BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Penetapan kadar air serbuk teh hitam dilakukan menggunakan metode Karl
Fischer. Serbuk teh hitam ditimbang 1 g, ditambahkan metanol 10 mL, lalu
didiamkan selama 1 hari pada suhu kamar. Pre-titrasi dan uji kebocoran dilakukan
pada alat, hingga diperoleh angka drift 10-50. Standarisasi dilakukan dengan cara
spuit berisi air ditimbang, kemudian 1-2 tetes air dimasukkan ke dalam alat. Spuit
ditimbang kembali untuk menentukan berat air yang dimasukkan, kesetaraan titran
dan air dihitung. Metanol (p.a) 1 mL dimasukkan dan dititrasi. Kadar air dihitung
sebagai blangko. Sampel 1 mL dimasukkan, dititrasi dengan alat, kadar air dalam
sampel dihitung.
Kadar air dalam sampel dihitung dengan menggunakan rumus:
Kadar air = x(mg) – bobot air blangko metanol (mg) x 100% ... (2) bobot yang ditimbang (mg)
x = angka yang muncul pada alat
Pengulangan penetapan kadar air dilakukan 3 kali.
2. Ekstraksi polifenol teh hitam
Serbuk teh 100 g dengan derajat halus 12/20 diekstraksi dengan metode
maserasi menggunakan metanol (500 mL) dengan bantuan shaker (150 rpm) selama
48 jam. Ekstrak metanol yang diperoleh kemudian dipekatkan sampai 100 mL
kemudian ditambahkan 100 mL kloroform dan 37,5 mL akuades. Lapisan atas dan
lapisan bawah dipisahkan, lapisan atas selanjutnya diekstraksi dengan etil asetat 150
mL dan 60 mL akuades kemudian dipisahkan fase atasnya. Fase bawah diekstraksi
kembali dengan ditambah 150 mL etil asetat dan dipisahkan fase atasnya. Fase atas
dari keduanya disatukan kemudian dikeringkan sehingga diperoleh ekstrak kering
polifenol teh hitam (Nagayama, Iwamura, Shibata, Hirayama, Nakamura, 2002).
3. Penetapan kadar polifenol total dalam ekstrak kering polifenol teh hitam
a. Larutan stok kuersetin 1 mg/mL
Sebanyak 0,05 g kuersetin standar dilarutkan dengan aseton 75% dalam
labu ukur 50 mL hingga tanda.
b. Penetapan operating time
Sebanyak 4 mL larutan stok diencerkan dengan aseton 75% dalam labu
10 mL hingga tanda. Larutan diambil 0,5 mL dan dimasukkan ke dalam labu ukur
50 mL. Pereaksi Folin-Ciocalteu ditambahkan sebanyak 2,5 mL dan didiamkan
selama 2 menit. Larutan Na2CO3 ditambahkan sebanyak 7,5 mL dan diencerkan
dengan akuades hingga tanda. Larutan divortex selama 30 detik kemudian diukur
serapannya pada panjang gelombang 726 nm selama 120 menit kemudian ditetapkan
operating time yang memberikan serapan yang stabil.
c. Penetapan panjang gelombang maksimum
Sebanyak 4 mL larutan stok diencerkan dengan aseton 75% dalam labu
10 mL hingga tanda. Larutan diambil 0,5 mL dan dimasukkan ke dalam labu ukur
50 mL. Pereaksi Folin-Ciocalteu ditambahkan sebanyak 2,5 mL dan didiamkan
selama 2 menit. Larutan Na2CO3 ditambahkan sebanyak 7,5 mL dan diencerkan
dengan akuades hingga tanda. Larutan divortex selama 30 detik kemudian didiamkan
selama operating time. Larutan disentrifuse dengan kecepatan 4000 rpm selama 5
menit. Larutan diukur serapannya pada panjang gelombang antara 600-800 nm
kemudian ditentukan panjang gelombang yang memberikan serapan maksimum.
