar protein sedimen sebagai parameter kualitas air dan kadar akumulasi antibiotik dalam daging serta pengaruhnya terhadap laju pertumbuhan lobster air tawar. Dalam penelitian ini dilakukan pemberian pakan berantibiotik (Tetrasiklin HCl) dan pakan kontrol (tanpa antibiotik) sebagai pembanding, pada lobster air tawar selama 3, 5, 7, 14, dan 28 hari. Populasi mikroba dalam air diuji dengan metode perhitungan jumlah mikroba (cfu), kadar protein sedimen dianalisis dengan metode CBB R dan spektrofotometri sinar tampak derivatif, dan kadar akumulasi tetrasiklin daging menggunakan metode HPLC fase terbalik. Analisis hasil dilakukan dengan membandingkan hasil populasi mikroba, kadar protein dan laju pertumbuhan lobster kelompok kontrol dan kelompok perlakuan antibiotik. Hasil penelitian menunjukkan fluktuatif populasi mikroba dalam air tetapi menunjukkan tren polinomial log populasi mikroba yang tidak meningkat maupun menurun. Kadar protein sedimen, panjang dan berat lobster meningkat tetapi tidak berbeda antara kedua kelompok. Pada kelompok perlakuan antibiotik terjadi akumulasi tetrasiklin dalam daging lobster sebesar 53,0970 µg/g.

Kata kunci : Lobster air tawar, sedimen, tetrasiklin, spektrofotometri sinar

(3)

SKRIPSI

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Aditya Christian Firmanto NIM : 118114161

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

(4)

i

SKRIPSI

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Aditya Christian Firmanto NIM : 118114161

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

(5)

ii

Persetujuan Pembimbing

Skripsi yang diajukan oleh:

Aditya Christian Firmanto

NIM : 118114161

telah disetujui oleh:

Pembimbing Utama

(6)

iii

Pengesahan Skripsi Berjudul

Oleh :

1. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt.

2. Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt.

(7)

iv

Halaman Persembahan

“Dunia tak akan selebar ini jika tidak ada ilmu yang

mendampingi. Dunia tak akan semegah ini bila tidak ada

orang-orang dengan usaha di dalamnya. Dunia tak akan seberlimpah

ini bila Tuhan tidak mengijinkan semua ini terjadi.”

Karya kecil ini, penulis persembahkan untuk pelebaran dunia dan

(8)

v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN

PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan dibawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :

Nama : Aditya Christian F

Nomor Mahasiswa : 118114161

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :

Pengaruh Pemberian Pakan Berantibiotik Pada Populasi Mikroba Air, Kadar Protein Sedimen Dan Akumulasi Tetrasiklin Dengan Menggunakan Pengembangan Metode Analisis Tetrasiklin Serta Pengaruhnya Pada Laju

Pertumbuhan Lobster Air Tawar (Cherax Quadricarinatus)

Beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta izin dari saya maupun memberikan royalty kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.

Dengan pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal, Januari 2016

Yang menyatakan

(9)

vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis

dan susun ini tidak memuat karya atau bagian dari pekerjaan orang lain, kecuali

yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya

karya ilmiah.

Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah

ini, maka saya bersedia menanggung segala resiko sesuai peraturan

perundang-undangan yang berlaku

Yogyakarta, Desember 2015

Penulis,

(10)

vii

PRAKATA

Puji dan syukur kepada Tuhan Yesus Kristus atas limpah karuniaNya penulis dapat menyelesaikan tugas akhir dengan judul “Pengaruh Pemberian Pakan Berantibiotik Pada Populasi Mikroba Air, Kadar Protein Sedimen Dan Akumulasi Tetrasiklin Dengan Menggunakan Pengembangan Metode Analisis Tetrasiklin Serta Pengaruhnya Pada Laju Pertumbuhan Lobster Air Tawar (Cherax quadricarinatus)” dengan baik. Tugas akhir ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat mendapatkan gelar Sarjana Farmasi program studi Farmasi.

Selama penyusunan dan penyelesaian tugas akhir ini, penulis telah mendapatkan banyak dukungan berupa doa, semangat, bantuan, kritik dan saran dari berbagai pihak. Dalam kesempatan ini penulis hendak berterima kasih kepada:

1. Bapak dan ibu serta adik atas doa, kasih saying, kesabaran, materi, motivasi, nasehat dan pendapat yang diberikan pada penulis selama penyusunan tugas akhir ini.

2. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

(11)

viii

4. Bapak dan Ibu Karjono selaku seperti pembimbing kedua dalam menyusun skripsi, menimba ilmu tentang lobster dan belajar mengenai nilai-nilai kehidupan.

5. Ibu Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt. sebagai dosen penguji dan atas kesediannya dan kesabarannya dalam memberikan waktu serta pengarahan, kritik, dan saran yang membangun untuk penyelesaian skripsi ini.

6. Ibu Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc. sebagai dosen penguji dan atas kesediannya dan kesabarannya dalam memberikan waktu serta pengarahan, kritik, dan saran yang membangun untuk penyelesaian skripsi ini.

7. Seluruh dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas ilmu, nasihat dan bimbingan yang telah diberikan.

8. Ibu Agustina Setiawati M.Sc., Apt. selaku Kepala Laboratorium yang bersedia direpotkan dengan banyak permintaan tanda tangan surat lembur. 9. Seluruh staf laboratorium kimia Fakultas Farmasi: Mas Bimo, Pak Parlan,

Mas Kunto, Pak Wagiran, Mas Kayat dan Mas Agung atas bantuannya selaman penelitian berlangsung.

10.Tante Yolanda Novia selaku partner skripsi yang mampu dan mau sabar menjalani tiap proses sedih dan senang selama penyusunan skripsi.

(12)

ix

12.Mbak Gita Mentari selaku teman seperjuangan yang sudah bersedia menyediakan tempat untuk menyusun naskah mentah selama 2 minggu. 13.Bibi Villianova dan Bibi Ratna sebagai teman yang setia mendukung dan

menunggu sidang pendadaran.

14.Adik Gaiety Suthami sebagai teman sekaligus tempat sampah selama proses penyusunan skripsi.

15.Mas Wahyu Bramastyo sebagai mentor dan motivator dalam mengambil setiap langkah selama proses penyusunan skripsi.

16.Teman-teman Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta atas kerja sama dan kebersamaan selama proses perkuliahan.

17.Seluruh pihak yang telah membantu selama proses penelitian ini yang tidak dapat disebutkan satu per satu.

Penulis menyadariada banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran dari semua pihak. Akhir kata, penulis meminta maaf apabila ada kesalahan dalam penyusunan skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat berkontribusi baik untuk kemajuan ilmu pengetahuan farmasi.

Yogyakarta, Desember 2015

(13)

x

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ... i

PERSETUJUAN PEMBIMBING ... ii

HALAMAN PENGESAHAN ... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ... iv

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ... v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... vi

PRAKATA ... vii

(14)

xi

1. Permodelan semi intensif ... 5

2. Derajad keasaman (pH) dan kesadahan ... 6

3. Dissolve of oxygen dan suhu ... 7

4. Sedimen ... 7

B. Lobster Air Tawar Crayfish (Cherax quadricarinatus) ... 8

C. Persiapan Pakan Lobster... 9

G. Spektrofotometri Sinar Tampak Derivatif... 15

H. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ... 16

I. Validasi metode ... 17

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ... 22

(15)

xii

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ... 22

C. Bahan Penelitian ... 24

A.Tahap Persiapan Habitat Lobster Air Tawar ... 46

B.Tahap Persiapan Pakan Lobster ... 47

1. Validasi dan analisis kadar tetrasiklin HCl (TCH) dalam sediaan kapsul ... 47

2. Optimasi dosis TCH ... 48

3. Pembuatan dan pemberian perlakuan pakan antibiotik ... 49

C.Tahap Ekstraksi Protein ... 50

D.Validasi Metode Spektrofotometri Sinar Tampak Derivatif ... 51

E. Analisis Sampel ... 53

1. Analisis populasi mikroba dalam air habitat lobster ... 53

2. Analisis kadar protein dalam sedimen ... 57

3. Pertumbuhan lobster air tawar terkait panjang dan berat lobster ... 59

F. Kadar Tetrasiklin (TC) Dalam Daging Lobster ... 60

1.Preparasi dan ekstraksi TC dalam daging lobster ... 61

2.Orientasi panjang gelombang TC ... 63

(16)

xiii

4.Optimasi fase gerak HPLC ... 65

G. Validasi Metode HPLC ... 66

H. Penetapan Kadar Tetrasiklin (TC) Dalam Daging Lobster ... 69

I. Keterbatasan Penelitian... 70

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ... 71

A. Kesimpulan ... 71

B. Saran ... 71

DAFTAR PUSTAKA ... 72

LAMPIRAN ... 76

(17)

xiv

DAFTAR TABEL

Tabel I. Taksonomi lobster air tawar ... 9

Tabel II. Prosentase pakan berdasarkan berat ternak ... 10

Tabel III. Genus bakteri dalam lingkungan... 12

Tabel IV. Hasil validasi penetapan kadar TCH dalam kapsul ... 48

Tabel V. Jumlah populasi mikroba pada optimasi dosis TCH ... 49

Tabel VI. %D kurva adisi protein ... 53

Tabel VII. Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi TC ... 66

Tabel VIII. %D kurva adisi TC ... 68

Tabel IX. Hasil perhitungan resolusi TC ... 68

(18)

xv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Struktur tetrasiklin HCl ... 11

