BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
F. Tata Cara Penelitian
F. Tata Cara Penelitian 1. Identifikasi/determinasi daun senggani
Determinasi daun senggani dilakukan oleh BPTO Tawangmangu, Jawa Tengah sebagai pihak yang menyediakan daun senggani. Surat pengambilan dan determinasi daun senggani dari BPTO dapat dilihat pada lampiran 22.
2. Pembuatan ekstrak petroleum eter daun senggani
Serbuk daun senggani 100 g direndam dengan menggunakan larutan petroleum eter di dalam Erlenmeyer selama 24 jam. Setelah 24 jam, serbuk yang telah direndam, dipindahkan ke dalam alat perkolator. Perkolasi dilakukan dengan menggunakan larutan petroleum eter. Kecepatan penetesan larutan penyari adalah 20 tetes per menit, dan perkolasi dihentikan jika perkolat yang diperoleh sudah tidak berwarna lagi. Pengentalan perkolat dilakukan dengan menggunakan bantuan alat evaporator dan waterbath. Pengenceran ekstrak petroleum eter daun senggani sampai dengan konsentrasi yang diinginkan menggunakan minyak kelapa sawit.
3. Persiapan hewan uji
Hewan uji yang dibutuhkan adalah delapan puluh tiga ekor mencit betina. Delapan puluh tiga ekor mencit dibagi 2 kelompok. Kelompok pertama untuk uji pendahuluan 48 ekor, dan kelompok kedua sebanyak 40 ekor untuk perlakuan. Sebelum digunakan hewan uji dipuasakan selama dua puluh empat jam tanpa menghentikan pemberian minum.
a. Dua belas ekor untuk uji pendahuluan waktu pemotongan kaki setelah injeksi karagenin 1 %.
b. Dua belas ekor untuk uji pendahuluan pemberian dosis efektif diklofenak- Na (dalam 4 peringkat dosis).
c. Dua belas ekor untuk uji pendahuluan waktu pemberian dosis natrium diklofenak dengan dosis efektif.
d. Dua belas ekor untuk uji pendahuluan waktu pemberian ektrak petroleum eter daun senggani.
e. Empat puluh ekor untuk perlakuan kontrol negatif karagenin 1%, kontrol negatif CMC-Na 1%, kontrol negatif minyak kelapa sawit, kontrol positif natrium diklofenak dan kelompok perlakuan ektrak petroleum eter daun senggani dalam empat peringkat dosis masing-masing lima ekor.
4. Pembuatan suspensi karagenin 1 %
Timbang 100 mg karagenin, kemudian larutkan dalam 10 ml larutan NaCl fisiologis dan diaduk sehingga diperoleh konsentrasi suspensi karagenin 1%. Agar bisa digunakan kembali, suspensi karagenin disimpan dalam freezer.
5. Pembuatan CMC-Na 1%
Timbang 1 g CMC-Na, disuspensikan sampai 100 ml dengan aquadest hangat, kemudian aduk sampai homogen.
6. Pembuatan larutan natrium diklofenak
Ditimbang seksama sejumlah natrium diklofenak dan dilarutkan dalam CMC-Na 1% sampai diperoleh konsentrasi tertentu berdasar uji pendahuluan dosis.
CMC-Na 1% dalam kondisi masih hangat sangat membantu kelarutan natrium diklofenak.