d. Penetapan kurva baku
Kuersetin standar 0,05 g dilarutkan dengan aseton 75% hingga volume
50,0 mL. Dibuat seri konsentrasi 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 dan 0,7 mg/mL dengan
mengambil 2, 3, 4, 5, 6, dan 7 mL larutan stok dan diencerkan dengan aseton 75%
hingga 10,0 mL. Sebanyak 0,5 mL larutan tersebut dimasukkan dalam labu ukur
50 mL, ditambahkan pereaksi Folin-Ciocalteu sebanyak 2,5 mL dan didiamkan
selama 2 menit. Larutan kemudian ditambahkan 7,5 mL larutan Na2CO3 dan
diencerkan dengan akuades hingga tanda. Larutan divortex selama 30 detik
kemudian dan didiamkan selama operating time. Sebelum diukur serapannya, larutan
disentrifuse dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit. Absorbansi diukur pada
panjang gelombang maksimum. Pengukuran dilakukan sebanyak 3 kali.
e. Penetapan kadar polifenol dalam ekstrak kering teh hitam
Sebanyak 500 mg ekstrak kering polifenol teh hitam dilarutkan dengan
aseton 75 % hingga volumenya 25,0 mL. Sebanyak 1 mL larutan tersebut
dimasukkan dalam labu ukur 50 mL dan diencerkan dengan akuades hingga tanda.
Sebanyak 0,5 mL larutan tersebut dimasukkan dalam labu ukur 50 mL, ditambahkan
pereaksi Folin-Ciocalteu sebanyak 2,5 mL dan didiamkan selama 2 menit. Larutan
kemudian ditambahkan 7,5 mL larutan Na2CO3 dan diencerkan dengan akuades
hingga tanda. Larutan divortex selama 30 detik kemudian dan didiamkan selama
operating time. Sebelum diukur serapannya, larutan disentrifuse dengan kecepatan
4000 rpm selama 5 menit. Absorbansi diukur pada panjang gelombang maksimum.
Pengukuran dilakukan sebanyak 6 kali. Kadar polifenol dalam sampel dihitung
menggunakan persamaan kurva baku sehingga diperoleh konsentrasi polifenol
terhitung ekuivalen terhadap kuersetin.
4. Penentuan SPF ekstrak kering polifenol teh hitam secara in vitro
a. Pembuatan larutan stok polifenol teh hitam
Ekstrak kering polifenol teh hitam ditimbang setara dengan 25 mg polifenol
teh hitam dan dilarutkan dengan etanol 90% dalam labu ukur 100 mL.
b. Penentuan spektra UV ekstrak kering polifenol teh hijau
Larutan stok diambil sebanyak 2,4 mL diencerkan dengan etanol 90 %
dalam labu ukur 10 mL sehingga diperoleh larutan polifenol teh hitam dengan
konsentrasi 6 mg% b/v. Spektra UV larutan diperoleh dengan scanning serapan
larutan pada panjang gelombang 290-400 nm.
c. Penentuan nilai SPF
Diambil larutan stok sebanyak 2,4 dan 3 mL kemudian diencerkan dengan
etanol 90 % dalam labu ukur 10 mL sehingga diperoleh larutan polifenol teh hitam
dengan konsentrasi 6 dan 7,5 mg% b/v. Pengulangan dilakukan sebanyak 3 kali
untuk tiap konsentrasi.
Absorbansi masing-masing konsentrasi diukur tiap 5 nm pada rentang
panjang gelombang 290 nm hingga panjang gelombang tertentu di atas 290 nm yang
mempunyai nilai serapan minimal 0,050. Dibuat kurva antara nilai absorbansi
terhadap panjang gelombang. Luas daerah di bawah kurva (AUC) antara dua panjang
gelombang yang berurutan dihitung dengan rumus:
[ ] (
p p a)
p a pA
A
AUC
p a p − −+ −
=
−λ λ
λ λ2
... (3) Keterangan:A(p-a) = serapan pada panjang gelombang yang lebih rendah di antara dua
panjang gelombang yang berurutan
Ap = serapan pada panjang gelombang yang lebih tinggi di antara dua
panjang gelombang yang berurutan
p
λ = panjang gelombang yang lebih tinggi di antara dua panjang
gelombang berurutan
) (p−a
λ = panjang gelombang yang lebih rendah di antara dua panjang
gelombang berurutan
Seluruh luas daerah di bawah kurva absorbansi dapat dihitung dengan menjumlahkan
semua harga AUC. Harga SPF dapat dihitung dapat dihitung dengan rumus :
1 λ λ − Σ = n AUC SPF Log ... (4) Keterangan: n
λ = panjang gelombang terbesar di antara panjang gelombang 290 nm hingga di atas 290 nm yang mempunyai nilai serapan minimal 0,050
1
λ = panjang gelombang terkecil (290 nm)
(Petro, 1981)
5. Optimasi formula gel sunscreen
Formula gel sunscreen menurut A Formulary of Cosmetic Preparation (1977)
R/ Etanol (SD-40) 48,0 Carbopol 940 1,0 Escalol 106 (Gliseryl-p-aminobenzoate) 3,5 Monoisopropilamine 0,09 Akuades 47,91 Parfume 9,5
Dalam optimasi formula ini dilakukan modifikasi formula dengan berbagai
komposisi humektan menggunakan metode desain faktorial. Monoisopropilamine
untuk menetralkan pH dalam membentuk jaringan gel diganti dengan trietanolamin.