Gambar 2. Struktur CBB R-250 ... 14

Gambar 3. Interaksi protein primer dan CBB ... 15

Gambar 4. Perubahan struktur protein akibat denaturasi ... 51

Gambar 5. Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi protein ... 52

Gambar 6. Bakterosidal dan bakteriostatik antibiotik ... 54

Gambar 7. Log populasi mikroba kelompok kontrol dan antibiotik ... 55

Gambar 8. Kurva log jumlah populasi mikroba versus hari (kelompok kontrol) ... 55

Gambar 9. Kurva log jumlah populasi mikroba versus hari (kelompok perlakuan) ... 56

Gambar 10. Kurva kadar protein dalam sedimen selama hari perlakuan ... 59

Gambar 11. Kurva perbandingan panjang lobster kontrol dan perlakuan .. 60

Gambar 12. Kurva perbandingan berat lobster kontrol dan perlakuan ... 60

Gambar 13. Reaksi oksidasi trigliserida oleh asam ... 62

Gambar 14. Kromatogram standar TCH dalam pelarut fase gerak ... 63

Gambar 15. Kromatogram blangko... 64

Gambar 16. Kromatogram standar TC basa ... 64

Gambar 17. Kromatogram TC dengan fase gerak methanol:buffer McIlvaine ... 66

(19)

xvi

(20)

xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat permohonan working standar tetrasiklin HCl ... 77

Lampiran 2. COA working standar tetrasiklin HCl ... 78

Lampiran 3. COA reagen coomasie R ... 79

Lampiran 4. COA albumin (BSA) ... 80

Lampiran 5. Hasil determinasi lobster air tawar ... 81

Lampiran 6. Kurva baku penetapan kadar tetrasiklin HCl dalam kapsul ... 84

Lampiran 7. Tabel hasil penetapan kadar tetrasiklin HCl dalam kapsul ... 84

Lampiran 8. Hasil jumlah populasi mikroba pada optimasi dosis tetrasiklin ... 85

Lampiran 9. Hasil jumlah populasi mikroba air hari ke 0 ... 86

Lampiran 15. Tabel data jumlah populasi mikroba ... 97

Lampiran 16. Tabel data tinggi derivat kurva baku solven protein ... 97

Lampiran 17. Tabel data tinggi derivat kurva adisi protein ... 97

Lampiran 18. Contoh perhitungan %D ... 97

Lampiran 19. Contoh perhitungan %RSD ... 98

Lampiran 20. Contoh perhitungan LOQ ... 98

(21)

xviii

Lampiran 22. Data kadar protein dalam sedimen ... 99

Lampiran 23. Tabel data panjang lobster air tawar... 99

Lampiran 24. Tabel data berat lobster air tawar ... 99

Lampiran 25. Spektrum orientasi panjang gelombang tetrasiklin ... 99

Lampiran 26. Tabel data AUC kurva baku solven tetrasiklin ... 100

Lampiran 27. Tabel data AUC kurva adisi tetrasiklin ... 100

Lampiran 28. Contoh kromatogram tetrasiklin kurva baku solven ... 100

Lampiran 29. Contoh kromatogram tetrasiklin kurva adisi tetrasiklin ... 100

Lampiran 30. Contoh kromatogram tetrasiklin dalam sampel daging hari ke 14 ... 101

Lampiran 31. Contoh kromatogram tetrasiklin dalam sampel daging hari ke 28 ... 101

Lampiran 32. Kandungan pakan dan merek dagang pakan ... 101

Lampiran 33. Proses perlakuan ... 101

Lampiran 34. Sedimen lobster air tawar ... 102

Lampiran 35. Perbandingan jumlah sedimen pada hari ke 28 ... 102

Lampiran 36. Contoh perhitungan uji t tidak berpasangan (p<0,05) ... 102

(22)

xix

INTISARI

Budidaya lobster air tawar (Cherax quadricarinatus) merupakan pemanfaatan sumber daya alam yang cukup diminati masyarakat karena mudah dilakukan bahkan memiliki prospek yang baik di Indonesia dan manca negara. Yang menjadi masalah adalah adanya akumulasi antibiotik dalam daging lobster akibat penggunaan antibiotik untuk menjaga kesehatan dan produktivitas lobster dari penyakit. Tentunya penggunaan antibiotik dalam akuakultur akan mempengaruhi kualitas air, maka perlu dilakukan analisis pengaruh pakan berantibiotik pada populasi mikroba dalam air dan kadar protein sedimen sebagai parameter kualitas air dan kadar akumulasi antibiotik dalam daging serta pengaruhnya terhadap laju pertumbuhan lobster air tawar.

Dalam penelitian ini dilakukan pemberian pakan berantibiotik (Tetrasiklin HCl) dan pakan kontrol (tanpa antibiotik) sebagai pembanding, pada lobster air tawar selama 3, 5, 7, 14, dan 28 hari. Populasi mikroba dalam air diuji dengan metode perhitungan jumlah mikroba (cfu), kadar protein sedimen dianalisis dengan metode CBB R dan spektrofotometri sinar tampak derivatif, dan kadar akumulasi tetrasiklin daging menggunakan metode HPLC fase terbalik. Analisis hasil dilakukan dengan membandingkan hasil populasi mikroba, kadar protein dan laju pertumbuhan lobster kelompok kontrol dan kelompok perlakuan antibiotik.

Hasil penelitian menunjukkan fluktuatif populasi mikroba dalam air tetapi menunjukkan tren polinomial log populasi mikroba yang tidak meningkat maupun menurun. Kadar protein sedimen, panjang dan berat lobster meningkat tetapi tidak berbeda antara kedua kelompok. Pada kelompok perlakuan antibiotik terjadi akumulasi tetrasiklin dalam daging lobster sebesar 53,0970 µg/g.

Kata kunci : Lobster air tawar, sedimen, tetrasiklin, spektrofotometri sinar

(23)

xx

ABSTRACT

The freshwater lobster cultivation is one of the natural resources utilization which has been interested by many people in community because it is simple to do, even it has good prospect for future business in Indonesia and foreign countries. The problem is that there is antibiotic accumulation in meat because antibiotics usage in feeding lobster to maintain their health and productivity of cultivated lobster. Surely, antibiotics usage in aquaculture will influence the water quality, therefore the analysis of microbial population in water and amount of protein in sediment as the parameter of the water quality, antibiotics accumulation in meat and its effect to growth rate of freshwater lobster are needed.

In this study, treatment had been given by feeding lobster using food containing antibiotics (tetracycline HCl) and food without antibiotics as control for a period of 3, 5, 7, 14 and 28 days. Microbial population in water was analysed by using colony forming unit method, the amount of protein in sediment by using CBB R method and spectrophotometry visible derivative, and antibiotics accumulation in meat by using reverse-phase HPLC. The result was analysed by comparing the amount of microbial population and protein, also length and weight of freshwater lobter both control group and treatment group.

The result in this study showed fluctuation of microbial population in water but there was no increasing or decreasing of log microbial population in polynomial trend. The amount of protein in sediment, length and waeight of freshwater lobster had been increasing but it showed no difference both control group and treatment group. In treatment group, the accumulation of antibiotics in meat was 53,0970 µg/g.

