BAB III METODOLOGI PENELITIAN
D. Tata Cara Penelitian
Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian yaitu daun sirih
merah, telah dideterminasi terlebih dahulu di Laboratorium Biologi Farmasi,
Fakultas Farmasi Universitas Gajah Mada, Yogyakarta mengacu pada referensi
Backer dan Brink (1965).
2. Pengumpulan daun sirih merah
Daun sirih merah yang digunakan diambil dari tanaman sirih merah yang
tumbuh di daerah Desa Mantenan, Kecamatan Mertoyudan, Kabupaten Magelang,
Propinsi Jawa Tengah.
3. Pembuatan ekstrak etanolik daun sirih merah
a) Pembuatan serbuk
Daun sirih merah yang telah dikumpulkan selanjutnya dibersihkan
dengan cara dicuci bersih dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran atau
debu yang melekat pada daun. Daun kemudian ditiriskan, dan dilakukan
pengeringan menggunakan oven pada suhu maksimal 60-70oC untuk mencegah
perubahan kimia yang terlalu besar. Simplisia yang sudah kering diblender,
diayak dengan pengayak nomor 80, dan serbuk yang diperoleh disimpan dalam
botol berwarna coklat.
b) Pembuatan ekstrak etanolik daun sirih merah (maserasi)
Serbuk simplisia diekstrak secara maserasi memakai etanol 70%. Untuk
tiap 100 gram serbuk digunakan 700 ml etanol 70%. Maserasi yang digunakan
dengan 500 ml etanol 70% dalam Erlenmeyer, kemudian ditutup dan dibiarkan
selama 24 jam terlindung dari cahaya matahari untuk mencegah reaksi yang
dikatalisis oleh cahaya atau perubahan warna. Setelah 24 jam sari diserkai,
disaring, ampas diperas. Ampas yang diperoleh kemudian ditambah cairan penyari
sebanyak 200 ml, diaduk dan diserkai. Bejana ditutup, dibiarkan di tempat sejuk,
terlindung dari cahaya, selama 2 hari kemudian endapan dipisahkan. Rendaman
harus dikocok berulang-ulang (kira-kira 3 x sehari). Setelah 2 hari maserat
disaring dengan kertas saring, kemudian ditampung. Maserat yang terkumpul
kemudian dipekatkan di atas waterbath dengan suhu 60-65oC, dibantu dengan
kipas angin sampai kental.
4. Sterilisasi alat dan bahan
Untuk mencegah terjadinya kontaminasi oleh organisme, maka alat-alat yang
digunakan dalam penelitian ini harus disterilkan terlebih dahulu. Alat-alat tersebut
dicuci bersih dengan deterjen dan dikeringkan, setelah itu dibungkus dengan
alumunium foil dan disterilkan dalam autoklaf selama 20 menit pada suhu 1210C,
tekanan 2,05 abs bar (Cook dan Martin, 2005).
5. Pembuatan medium pencuci dan medium penumbuh
a. Pembuatan medium pencuci
Medium pencuci dibuat dengan melarutkan RPMI 1640 dalam
aquabidest kurang lebih 80 ml, ditambah 2,3 g natrium bikarbonat, 2 g Hepes,
diencerkan sampai 100 ml, pH dibuat 7,2, lalu disterilkan dengan filter
berdiameter 0,22 μm. Medium disimpan dalam lemari es pada suhu 4oC (Freshney, 2000; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).
b. Pembuatan medium penumbuh (RPMI 1640-serum)
Untuk medium RPMI 1640-serum, ditambahkan FBS (Foetal Bovine
Serum) 10%, penisilin-streptomisin 1%, dan fungison 0,5% dalam medium RPMI
1640 dan disterilkan dengan filter berdiameter 0,22 μm. Media disimpan dalam almari es pada suhu 4oC (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et
al, 1989).
6. Pengaktifan dan panen Sel T47D a. Pengaktifan Sel T47D
Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam
penangas air 37oC, kemudian ampul disemprotkan dengan etanol 70%. Ampul
dibuka dan sel T47D dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium
RPMI 1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang,
diganti dengan medium RPMI 1640 yang baru, kemudian disuspensikan perlahan.
Suspensi sel lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang
sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang
mengandung 10% FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai homogen,
kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan
dalam inkubator dengan suhu 37oC dengan aliran 5% CO2. Setelah 24 jam,
medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya
cukup untuk penelitian.
b. Panen Sel T47D
Setelah jumlah sel cukup (kurang lebih setelah berumur 7 hari), media
dinding flask dengan cara diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel
dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai
volume 10 ml dan disentrifugasi 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang
dan pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian
dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium
sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2x104/100 μl dan siap dipakai untuk penelitian.
7. Pembuatan larutan uji
Ekstrak kental ditimbang, dilarutkan dengan pelarut DMSO dan dikocok sampai homogen untuk mendapatkan sediaan ekstrak induk dengan konsentrasi
100 mg/ml. Sebelum digunakan, sediaan ekstrak induk disterilkan dengan
membran filter. Dari sediaan steril ekstrak induk tersebut dibuat larutan uji dengan
konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah 500 µg/ml; 750 µg/ml; 1000 µg/ml;
1250 µg/ml; 1500 µg/ml.
8. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah pada sel T47D a. Metode MTT
Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 μl ekstrak etanolik daun sirih merah dengan kadar 500 µg/ml, 750 µg/ml, 1000 µg/ml, 1250 µg/ml, dan 1500
µg/ml dimasukkan ke dalam 100 μl suspensi sel T47D dengan kepadatan 2x104/100 μl dalam sumuran-sumuran 96-well plate yang berbeda. Sebagai kontrol, 100 µl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium
diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37oC, dalam inkubator dengan aliran 5%
CO2.
Pada akhir inkubasi, ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 10
μl MTT 2,5 μg/ml dalam media RPMI 1640, lalu diinkubasikan semalam pada suhu 37oC, dalam inkubator dengan aliran CO2 5%. Sel hidup akan bereaksi
dengan MTT dan membentuk warna ungu. Reaksi dihentikan dengan
menambahkan 50 μl reagen stopper pada setiap sumuran dan inkubasi semalam pada suhu kamar. Serapan setiap sumuran dibaca deangan ELISA reader pada
panjang gelombang 550 nm. Besarnya serapan berbanding lurus dengan jumlah
sel yang hidup.
b. Metode Perhitungan Langsung (direct counting)
Seratus μl suspensi sel T47D dengan kepadatan 2x104 sel/100 μl dimasukkan ke dalam sumuran pada mikro plate 96, ditambahkan ekstrak etanolik
uji pada kadar 500 µg/ml; 750 µg/ml; 1000 µg/ml; 1250 µg/ml; 1500 µg/ml.
Untuk kontrol digunakan 200 μl suspensi sel dalam media penumbuh. Selanjutnya plate diinkubasi dalam inkubator aliran 5% CO2 selama 24 jam pada suhu 37oC.
Pada akhir masa inkubasi tiap sumuran diresuspensi, kemudian ditambahkan 50 μl
trypan blue, lalu diresuspensikan lagi untuk homogenisasi, dan diambil 10 μl yang ditempatkan di Haemocytometer, sel siap dihitung dengan counter di bawah
mikroskop. Sel yang hidup akan tampak relatif bulat transparan. Sedangkan sel