Penambahan vitamin C berfungsi untuk menjaga stabilitas zat aktif. Formula yang
diperoleh untuk 100 gram:
R/ Etanol 96% 7,8 Gliserol 5-15 Propilenglikol 5-15 Carbopol 3% b/v 30 Akuades 35 Trietanolamin sampai. pH 5-6
Ekstrak kering polifenol teh hitam 0,0185% b/b
Vitamin C 0,0125
Tabel II. Level rendah dan level tinggi gliserol dan propilenglikol dalam formula gel sunscreen ekstrak kering polifenol teh hitam
Formula Gliserol Propilenglikol
1 5 5
a 15 5
b 5 15
ab 15 15
Berdasarkan tabel tersebut, dibuat 4 formula gel sunscreen ekstrak kering
polifenol teh hitam sebagai berikut:
Tabel III. Formula gel sunscreen ekstrak kering polifenol teh hitam
Formula 1 a b ab Etanol 96% 7,8 7,8 7,8 7,8 Gliserol 5 15 5 15 Propilenglikol 5 5 15 15 Carbopol 3%b/v 30 30 30 30 Akuades 35 35 35 35 Trietanolamin sampai pH 5-6
Ekstrak polifenol teh hitam (mg) 15,30 17,15 17,15 19,00 Vitamin C 0,0125 0,0125 0,0125 0,0125
Pembuatan gel
Formula sunscreen gel disiapkan dengan terlebih dahulu membuat larutan
carbopol 3% b/v. Dicampur carbopol 3% b/v dan akuades dengan stirer 700 rpm
selama 10 menit. Ditambahkan trietanolamin hingga pH 5-6 dan diaduk homogen.
Setelah homogen ditambahkan vitamin C yang dilarutkan dalam akuades ke dalam
campuran. Terakhir ditambahkan campuran gliserol, propilenglikol dan ekstrak
kering polifenol teh hitam yang dilarutkan dalam etanol ke dalam campuran.
6. Uji sifat fisik dan stabilitas gel sunscreen ekstrak kering polifenol teh hitam
a. Uji daya sebar gel (Garg, et al., 2002)
Pengujian daya sebar gel dilakukan setelah 48 jam pembuatan. Ditimbang
1,0 gram gel, diletakkan di tengah kaca bundar berskala. Di atas massa gel diletakkan
kaca bulat lain bersama beban hingga 125 g dan dibiarkan selama 1 menit. Diukur
diameter penyebaran gel. Pengukuran dilakukan sebanyak 6 kali.
b. Uji viskositas gel
Uji viskositas dilakukan dua kali yaitu setelah 48 jam pembuatan gel dan
setelah penyimpanan selama 1 bulan menggunakan alat Viscometer Rion
(RION-JAPAN) yang sesuai (seri VT-04E). Salah satu formula dimasukkan ke dalam
chamber yang tersedia. Pasang alat untuk mengukur viskositas. Lakukan uji
viskositas. Catat viskositas formula tersebut. Lakukan pengujian pada keempat
formula dan pengukuran masing-masing formula sebanyak 6 kali.
7. Subjective assessment
Subjective assessment dilakukan dengan memberikan kuesioner untuk
memperoleh data tentang penerimaan konsumen. Kuesioner dibagikan kepada 30
responden. Responden diminta memberikan jawaban atas pertanyaan seputar sediaan
gel sunscreen ekstrak kering polifenol teh hitam yang telah dibuat (formula 1,a,b,ab).