Keywords : Freshwater lobster, sediment, tetracycline, spectrophotometry visible,

(24)

1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kebutuhan pangan yang meningkat menyebabkan masyarakat mencari alternatif pemanfaatan sumber daya alam, mulai dari pertanian hingga perikanan. Salah satu pemanfaatan sumber daya perikanan yang cukup diminati adalah budidaya lobster air tawar, karena budidaya lobster air tawar relatif mudah dan memiliki profit yang cukup tinggi. Kemudahan dalam pengembangbiakan lobster air tawar ini membuat minat masyarakat semakin meningkat (Lim, 2006).

Masalah yang ada dalam budidaya perikanan saat ini adalah kondisi cuaca ekstrim dan kelembaban udara yang tinggi. Kondisi ini menyebabkan laju pertumbuhan mikroba semakin tinggi dan berakibat pada penurunan produktivitas lobster air tawar karena penyakit oleh mikroba. Mikroba yang banyak dilaporkan menyebabkan penyakit hingga kematian pada golongan Crustaceae adalah Vibrio spp (Ansari dan Raissy, 2010). Hal ini membuat peternak menggunakan antibiotik sebagai alternatif untuk menjaga kesehatan dan produktivitas lobster air tawar dengan menghambat atau membunuh mikroba merugikan yang ada di habitat (Kurniawan, 2010).

(25)

daging ini dikhawatirkan memberikan pengaruh yang buruk jika dikonsumsi manusia dalam jangka panjang, sehingga penggunaan antibiotik dalam beberapa hal seperti tambahan dalam pakan ternak sudah dibatasi bahkan dilarang (Weifen, Hong, Changhu, dan Jamil, 2004).

Air dan sedimen merupakan komponen habitat yang mendukung pertumbuhan dan perkembangan lobster. Tentunya parameter air yang layak untuk lobster hidup juga diperlukan, seperti ketersediaan oksigen dan komponen organik dalam air. Sedimen merupakan sisa pakan dan hasil ekskresi dari lobster air tawar yang sebagian besar adalah protein, mengendap di dasar habitat. Sedimen ini akan berada dalam habitat lobster dan memberikan pengaruh terhadap pertumbuhan lobster. Dalam hal ini, peran mikroba terhadapsiklus kimia air sangat diperlukan untuk menjaga kualitas air. Dalam penelitian digunakan tetrasiklin HCl sebagai perlakuan antibiotik, karena tetrasiklin HCl memiliki spektrum yang lebar dalam menghambat pertumbuhan bakteri gram positif maupun gram negatif (Krasner dan Shors, 2014). Keberadaan pakan yang mengandung tetrasiklin dalam habitat, akan berdampak pada kualitas sedimen yang terbentuk di dalam air. Adanya masalah pada kualitas sedimen maupun kondisi air akan berpengaruh pada tumbuh kembang lobster, maka perlu dilakukan penelitian terkait pengaruh pakan mengandung antibiotik terhadap habitat dan laju pertumbuhan lobster dalam jangka waktu tertentu.

(26)

spektrofotometri sinar tampak derivatif (400-800 nm). Pengamatan laju petumbuhan lobster dilakukan dengan mengukur panjang dan berat lobster dan pengamatan akumulasi antibiotik dengan metode High Performance Liquid Chromatograhpy (HPLC) fase terbalik dengan pengembangan. Validasi yang dilakukan dalam penelitian ini meliputi akurasi (%D), presisi (%RSD), sensitivitas (LOQ), dan linearitas (r). Analisis hasil dilakukan dengan membandingkan antara perlakuan dan kontrol dengan hari perlakuan pakan mengandung antibiotik.

1. Rumusan masalah

a. Bagaimana pengaruh pakan berantibiotik terhadap jumlah populasi mikroba dalam habitat lobster air tawar?

b. Bagaimana pengaruh pakan berantibiotik terhadap kadar protein dalam sedimen lobster air tawar?

c. Bagaimana pengaruh pakan berantibiotik terhadap laju pertumbuhan lobster air tawar?

d. Apakah terjadi akumulasi tetrasiklin dalam daging lobster air tawar?

2. Keaslian penelitian

(27)

their Epimers in Marine Products as per the EU Guidelines (Vora, 2013). Sejauh peneliti mengamati penelitian sebelumnya, belum ada yang mengamati pengaruh pakan antibiotik tetrasiklin HCl terhadap populasi mikroba dalam akuakultur, kada protein dalam sedimen dan akumulasi pada lobster air tawar dengan pengembangan metode analisis tetrasiklin sebagai indikator laju pertumbuhan lobster air tawar spesies Cherax quadricarinatus.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat teoritis. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi dan pengetahuan terkait pengaruh pakan berantibiotik terhadap budidaya lobster air tawar. Selain itu hasil penelitian juga dapat sumbangsih untuk penelitian lain terkait penggunaan tetrasiklin dalam akuakultur agar ilmu dapat berkembang lebih baik.

b. Manfaat praktis. Hasil penelitian ini diharapkan dapat meningkatkan kualitas lingkungan hidup lobster air tawar yang berdampak pada kualitas lobster.

B. Tujuan Penelitian

1. Mengetahui pengaruh pakan berantibiotik terhadap jumlah populasi mikroba dalam habitat lobster air tawar.

2. Mengetahui pengaruh pakan berantibiotik terhadap kadar protein dalam sedimen lobster air tawar.

3. Mengetahui pengaruh pakan berantibiotik terhadap laju pertumbuhan lobster air tawar.

(28)

5

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Persiapan Habitat Lobster Air Tawar

1. Permodelan semi intensif

Budidaya dengan sistem semi intensif ini merupakan budidaya dengan padat penebaran cukup tinggi, menggunakan kincir dan pakan buatan atau pelet. Dalam kondisi demikian, beban bahan organik tambak menjadi tinggi. Bahan organik berasal dari ekskresi udang, sisa pakan dan bangkai organisme mengendap di dasar tambak. Untuk menanggulangi hal tersebut, pada tambak semi intensif dilakukan pengaerasian dan pergantian air yang cukup, baik kuantitas maupun frekuensinya. Upaya tersebut dilakukan guna mempertahankan kualitas air bagi kelangsungan hidup dan pertumbuhan optimum organisme (Effendy, 1998).

(29)

2. Derajat keasaman (pH) dan kesadahan

Derajat keasaman (pH) air ini penting sebagai parameter kualitas air karena dapat mengontrol tipe dan laju kecepatan reaksi zat di dalam air. Derajat keasaman (pH) air yang baik untuk pertumbuhan lobster air tawar berkisar 6-9,5. Jika angka pH kurang dari 5, akan berpengaruh buruk bagi pertumbuhan lobster air tawar karena dapat menyebabkan kematian. Sementara pH>9 akan menurunkan nafsu makan pada lobster air tawar sehingga pertumbuhannya menjadi lambat (Lukito dan Prayugo, 2007).

pH air dan kehadiran karbon dioksida juga berkaitan erat dengan alkalinitas. Pada pH kurang dari 5, alkalinitas dapat mencapai angka 0. Semakin tinggi angka pH air, semakin tinggi pula nilai alkalinitas sedangkan kadar CO2 bebas semakin rendah. Nilai alkalinitas akan menurun jika terjadi pengendapan padatan suspensi dari bahan organik sehingga mengakibatkan peningkatan kandungan CO2 bebas (Lukito dan Prayugo, 2007).

(30)

3. Dissolve of oxygen (DO) dan suhu

Keberadaan oksigen di dalam air sangat dibutuhkan oleh organisme air. Ketersediaan oksigen di dalam air dipengaruhi oleh suhu, tekanan udara dan adanya tumbuhan air. Semakin tinggi suhu air akan menyebabkan kandungan oksigen yang terlarut menjadi semakin sedikit. Semakin rendah tekanan udara suatu lingkungan, kandungan oksigen di dalam air pun semakin rendah. Lobster air tawar dapat hidup pada selang parameter air yang lebar, diketahui bahwa lobster toleran terhadap kandungan oksigen terlarut sangat rendah. Lobster air tawar memerlukan kadar oksigen terlarut lebih dari 4 ppm untuk dapat bertumbuh dan berkembang (Lukito dan Prayugo, 2007).