7. Pembuatan suspensi ekstrak petroleum eter daun senggani
Menimbang sejumlah 2,5 g ekstrak petroleum eter daun senggani kemudian dilarutkan dalam minyak kelapa sawit. Setelah itu, tambahkan minyak kelapa sawit sampai diperoleh volume 50 ml
8. Penetapan dosis
a. Karagenin 1%
Menurut Williamson (1996), konsentrasi karagenin yang digunakan pada mencit adalah 1% dengan volume 0,05 ml. 0,05 ml karagenin 1% adalah volume pemberian untuk mencit dengan berat 20 g sehingga dosis bisa dicari dengan
rumus: V ml = ml mg C kg BB X kgBB mg D / / 0,05 ml = ml mg kg X kgBB mg D / 10 02 , 0 / D = 25 mg/kg BB dan V = {2,5 x BB kg} ml b. Natrium diklofenak
Dosis yang digunakan berdasarkan dosis natrium diklofenak yang pernah digunakan pada penelitian anti inflamasi yang sudah pernah dilakukan yaitu 9,75 mg/kg BB; 10,79 mg/kg BB, dan 11,95 mg/kg BB (Novita, 2003). Dosis ini berdasarkan dosis pemakaian natrium diklofenak pada manusia sebesar 75-150 mg/70kgBB. Dosis pada manusia tersebut dikonversikan ke mencit 20g dengan faktor konversi sebesar 0,0026. Contoh perhitungannya :
konversi ke mencit 20 gBB = 75,00 mg/70kgBB x 0,0026 = 0,1950 mg/20 gBB
= 9,75 mg/kgBB Dosis II : untuk manusia 70 kgBB = 83,04 mg
konversi ke mencit 20 gBB = 83,04 mg/70kgBB x 0,0026 = 0,2195 mg/20 gBB
= 10,79 mg/kgBB Dosis III : untuk manusia 70 kgBB = 91,92 mg
konversi ke mencit 20 gBB = 91,92 mg/70kgBB x 0,0026 = 0,2390 mg/20 gBB
= 11,95 mg/kgBB c. CMC-Na 1%
Sebagai kontrol negatif CMC 1% diberikan secara per oral, dan volume pemberian maksimal pada mencit adalah 1ml, diketahui berat mencit maksimal dalam penelitian ini adalah 30 g sehingga bisa dihitung dengan rumus:
V ml = ml mg C kg BB X kgBB mg D / / 1 ml = ml mg kg X kgBB mg D / 10 03 , 0 / D = 333,3 mg/kg BB dan V = {33,3 x BB kg} ml d. Ekstrak petroleum eter daun senggani
Peringkat dosis yang digunakan mengikuti peringkat dosis pada penelitian Riadiani (2006). Adapun peringkat dosis tersebut adalah 850 mg/kg BB, 1000 mg/kg BB, 1330 mg/kg BB, dan 1670 mg/kg BB.
9. Uji pendahuluan rentang waktu pemotongan kaki setelah injeksi karagenin
Hewan uji dibagi dalam empat kelompok, tiap kelompok terdiri dari 3 ekor, diberi perlakuan pada kaki kiri bagian belakang diinjeksi 0,05 ml suspensi karagenin 1% secara subplantar dengan kaki kanan hanya diinjeksi dengan spuit injeksi sublantar tanpa suspensi karagenin 1%. Selanjutnya tiap kelompok hewan uji dikurbankan pada selang waktu tertentu, yaitu 1, 2, 3, dan 4 jam setelah injeksi karagenin subplantar, dan kadua kaki belakangnya dipotong pada sendi torsocrural
kemudian ditimbang.Waktu yang menunjukkan bobot udema paling besar dijadikan acuan untuk perlakuan dengan karagenin 1% selanjutnya.
10. Uji pendahuluan dosis efektif natrium diklofenak
Hewan uji dibagi tiga kelompok, tiap kelompok 3 ekor,diberi perlakuan natrium diklofenak peroral dengan dosis yang berbeda, kelompok I dengan dosis 9,75 mg/kgBB; dan kelompok II dengan dosis 10,795 mg/kgBB dan kelompok III dengan dosis 11,95 mg/kg BB. Kemudian kaki kiri bagian belakang diinjeksi 0,05 ml suspensi karagenin 1% subplantar, sedangkan kaki kanan bagian belakang hanya disuntik dengan spuit injeksi secara subplantar tanpa suspensi karagenin 1%. Setelah beberapa lama, mencit dikurbankan, kedua kaki belakang dipotong pada sendi
torsocrural kemudian ditimbang. Dosis yang menunjukkan bobot udema paling kecil adalah dosis efektif dari natrium diklofenak.
11. Uji pendahuluan waktu pemberian natrium diklofenak dengan dosis efektif
Hewan uji dibagi dalam empat kelompok, tiap kelompok terdiri tiga ekor dan diberi perlakuan dengan dosis efektif natrium diklofenak secara per oral, dalam rentang waktu tertentu, yaitu 15, 30, 45 dan 60 menit. Kemudian kaki kiri bagian
belakang diinjeksi 0,05 ml suspensi karagenin 1% subplantar, kaki kanan bagian belakang disuntik dengan spuit injeksi secara subplantar tanpa suspensi karagenin 1%. Beberapa lama kemudian (berdasar uji pendahuluan waktu karagenin) mencit dikurbankan, kedua kaki belakangnya dipotong pada sendi torsocrural kemudian ditimbang. Waktu yang menunjukkan bobot udema paling kecil dijadikan sebagai acuan untuk perlakuan dengan dosis efektif natrium diklofenak selanjutnya.