Lobster air tawar memiliki sifat toleran terhadap suhu dingin bahkan mendekati beku hingga suhu di atas 35°C. Pada kisaran suhu 20-30°C, lobster air tawar mampu bertahan hidup tetapi laju pertumbuhannya lambat. Sementara pada suhu 23-25°C, pertumbuhannya menjadi lambat. Meskipun demikian, lobster air tawar yang hidup di daerah tropis hendaknya dipelihara pada selang suhu 24-30°C(Lukito dan Prayugo, 2007).

4. Sedimen

(31)

berlebih dapat memicu terjadinya kondisi lingkungan yang anaerob (oksigen rendah) sehingga terjadi penurunan mutu lingkungan yang pada akhirnya berdampak pada respon pertumbuhan ternak yang rendah. Faktor-faktor yang mempengaruhi kondisi prima suatu lingkungan budidaya salah satunya adalah keberadaan pakan buatan dan implikasinya bagi media budidaya selama pemeliharaan. Pakan merupakan masukan terbesar yang dapat mempengaruhi akumulasi bahan organik di sedimen dan kualitas air tambak. Akumulasi sisa pakan yang merupakan bahan organik akan menurunkan kualitas lingkungan hidup ternak dengan menyumbang kandungan nitrogen dan fosfor sebagai sumber polutan bagi ternak (Nur, 2011).

B. Lobster Air Tawar Crayfish (Cherax quadricarinatus)

Lobster air tawar crayfish atau sering disebut capit merah merupakan spesies endemik kelompok udang yang hidup di perairan tawar kawasan Queensland, Australia. Ciri-ciri morfologi lobster air tawar capit merah ini tubuh berwarna hijau kemerahan dengan warna dasar bagian atas capit berupa garis merah tajam, terutama pada induk jantan yang telah berumur lebih dari 7 bulan. Lobster air tawar capit merah dapat hidup dan tumbuh pada suhu 21-37°C. Suhu air optimum untuk hidup dan tumbuh lobster ini adalah 23-31°C. Sementara itu, toleransi terhadap kandungan oksigen di dalam air adalah 1 ppm, pH keasaman (6-9,5), dan amonia 1 ppm (Sukmajaya dan Suharjo, 2003).

(32)

Di dalam lambung, enzim pencernaan diekskresikan untuk memecah pakan menjadi bentuk yang lebih sederhana. Sisa pencernaan akan diekskresikan melalui anus (Lukito dan Prayugo, 2007).

Kebanyakan jenis lobster mengkonsumsi pakan dengan bantuan rangsang kimia (kemoreseptor). Pada saat pakan diberikan, atraktan (asam amino) dari pakan akan dilepas ke air dan dideteksi oleh kemoreseptor yang menyebar di seluruh tubuh lobster sehingga lobster dapat mencapai pakan yang dituju (Nur, 2011).

Tabel I. Taksonomi lobster air tawar (Lukito dan Prayugo, 2007)

Kingdom Animalia

Pakan merupakan salah satu faktor yang penting dalam masa pembesaran karena pertumbuhan lobster sangat dipengaruhi oleh pakan, dengan pemberian pakan yang benar diharapkan lobster dapat bertumbuh dan berkembang dengan kualitas baik (Bachtiar, 2006).

(33)

Hal ini memerlukan pengetahuan tentang kebutuhan nutrien dari ternak yang akan dipelihara, kebiasaan dan tingkah laku makan, serta kemampuan kultivan dalam mencerna dan menggunakan nutrien esensial. Pakan yang diberikan harus mengandung nutrien yang dibutuhkan ternak seperti protein dan asam amino esensial, lemak dan asam lemak, energi, vitamin, serta mineral (Nur, 2011).

Pengaturan jumlah pakan dilakukan sesuai dengan nafsu makan, pertumbuhan, dan mortalitas ternak. Jika pakan diberikan terlalu sedikit dapat mengakibatkan pertumbuhan menjadi lambat, bahkan memicu kanibalisme terutama pada pemeliharaan ternak dengan kepadatan tinggi. Jika pemberian pakan diberikan secara berlebih maka akan terjadi penumpukan sisa pakan yang dapat menyebabkan penurunan mutu air. Seberapa besar jumlah pakan yang dikonsumsi oleh ternak dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu : jenis pakan, ukuran ternak, suhu air, cuaca, kualitas air, dan status kesehatan ternak itu sendiri. Perhitungan jumlah pakan harian yang diberikan pada ternak adalah dengan mengalikan total biomas ternak dengan prosentase pakan sesuai dengan berat ternak seperti tercantum pada tabel II (Nur, 2011).

Tabel II. Prosentase pakan berdasarkan berat ternak (Nur, 2011) Berat udang (g) Pakan tambahan Pakan lengkap

0-3 10%-4% 15%-8%

3-15 4%-2,5% 8%-4%

15-40 2,5%-2% 4%-2%

2. Tetrasiklin HCl

(34)

protein dengancara mengikat sub unit 30 S pada ribosom sel bakteri sehingga bakteri tidak dapat membentuk protein untuk berkembangbiak menjadi banyak (Subronto dan Tjahjati, 2001).

Tetrasiklin HCl memiliki rumus molekul C22H24N2O8.HCl dengan berat molekul 480,6 g/mol. Rumus struktur kimianya sebagai berikut:

Gambar 1. Struktur tetrasiklin HCl (Anonim, 1995)

Organoleptis tetrasiklin HCl adalah serbuk hablur, kuning, tidak berbau, agak higroskopis, stabil di udara tetapi pada pemaparan terhadap cahaya matahari yang kuat dalam udara lembab menjadi berwarna gelap. Kelarutan tetrasiklin HCl dalam air, alkali hidroksida dan dalam larutan karbonat sangat tinggi, sukar larut dalam etanol, praktis tidak larut dalam kloroform dan eter. Tetrasiklin HCl membentuk garam dengan ion Na+ dan Cl- sehingga kelarutannya dalam air meningkat (Anonim, 1995).

D. Mikroorganisme

(35)

dalam melihat kondisi air maupun penanganan air limbah. Bakteri merupakan salah satu organisme prokariotik yang cukup penting dalam sistem penanganan air limbah. Dua hal yang menjadi poin dalam air limbah yaitu bakteri patogen dan bakteri yang dapat memetabolisme limbah. Pada umumnya bakteri menggunakan bahan organik seperti protein sebagai sumber energi dan karbon dengan merombak protein menjadi senyawa yang lebih sederhana. Beberapa spesies bakteri mengoksidasi senyawa-senyawa anorganik seperti NH3 untuk energi dan menggunakan CO2 sebagai sumber karbon (Jenie dan Rahayu, 1993).

Keragaman mikroba dalam lingkungan habitat air dan air limbah adalah sebagai berikut :

Tabel III. Genus bakteri dalam lingkungan (Vaz-Moreira et al.,2014)

Lingkungan Genus

(36)

Seperti kereaktifan kimia, muatan ion dan hidrofobisitas. Pada pH rendah, protein yang mengandung lisin maupun arginin akan bermuatan positif sedangkan pada pH rendah kelompok protein yang mengandung aspartat, asam glutamat akan bermuatan negatif. Berdasarkan polaritas dan muatannya, ada 8 asam amino bersifat nonpolar dan hidrofobik, 5 diantaranya memiliki gugus hidrokarbon alifatik (alanin, leusin, isoleusin, valin dan prolin), 2 asam amino memiliki cincin aromatis (fenilalanin dan triptofan) dan 1 asam amino mengandung sulfur (metionin). Asam amino non polar ini memiliki profil kelarutan dalam air yang rendah, berbeda dengan asam amino bersifat polar seperti serin, treonin, tirosin, asparagin dan glutamin, sistein serta glisin. Kelarutan asam amino polar di dalam air sangat tinggi karena terjadinya interaksi asam amino dengan hidrogen dalam air. Asam amino bermuatan negatif pada pH 6,0-7,0 mengandung kelompok karboksil yang bersifat asam yaitu asam amino asam, asam aspartat dan asam glutamat. Pada asam amino basa yang mengandung gugus bermuatan positif pada pH 7,0 yaitu lisin, arginin, dan histidindengan tingkat kebasaan yang lemah. Pada pH 6,0 lebih dari 50% histidin terprotonasi sedangkan pada pH 7,0 kurang dari 10% bermuatan positif (Rosenberg, 2005).

(37)

pelarut sehingga dapat dilakukan homogenisasi dalam suatu buffer dan pada akhirnya dipisahkan dengan sentrifugasi (Dennison, 2003).

F. Coomasie Brilliant Blue (CBB)

Gambar 2. Struktur CBB R-250 (Glencross, Ahmed, dan Wang, 2011)

Pengukuran protein total merupakan jenis pengukuran dalam supernatan melalui ekstraksi dan klarifikasi dengan sentrifugasi. Kekurangan dari pengukuran protein total ini adalah variasi protein yang beragam. Metode pengukuran paling akurat yaitu analisis protein dengan hidrolisis, mengubah susunan protein menjadi asam amino yang lebih kecil sehingga dapat dihitung total asam amino. Analisis terhadap protein harus bersifat cepat dan sensitif dan tergantung pada interaksi reagen dengan protein (Ahmed, 2004).

CBB merupakan suatu metode pewarnaan senyawa protein berdasarkan interaksi struktur CBBterhadap protein sehingga protein dapat terwarnai CBB R merupakan golongan coomassie brilliant dye yang memiliki dasar warna merah kecoklatan-biru. Pada analisis protein dengan jumlah kecil dapat dilakukan dengan menggunakan sistem koloidal pada CBB R-250 dengan sensitivitas yang tinggi (Glencross, Ahmed, dan Wang, 2011).

(38)

metode Lowry. Prinsip dari CBB ini mengadakan interaksi dengan struktur protein. Bentuk muatan positif dari CBB ini akan terjadi lebih banyak dalam kondisi asam dan dapat dideteksi pada panjang gelombang maksimal 470 nm. Sebaliknya, dalam kondisi netral, CBB akan dominan dalam bentuk anion (bermuatan negatif) dan akan mengadakan interaksi dengan struktur protein sehingga dapat dideteksi (Kruger, 1994).

Gambar 3. Interaksi protein primer dan CBB (Georgiou et al., 2008)

CBB mengandung gugus sulfonat yang akan bereaksi dengan rantai samping struktur protein yaitu arginine, lysine, dan histidine. Interaksi yang terjadi mengakibatkan warna dari CBB tereduksi (memudar). Ikatan yang terjadi antara protein dengan dye adalah ikatan ionik, elektrostatik, dan van der Waals. Ikatan van der Waals merupakan ikatan yang paling dominan terjadi dalam pewarnaan (Otlets, 2005).

G. Spektrofotometri Sinar Tampak Derivatif

(39)

Metode spektrofotometri derivatif atau metode kurva turunan adalah salah satu metode yang dapat digunakan untuk analisis multikomponen secara langsung tanpa harus melakukan pemisahan terlebih dahulu walaupun dengan panjang gelombang yang berdekatan. Keuntungan dari metode spektrofotometri derivatif adalah spektrum derivatif yang memungkinkan menganalisis multikomponen dalam campuran yang spektranya saling tumpang tindih. Spektrum derivatif memberikan gambaran struktur yang terinci dari spektrum serapan dan gambaran ini makin jelas dari spektra derivatif pertama ke derivatif keempat sehingga dapat dilakukan analisis kuantitatif suatu komponen dalam campuran dengan bahan yang panjang gelombangnya saling berdekatan (Nurhidayati, 2007).

H. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan suatu metode analisis kuantitatif dengan cara memisahkan dan menganalisis analit dari komponen lain dalam matriks sampel dengan bantuan kolom sebagai fase diam dan liquid sebagai fase gerak (Snyder, Kirkland, dan Dolan, 2010).

(40)

terdiri dari signal detektor dan waktu. Fase gerak biasanya terdiri dari beberapa campuran pelarut sehingga memiliki daya elusi dan resolusi yang diinginkan. Daya elusi dan resolusi tersebut ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam dan sifat komponen-komponen sampel (Snyder et al., 2010).

Fase gerak yang digunakan pada HPLC fase terbalik (HPLC-RP) adalah fase gerak yang bersifat polar, contohnya campuran larutan buffer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril atau campuran metanol dengan asetonitril (Gandjar dan Rohman, 2007).

Hal-hal yang perlu dipertimbangkan dalam pemilihan fase gerak, yaitu polaritas, kelarutan analit, stabilitas, pH dan kompatibilitas antar pelarut. Selain itu, fase gerak dapat tercampur dengan baik dan tidak terdapat endapan apabila terdiri dari campuran beberapa pelarut (Kazakevich dan Lobrutto, 2007).

Kolom merupakan bagian yang sangat penting dalam pemisahan komponen-komponen sampel yang terdapat di dalamnya. Oktadesilsilan (C18) dan oktil silica (C8) merupakan fase diam yag paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa dengan kepolaran rendah, sedang maupun tinggi (Gandjar dan Rohman, 2007).

I. Validasi Metode Analisis

(41)

metode analisis yang digunakan untuk kuantifikasi analit dalam matriks bersifat reliable dan reprodusibel untuk mencapai tujuannya (Chan, Lam, Lee, dan Zhang, 2004).

1. Akurasi

Akurasi adalah suatu prosedur analisis untuk melihat kedekatan antara nilai terukur atau nilai yang diperoleh dari hasil pengukuran dengan nilai sebenarnya (Ermer dan Miller, 2005). Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali yang ditentukan dengan melakukan spiking ataupun dengan cara metode penambahan baku (standard addition method) (Gandjar dan Rohman, 2007). Dalam bioanalisis, nilai akurasi dapat dinyatakan dalam % Difference (%D) yaitu perbandingan antara selisih nilai konsentrasi awal dan terukur dengan nilai konsentrasi awal. Kriteria terpenuhi jika %D dibawah 20% (Anonim, 2013).

2. Presisi

Presisi adalah prosedur analisis untuk melihat derajat kesesuaian hasil uji individual dari beberapa penginjeksian suatu seri baku. Presisi diukur sebagai persen Relative Standard Deviation (RSD) (Gandjar dan Rohman, 2007). Nilai RSD yang diperbolehkan adalah kurang dari 20% (Anonim, 2013).

3. Linieritas

(42)

linieritas yang baik jika nilai koefisien korelasri (r) > 0,99 atau r2 >0,997 (Chan et al., 2004). Pada sumber lain mengatakan bahwa nilai koefisien korelasi (r2) yang baik adalah lebih tinggi dari 0,995 (Anonim, 2013).

4. Selektivitas

Selektivitas adalah kemampuan suatu metode analisis untuk mengukur dan membedakan dengan akurat respon analit dengan seluruh komponen sampel yag mungkin ada dalam matriks sampel (Chan et a.l, 2004).

5. Kriteria validasi

Kriteria validasi untuk bioanalisis meliputi akurasi, presisi, LOQ, dan linearitas serta pembandingan kurva baku solven dan kurva adisi (Anonim, 2013).

J. Landasan Teori

(43)

Selain mikroba patogen, yang tumbuh dalam media air adalah mikroba normal air. Keberadaan mikroba normal air berkontribusi baik dalam penanganan limbah atau penumpukkan bahan organik dalam air sehingga kualitas air terjaga. Tetrasiklin merupakan senyawa antimikroba dengan spektrum luas, yaitu dapat menghambat pertumbuhan beragam jenis mikroba yang ada di alam, baik mikroba patogen maupun mikroba normal air.Jumlah mikroba normal maupun patogen ditentukan dengan melihat populasi mikroba dalam air.

Mikroba dapat merombak bahan organik seperti protein menjadi senyawa lebih sederhana. Penambahan populasi mikroba akan menanggulangi bahan organik yang ada di habitat lobster sehingga kualitas air terjaga. Analisis kandungan protein dilakukan dengan metode CBB R dan spektrofotometri sinar tampak derivatif. Metode CBB ini menggunakan reagen coomassie brilliant blue dengan mekanisme pembentukkan warna terhadap protein primer. Protein akan berinteraksi dengan reagen sehingga larutan protein menjadi berwarna, hal ini menunjukkan banyaknya ikatan peptida yang terjadi. Metode spektrofotometri sinar tampak ini digunakan untuk melihat absorbansi kompleks protein berwarna dengan interval panjang gelombang cahaya visible (400-800 nm).

(44)

presisi serta sensitivitas. Mengetahui pengaruh pakan berantibiotik padajumlah populasi mikroba air,kadar protein sedimen, laju pertumbuhan lobster, dan adanya kadar akumulasi tetrasiklin dalam daging dilakukan perbandingan antara perlakuan dan kontrol yang diplotkan dalam grafik versus hari perlakuan.