12. Uji pendahuluan waktu pemberian ektrak petroleumeter daun senggani
Uji ini tidak dilakukan karena waktu pemberian ekstrak petroleum eter mengikuti waktu pemberian ekstrak etanol daun senggani pada penelitian Prianinggrum (2006) yaitu 30 menit sebelum injeksi karagenin.
13. Perlakuan hewan uji
Tiga puluh lima ekor mencit dibagi secara acak menjadi 7 kelompok. Setiap kelompok terdiri dari lima ekor dengan perlakuan sbb:
a. kelompok I (kelompok kontrol karagenin 1%)
Kaki kiri bagian belakang mencit diinjeksi dengan 0,05 ml suspensi karagenin 1% subplantar sedangkan kaki kanan bagian belakang hanya disuntik subplantar tanpa karagenin. Setelah beberapa lama (berdasar uji pendahuluan) kedua kaki dipotong pada sendi torsocrural dan ditimbang.
b. kelompok II (kelompok kontrol CMC-Na 1%)
CMC-Na 1% diberikan secara per oral pada mencit dan setelah beberapa waktu (berdasar uji pendahuluan waktu pemberian natrium diklofenak) kaki kiri bagian belakang mencit diinjeksi dengan 0,05 ml suspensi karagenin 1% subplantar sedangkan kaki kanan bagian belakang hanya disuntik
subplantar tanpa karagenin, kemudian kedua kaki dipotong pada sendi
torsocrural dan ditimbang.
c. kelompok III (kelompok kontrol minyak kelapa sawit)
Minyak kelapa sawit diberikan secara per oral pada mencit dan setelah 30 menit (berdasar uji pendahuluan waktu pemberian ekstrak petroleum eter daun senggani) kaki kiri bagian belakang mencit diinjeksi dengan 0,05 ml suspensi karagenin 1% subplantar sedangkan kaki kanan bagian belakang hanya disuntik subplantar tanpa karagenin, kemudian kedua kaki dipotong pada sendi
torsocrural dan ditimbang.
d. kelompok IV ( kelompok kontrol natrium diklofenak)
Mencit diberi perlakuan per oral natrium diklofenak dengan dosis sesuai orientasi dan setelah beberapa waktu (berdasar orientasi) kaki kiri bagian belakang mencit diinjeksi dengan 0,05 ml suspensi karagenin 1% subplantar sedangkan kaki kanan bagian belakang hanya disuntik subplantar tanpa karagenin, kemudian kedua kaki dipotong pada sendi torsocrural dan ditimbang.
e. kelompok perlakuan ekstrak petroleum eter daun senggani
Terdiri dari empat kelompok perlakuan yang diberikan 4 dosis ekstrak petroleum eter daun senggani yang berbeda secara per oral. Setelah beberapa waktu (berdasar uji pendahuluan waktu pemberian ekstrak petroleum eter daun senggani) masing-masing kelompok diinjeksi 0,05 ml karagenin 1% subplantar pada kaki kiri belakang sedangkan kaki kanan bagian belakang hanya disuntik
subplantar tanpa karagenin, kemudian kedua kaki dipotong pada sendi
torsocrural dan ditimbang.
14. Perhitungan respon anti inflamasi
Dari hasil penimbangan berat kedua kaki belakang hewan uji untuk masing-masing peringkat dosis bisa dicari prosentase anti inflamasi. Adapun rumusnya menurut Langford et al., (1972) adalah sebagai berikut :
Prosentase efek anti-inflamasi = ×100%
⎥⎦ ⎤ ⎢⎣ ⎡ − D D U
Karena prosentase efek anti-inflamasi dihitung dari pengurangan bobot udema maka rumus di atas diubah menjadi sebagai berikut :
Prosentase efek anti-inflamasi = ×100%
⎥⎦ ⎤ ⎢⎣ ⎡ − U D U keterangan :
U : Harga rata-rata berat kaki kelompok karagenin (terinflamasi) dikurangi rata-rata berat kaki kelompok normal ( tanpa perlakuan )
D : Harga rata-rata berat kaki kelompok perlakuan (terinflamasi) dikurangi rata-rata berat kaki normal ( tanpa perlakuan )
Untuk mengetahui potensi relatif efek ekstrak petroleum eter daun senggani terhadap larutan natrium diklofenak sebagai kontrol positif maka dapat digunakan rumus sebagai berikut :
Potensi relatif efek anti-inflamasi = x DAd DAp
100%
keterangan :
DAp : prosentase (%) efek anti inflamasi pada kelompok perlakuan ekstrak petroleum eter daun senggani