K. Hipotesis

1. Pakan berantibiotik menyebabkan penurunan jumlah populasi mikroba dalam habitat air lobster air tawar.

2. Pakan berantibiotik menyebabkan peningkatan kadar protein dalam sedimen lobster air tawar.

3. Pakan berantibiotik menyebabkan peningkatan laju pertumbuhan lobster air tawar.

(45)

22

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian berjudul “Pengaruh Pemberian Pakan Berantibiotik Pada

Populasi Mikroba Air, Kadar Protein Sedimen dan Akumulasi Tetrasiklin Dengan Menggunakan Pengembangan Metode Analisis Tetrasiklin Serta Pengaruhnya Pada Laju Pertumbuhan Lobster Air Tawar (Cherax Quadricarinatus)” merupakan penelitian eksperimental murni dengan membandingkan kurva hubungan lama perlakuan dengan respon antara kelompok kontrol dan perlakuan untuk melihat pengaruh yang disebabkan oleh tetrasiklin dalam pakan terhadap kualitas habitat dan laju pertumbuhan lobster air tawar.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

1. Variabel Penelitian

a. Variabel utama

1) Variabel bebas : lama pemberian pakan berantibiotik

2) Variabel tergantung : jumlah populasi mikroba dalam air, jumlah protein dalam sedimen, panjang lobster, berat lobster dan jumlah TCH dalam daging lobster

b. Variabel pengacau

1) Variabel terkendali : volume air, cahaya matahari, kandungan klor, kesadahan air, pH air dan oksigen terlarut dalam air.

(46)

2. Definisi Operasional

a. Pakan berantibiotik merupakan pakan lobster yang telah dimodifikasi dengan menambahkan tetrasiklin HCl ke dalam sediaan pakan.

b. Lobster air tawarcrayfish (Cherax quadricarinatus) merupakan hewan golongan Crustaceae yang hidup di perairan tawar dan dalam penelitian digunakan sebagai hewan uji dengan kriteria yang ditentukan.

c. Rumah lobster merupakan pipa yang disusun dan diikat berjajar dan digunakan sebagai tempat perlindungan untuk lobster, dibuat dari pipa dengan panjang 6 cm dan diameter 2,5 cm sebanyak 8 pipa..

d. Aerasi merupakan sistem sirkulasi udara dari luar ke dalam air dengan bantuan alat pompa elektrik dan selang.

e. Budidaya permodelan merupakan metode budidaya lobster dengan merekayasa pembiakan yaitu memberikan sedimen dan rumah lobster serta aerasi yang cukup sebagai tempat hidup lobster.

f. Sedimen merupakan suatu masa padat yang berasal dari sisa pakan maupun hasil ekskresi dari lobster air tawar crayfish yang mengendap di dasar akuarium.

g. Kelompok kontrol merupakan populasi lobster yang diberi perlakuan pakan tanpa antibiotik.

(47)

i. Panjang dan berat lobster merupakan parameter yang diukur pertumbuhan lobster, diukur dari kepala hingga ekor (panjang).

j. Populasi mikroba merupakan jumlah koloni mikroba yang ditentukan dalam satuan cfu/cm2.

C. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sedimen lobster air tawar, pakan lobster merek Bintang®, standar tetrasiklinHCl (kualitas p.a, China), antibiotik tetrasiklin HCl merek Tetrasanbe®, lobster air tawar jenis crayfish (Cherax quadricarinatus), air sumur dengan kriteria (kesadahan 53 ppm, oksigen terlarut 7-8 ppm, suhu 25,5°C, pH 6), reagen coomasie brilliant blue R-250 (kualitas p.a, Germany), phosphate buffer saline (PBS) pH 7 (NaCl, KCl, Na2HPO4, dan K2HPO4), metanol (grade HPLC), etanol (kualitas p.a), akuabides, NaOH (kualitas p.a), HCl (kualitas p.a), standar bouvine serum albumine (kualitas p.a, Germany), daging lobster air tawar jenis crayfish, buffer McIlvainepH 4 (7,71 ml larutan Na2HPO4 0,2 N dalam 12,29 ml asam sitrat0,1 N), asetonitril (grade HPLC).

D. Alat Penelitian

(48)

macropipette, flakon, pompa vacuum, corong Buchner, labu hisap, pH stick universal, cawan porselen, stamper, mortir, kertas saring, oven, vortex, centrifuge, milipore, degasser, spectrophotometer Visible SHIMADZU (UV-1800), rotary evaporator, High Performance Liquid Chromatography merek SHIMADZU (kolom C18).

E. Tata Cara Penelitian

1. Tahap preparasi lobster dan habitat

a. Persiapan alat dan bahan

Sebanyak 12 buah akuarium (60 x 30 x 50 cm) disiapkan dalam tempat terhindar dari cahaya. Lobster air tawar spesies Cherax quadricarinatus didapatkan dari peternak lobster Godean Yogyakarta dengan kriteria usia 3 bulan, panjang 5-5,5 cm dan berat 3-3,5 gram. Sedimen didapatkan dari peternak lobster air tawar Godean Yogyakarta.

b. Determinasi lobster

(49)

c. Preparasi habitat lobster

Sedimen yang terkumpul dihomogenkan dan ditimbang sebanyak 100 gram, lalu dimasukkan dalam akuarium dan diisi air sumur setinggi 10 cm dari dasar akuarium(setara 14 liter). Rumah lobster dan aerator dimasukkan dalam akuarium (1 rumah dan aerator/akuarium). Lobster air tawar dimasukkan dalam akuarium (15 ekor/akuarium). Media ini selanjutnya digunakan untuk pemeliharaan lobster.

2. Tahap preparasi pakan lobster

a. Penetapan kadar tetrasiklin HCl (TCH) dalam kapsul Tetrasanbe® 1) Pembuatan stok standar TCH 1 mg/ml

Sebanyak 100 mg standar TCH ditimbang dan dimasukkan dalam labu takar 100 ml ditambahkan akuabides hingga batas tanda.

2) Validasi metode

(50)

3) Preparasi sampel kapsul

Sebanyak 10 kapsul TCH 500 mg dibuka dan dikeluarkan serbuknya, ditimbang kemudian digerus dan dihomogenkan dalam mortir. Sebanyak 25 mg sampel TCH ditimbang dan dimasukkan dalam labu takar 100 ml dan ditambahkan akuabides hingga batas tanda.

4) Penetapan kadar TCH dengan spektrofotometri uv

Blanko dibuat dari seluruh pelarut yang digunakan tanpa zat analit. Blanko dimasukkan dalam kuvet, dilakukan baseline terhadap spektrofotometri uv. Sampel dideteksi absorbansi dengan spektrofotometri uv pada spektrum 200-400 nm, dilakukan replikasi 3 kali pada sampel.

b. Optimasi dosis TCH

(51)

populasi mikroba oleh Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta dengan metode perhitungan jumlah mikroba (cfu).

c. Pembuatan dan pola pemberian pakan berantibiotik 1) Pembuatan pakan berantibiotik

Berdasarkan prosentase pakan lengkap dengan berat udang 3-15 gram maka diberikan adalah 8-4%. Sesuai dengan berat lobster, digunakan prosentase sebesar 4% sehingga jumlah pakan lobster diberikan sebanyak 1,8 gram/hari. Selanjutnya jumlah pakan ini digunakan untuk membuat dosis pakan selama 5 hari. Sebanyak 0,2025 gram TCH ditimbang dan dilarutkan dalam akuabides sebanyak 25 ml dalam labu takar. Sebanyak 45 gram pakan lobster dilakukan penyemprotan dengan larutan TCH secara merata. Setelah penyemprotan, pelet pakan lobster dikering udarakan hingga kering (± 3jam) dengan menggunakan fan, dihindarkan dari cahaya.

2) Frekuensi pemberian pakan

Pakan mengandung tetrasiklin diberikan pada lobster 3 kali sehari yaitu pada pagi hari 0,45 gram (25%), sore hari 0,45 gram (25%) dan malam hari 0,9 gram (50%).

3. Tahap persiapankelompok kontrol dan kelompok perlakuan

a. Pembuatan kelompok kontrol

(52)

dengan lama pemberian 3 hari, 5 hari, 7 hari, 14 hari dan 28 hari. Pemberian pakan dilakukan 3 kali dalam sehari dengan jumlah pakan 25% pada pagi dan sore serta 50% pada malam hari.

b. Pembuatan kelompok perlakuan

Perlakuan pada 6 akuarium yaitu 1 akuarium sebagai blangko (0 hari) dan 5 perlakuan pemberian pakan berantibiotik dengan lama pemberian 3 hari, 5 hari, 7 hari, 14 hari dan 28 hari. Pemberian pakan berantibiotik dilakukan 3 kali dalam sehari dengan jumlah pakan 25% pada pagi dan sore serta 50% pada malam hari.

4. Tahap preparasi analit

a. Ekstraksi protein dalam sedimen

(53)

b. Ekstraksi tetrasiklin dalam daging lobster 1) Preparasi sampel ekstrak daging

Lobster pada perlakuan hari ke 14 (13,12 gram) dan 28 (9,02 gram) diambil daging pada abdomen dan dibersihkan dari cangkang kulit lobster. Daging dihaluskan menggunakan mortir dan ditimbang. Daging halus dimasukkan dalam campuran HCl dan akuabides dengan perbandingan 1 : 1 sebanyak 40 ml. Sampel ditutup dan disimpan dalam suhu rendah dan terhindar dari cahaya matahari. 2) Ekstraksi tetrasiklin

Ekstrak daging divortex dan diambil sebanyak 5 ml lalu disentrifuge 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil sebanyak 0,5 ml dimasukkan dalam flakon dan ditambahkan 3 ml asetonitril; 1,5 ml buffer McIlvaine; 1 ml NaOH (pH 4) kemudian divortex dan dievaporasi hingga asetonitril menguap seluruhnya (2 jam). Hasil evaporasi dimasukkan dalam labu takar 5 ml dan ditambahkan buffer McIlvaine hingga tanda batas. Sampel ini selanjutnya dipreparasi untuk deteksi dengan metode HPLC.

5. Tahap persiapan metode penetapan kadar

a. Metode penetapan kadar protein dalam sedimen

(54)

b. Metode penetapan kadar tetrasiklin

1) Orientasi panjang gelombang tetrasiklin

Standar tetrasiklin HCl (TCH) ditimbang sebanyak 50 mg dan dilarutkan dalam HCl : akuabides (1:1) ditambahkan hingga tanda batas dalam labu takar 10 ml. Larutan TCH sebanyak 0,5 ml diekstraksi. Kemudian hasil ekstraksi disaring dengan milipore dan dilakukan degassing lalu dicek absorbansi dengan spektrofotometri uv dengan interval panjang gelombang 200-400 nm.

2) Penentuan puncak tetrasiklin a) Pembuatan larutan blangko

Larutan HCl : akuabides (1:1) disiapkan sebanyak 5 ml, diambil 0,5 ml lalu diberi perlakuan ekstraksi sama seperti perlakuan sampel.

b) Pembuatan larutan standar TCH

Larutan TCH 0,2 ppm dalam asetonitril : buffer McIlvaine disiapkan dan dideteksi dengan menggunakan HPLC. c) Pembuatan larutan standarTC

Larutan standar TCH dalam HCl : akuabides disiapkan dan diekstraksi hingga didapat konsentrasi 0,2 ppm dan dideteksi dengan menggunakan HPLC.

(55)

(1) Fase diam : kolom C18 (oktadesil silika) (2) Detektor : uv-sinar tampak

(3) Fase gerak :

(a) Asetonitril : buffer McIlvaine (pH 4) 50:50%

(b) Metahol : buffer McIlvaine (pH 4; asam sitrat dan natrium bifosfat) 50:50%

(4) Panjang gelombang : 270 nm (hasil orientasi) (5) Flow rate : 0,5 ml/menit

b) Pembuatan fase gerak

(1) Pembuatan metanol : buffer McIlvaine (pH 4)

Fase gerak dan pelarut yang digunakan adalah hasil optimasi fase gerak yaitu campuran metanol dan buffer McIlvaine dengan perbandingan 50:50% v/v. Metanol dan buffer McIlvaine yang telah dibuat, masing-masing disaring menggunakan solvent membrane filter sesuai sifat pelarut dengan bantuan pompa vakum. Kemudian diletakkan dalam chamber fase gerak HPLC lalu dilakukan proses degassing menggunakan ultrasonikator selama 15 menit.

(2) Pembuatan asetonitril : buffer McIlvaine (pH 4)

(56)

McIlvaine yang telah dibuat, masing-masing disaring menggunakan solvent membrane filter sesuai sifat pelarut dengan bantuan pompa vakum. Kemudian diletakkan dalam chamber fase gerak HPLC lalu dilakukan proses degassing menggunakan ultrasonikator selama 15 menit.

c) Persiapan instrumen HPLC

Kolom HPLC dicuci dengan menggunakan metanol (HPLC grade) selama 1 jam kemudian dilakukan conditioning dengan fase gerak selama 1 jam dan dicek baseline hingga kolom siap digunakan. Vial berisi standar TCH 20 ppm dimasukkan dalam tray dan dicek AUC menggunakan HPLC detektor UV dengan waktu elusi 13 menit.

6. Tahap validasi metode penetapan kadar

a. Validasi spektrofotometri sinar tampak derivatif 1) Linearitas

a) Pembuatan stok albumin (BSA) 40 mg/ml

Sebanyak 2 gram albumin (BSA) dimasukkan dalam labu takar 50 ml dan ditambahkan PBS hingga tanda batas.

b) Pembuatan seri baku albumin (BSA)

(57)

hingga tanda batas. Konsentrasi dibuat 0,80; 1,20; 1,60; 2,00; 2,40; 2,80; 3,40; 3,60; dan 4,00 mg/ml.

c) Analisis dengan spektrofotometri sinar tampak derivatif

Sebanyak 1 ml diambil dari setiap seri baku dimasukkan dalam labu takar 5 ml dan ditambahkan reagen CBB hingga tanda batas dan ditunggu selama 15 menit. Sampel dicek spektrum dengan menggunakan spektrofotometri sinar tampak pada 400-800 nm.

d) Pembuatan kurva baku solven

Hasil spektrum yang keluar setiap seri baku dilakukan derivatisasi kedua. Setiap konsentrasi pada hasil spektrum derivatisasi diplotkan dan dicari nilai r dari persamaan regresi liniernya.

2) Pembuatan kurva adisi

(58)

3) Akurasi

Akurasi dinyatakan dalam bentuk %D dari kurva adisi. Nilai %D yang baik adalah kurang dari 20%

4) Presisi

Presisi didapatkan dari kurva adisi yang direplikasi sebanyak 3 kali dan dihitung %RSD. Nilai %RSD yang baik adalah kurang dari 20% 5) Limit Of Quantification (LOQ)

LOQ didapatkan dari kurva adisi dengan menggunakan rumus : LOQ = 3,3 x SD/slope

b. Validasi metode HPLC 1) Linearitas

a) Pembuatan stok tetrasiklinHCl (TCH) 500 ppm

Sebanyak 5 mg TCH dimasukkan dalam labu takar 10 ml dan ditambahkan HCl : akuabides (1:1) hingga tanda batas.

b) Pembuatan seri TC

(59)

c) Analisis dengan HPLC

Setiap seri baku dimasukkan dalam vial HPLC. Sampel dicek dengan menggunakan HPLCdengan kondisi optimasi.

d) Pembuatan kurva baku solven

Hasil kromatogram berupa AUC pada pengecekan seri baku diplotkan dan dicari nilai r serta persamaan regresi liniernya y = bx+a.

2) Pembuatan kurva adisi a) Pembuatan seri TC

Daging lobster bebas tetrasiklin dihaluskan dengan menggunakan mortar dan stamper. Daging ditimbang masing-masing 1 gram dimasukkan dalam flakon A, B, C, D, E. Sebanyak 20, 100, 300, 700, 1000 µl dari stok TCH 500 ppm dimasukkan dalam flakon B, C, D , E. HCl : akuabides (1:1) ditambahkan sebanyak 4980 (A), 4900 (B), 4700(C), 4300(D), 4000(E) µl dengan micropipette ke dalam flakon.

b) Analisis tetrasiklindengan HPLC

(60)

5 ml ditambahkan buffer hingga batas tanda. Larutan disaring dengan milipore dan dilakukan degassing untuk diinjeksikan ke HPLC.

c) Pembuatan kurva adisi

Hasil kromatogram berupa AUC pada pengecekan seri adisi diplotkan dan dicari nilai r serta persamaan regresi liniernya y = bx+a. Kurva adisi dibandingkan dengan kurva baku solven. 3) Akurasi

Akurasi didapatkan dari perhitungan %D kurva adisi. 4) Presisi

Presisi didapat dari perhitungan %RSD 3 replikasi kurva adisi. 5) Selektivitas

Selektivitas dilihat dari nilai resolusi pada pengecekan AUC kurva adisi.

6) Limit Of Quantification (LOQ)

LOQ didapatkan dari kurva adisi dengan menggunakan rumus : LOQ = 3,3 x SD/slope

7. Analisis sampel

a. Analisis kuantitatif jumlah populasi mikroba pada sampel air

1) Preparasi sampel air kelompok kontrol dan kelompok perlakuan a) Sampling air dilakuakan pada pukul 06.00 WIB. Air dalam

(61)

hingga partikel sedimen mengendap kemudian dilakukan pengambilan air, 2 cm diatas sedimen secara random dengan spuit yang telah dimodifikasi (100 ml), dimasukkan dalam botol steril yang disediakan oleh Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta.

b) Penetapan jumlah populasi mikroba dilakukan oleh Bagian Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta dengan menggunakan metode perhitungan jumlah mikroba (cfu) dengan colony counter.

b. Analisis kuantitatif protein pada sampel sedimen 1) Preparasi NaOH 0,1 N dan HCl 2,5 N

NaOH (kualitas p.a) ditimbang sebanyak 0,4 gram, ditambahkan akuabides dalam labu takar 100 ml hingga batas tanda. HCl (kualitas p.a) diambil 2,083 ml diencerkan dengan akuabides dalam labu takar 10 ml hingga batas tanda.

2) Preparasi phosphate buffer saline(PBS)

Sebanyak 4 gram NaCl, 0,2 gram KCl, 0,72 gram Na2HPO4, dan 0,12 gram KH2PO4 ditimbang dan dimasukkan dalam labu takar 500 ml, ditambahkan akuabides hingga tanda batas.

3) Preparasi reagen coomasie brilliant blue

(62)

dimasukkan dalam labu takar 100 ml. Ditambahkan 8 ml PBS dan 3,75 ml etanol kemudian ditambahkan akuabides hingga tanda batas. 4) Preparasi protein dalam sedimen

Air akuarium didekantir dan sedimen diambil seluruhnya, dimasukkan dalam botol sampel. Sedimen disaring menggunakan corong Buchner dan pompa vacuum hingga kering. Sedimen kering dimasukkan dalam mortir dan digerus dengan stamper hingga homogen. Sedimen ditimbang sebanyak 0,2 gram dimasukkan dalam flakon dan ditambahkan NaOH 0,1 N sebanyak 6 ml dengan menggunakan makropipet. Campuran diaduk dan divortex hingga homogen lalu dimasukkan dalam oven dengan suhu 600C, ditunggu selama 2 jam. Setelah 2 jam, dikeluarkan dari oven dan disentrifuge dengan kecepatan putar 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil sebanyak 4 ml ditambahkan HCl 2,5 N hingga pH 7-8 kemudian dimasukkan dalam labu takar 5 ml ditambahkan PBS hingga tanda batas.

5) Analisis kuantitatif protein

(63)

dilakukan operating time hingga 15 menit. Setelah 15 menit, campuran dimasukkan dalam kuvet dan dicek absorbansi dengan spektrofotometer sinar tampakpada spektrum 400-800 nm. Spektra yang keluar diderivatisasi level kedua kemudian dilakukan pengukuran tinggi puncak derivat.

c. Pengukuran panjang dan berat lobster

Lobster yang ada dalam akuarium dikeluarkan seluruhnya dan ditimbang berat serta diukur panjangnya. Pengukuran berat dengan menggunakan timbangan analitik dan pengukuran panjang dengan mengukur dari ujung kepala sampai ekor. Kelompok kontrol dan perlakuan dibandingkan nilai slope dari kurva hubungan hari perlakuan dengan selisih panjang dan berat lobster hari ke 0.

d. Analisis kuantitatif tetrasiklin dalam daging lobster

(64)

milipore dan dilakukan degassing selama 5 menit lalu dimasukkan dalam vial. Sampel dideteksi dengan HPLC.

F. Analisis Hasil

1. Validasi metode spektrofotometri uv

a. Linearitas. Linearitas ditentukan dari koefisien korelasi (r) yang diperoleh dari absorbansi tetrasiklin HCl dari data penentuan kurva baku dalam regresi linear.

b. Akurasi. Akurasi dapat dihitung dengan rumus :

%D = (C terhitung – C diketahui) / C terhitung x 100% c. Presisi. Presisi dapat dihitung dengan rumus :

%RSD = SD / rata-rata x 100%

d. Sensitivitas. Sensitivitas alat dapat ditentukan dengan menghitung LOD dicari dengan rumus 3,3 x SD/slope dan LOQ dengan 10 x SD/slope.

2. Validasi metodespektrofotometri sinar tampak derivatif

a. Linearitas. Linearitas ditentukan dari koefisien korelasi (r) yang diperoleh dari tinggi derivat spektrum protein (BSA) dari data penentuan kurva baku dalam regresi linear.

b. Akurasi. Akurasi dapat dihitung dengan rumus :

% D = [C diketahui – C terhitung] / C diketahui x 100% c. Presisi. Presisi dapat dihitung dengan rumus :

(65)

d. Sensitivitas. Sensitivitas dapat dicari dengan menghitung LOQ (konsentrasi terkecil kurva adisi yang masih bisa terkuantifikasi baik).

3. Validasi metode HPLC

a. Linearitas. Linearitas ditentukan dari koefisien korelasi (r) yang diperoleh dari data AUC penentuan kurva baku ke dalam regresi linear. b. Akurasi. Akurasi dapat dihitung dengan rumus :

%D = [C diketahui-C terhitung] / C diketahui x 100%. c. Presisi. Presisi dapat dihitung dengan rumus :

%RSD = SD / rata-rata x 100%.

d. Sensitivitas. Sensitivitas dicari dengan menghitung LOQ (konsentrasi terkecil pada kurva adisi yang masih dapat terkuantifikasi baik).

4. Analisis jumlah populasi mikroba air

(66)

5. Analisis protein dengan metode CBB dan spektrofotometri sinar tampak

derivatif

a. Hitung kadar protein. Kadar protein dihitung dengan memasukkan respon tinggi derivat dalam persamaan regresi linear y = bx+a, lalu dikalikan faktor pengenceran sehingga didapatkan konsentrasi dalam gram sedimen. b. Evaluasi hasil. Evaluasi hasil didapat dari perbandingan kurva hari

perlakuan versus selisih kadar protein kelompok (kontrol dan perlakuan) dan kadar protein hari ke 0. Slope dari kurva kelompok kontrol dan perlakuan dicari dan dibandingkan.

6. Penentuan panjang dan berat lobster (pertumbuhan lobster)

(67)

b. Berat lobster. Data berat lobster diolah dengan membandingkan slope kurva hubungan hari perlakuan dengan selisih panjang kelompok (kontrol dan perlakuan) dengan lobster hari ke 0 kelompok kontrol dan perlakuan. Slope kurva kelompok kontrol dan kelompok perlakuan dicari dan dilakukan perbandingan.

7. Penetapan kadar tetrasiklin dalam daging

Kadar tetrasiklin dihitung dengan memasukkan respon AUC dalam persamaan regresi linear y = bx+a, lalu dikalikan faktor pengenceran sehingga didapatkan konsentrasi awal dalam daging.

(68)

(69)

46

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui pengaruh tetrasiklin (antibiotik) dalam pakan terhadap perkembangan lobster air tawar dalam habitat hidup lobster dibandingkan dengan kontrol dalam jangka waktu tertentu. Ada empat parameter yang diteliti dalam penelitian ini, meliputi jumlah populasi mikroba dalam air, kandungan protein dalam sedimen, panjang dan berat lobster serta penetapan kadar tetrasiklin dalam daging lobster sebagai indikator adanya akumulasi. Penelitian ini diawali dengan persiapan habitat dan pakan serta pembagian kelompok lobster.

A. Tahap Persiapan Habitat Lobster Air Tawar