BAB III METODOLOGI PENELITIAN
D. Tata Cara Penelitian
Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian yaitu umbi rumput teki. Tumbuhan rumput teki terlebih dahulu dideterminasi di laboratorium Farmakognosi
Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dan telah dipastikan pula kebenarannya menggunakan acuan baku Flora of Java (Backer dan Backuizen van den Brink, 1968).
2. Pengumpulan umbi rumput teki
Umbi rumput teki untuk penelitian ini diambil dari Tepi Sungai Progo, Moyudan, Sleman, Yogyakarta.
3. Sterilisasi alat dan bahan
Untuk mencegah terjadinya kontaminasi oleh organisme, maka alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini harus disterilkan terlebih dahulu. Alat-alat tersebut dicuci bersih dengan sabun dan dikeringkan, setelah itu dibungkus dengan alumunium foil dan disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 1210C (Anonim, 1995).
4. Preparasi fraksi protein dari umbi rumput teki
Bahan (umbi rumput teki) dikumpulkan segar, diseleksi kemudian dicuci bersih dengan air mengalir. Umbi dipotong kecil-kecil, kemudian dimasukkan dalam plastik dan disimpan dalam freezer selama dua malam. Umbi ditimbang sebanyak 400 g (gram) kemudian ditumbuk halus sambil ditambahkan sesedikit mungkin dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl pada suhu ±4ºC. Kemudian diperas dengan kain monel, ditampung dalam tabung conical yang bersih dan steril. Cairan yang diperoleh disentrifugasi dengan 2010 xG selama 20 menit. Supernatan dikumpulkan dalam beaker glass 1000 ml dan diendapkan proteinnya dengan menambahkan 79,8 g amonium sulfat, stirrer semalam. Kemudian disentrifus
lagi 2010 xG selama 20 menit pada suhu ±4°C. Supernatan (1) ditampung dalam beaker glass 1000 ml sedangkan pelet yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 tanpa NaCl; kemudian didialisis dengan tabung dialisis dalam larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 selama semalam. Hasil dialisis disentrifus 2010 xG selama 20 menit pada suhu 4°C. Pelet kemudian dibuang dan supernatan merupakan fraksi protein umbi rumput teki FP20.
Supernatan (1) kemudian ditambah dengan 74,2 g amonium sulfat, stirrer semalam. Kemudian disentrifus lagi 2010 xG selama 30 menit pada suhu ±4°C. Supernatan (2) ditampung dan pelet yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 ; kemudian didialisis selama semalam. Hasil dialisis disentrifus 2010 xG selama 20 menit pada suhu ±4°C. Pelet dibuang dan supernatan merupakan sampel fraksi protein umbi rumput teki FP40.
Supernatan (2) kemudian ditambah dengan 87,22 g amonium sulfat, stirrer semalam. Kemudian disentrifus lagi 2010 xG selama 30 menit pada suhu ±4°C. Supernatan (3) ditampung dan pelet yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 ; kemudian didialisis selama semalam. Hasil dialisis disentrifus 2010 xG selama 20 menit pada suhu ±4°C. Pelet dibuang dan supernatan merupakan sampel fraksi protein umbi rumput teki FP60.
Supernatan (3) kemudian ditambah dengan 98,8 g amonium sulfat, stirrer semalam. Kemudian disentrifus lagi 2010 xG selama 30 menit pada suhu ±4°C. Supernatan ditampung dan pelet yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2; kemudian didialisis selama semalam.
Hasil dialisis disentrifus 2010 xG selama 20 menit pada suhu ±4°C. Pelet dibuang dan supernatan merupakan sampel fraksi protein umbi rumput teki FP80.
5. Pengukuran kadar protein dengan matode spektrofotometri UV
Fraksi protein umbi rumput teki FP20, FP40, FP60, dan FP80 masing-masing sebanyak 10µl dimasukkan ke dalam kuvet 1 ml lalu ditambah 990 µl larutan dapat natrium fosfat 5mM. Ukur serapan (absorbansi) menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 280nm dan 260nm dengan blanko larutan dapar natrium fosfat.
Data absorbansi tiap-tiap fraksi protein umbi rumput teki kemudian dihitung dengan rumus berikut ini untuk mendapatkan kadar protein dalam mg/ml.
(Layne, 1957 cit Richterich & Colombo, 1981) 6. Preparasi sel HeLa
a. Propagasi sel HeLa. Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam penangas air 37oC, kemudian ampul disemprotkan dengan etanol 70%. Ampul dibuka dan sel HeLa dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium RPMI 1640. Suspensi sel disentrifuse 2010 xG selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium RPMI yang baru, kemudian disuspensikan perlahan. Suspensi sel lalu disentrifuse 2010 xG kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang mengandung 10% FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan
diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37oC dengan aliran 5% CO2. Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian.
b. Panen sel HeLa. Setelah jumlah sel cukup, media diganti dengan RPMI 1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel dilepaskan dari dinding flask dengan cara diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai volume 10 ml dan disentrifuse 2010 xG selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 3x104/100 μl dan siap dipakai untuk penelitian.
7. Preparasi Sel Vero
a. Propagasi sel Vero. Sel diambil dari nitogen cair, segera dicairkan dalam penangas air 37º C, kemudian ampul disemprot dengan etanol cair 70%. Ampul dibuka dan sel dipindahkan ke dalam tabung steril yang berisi medium M199. Suspensi sel disentrifuse 2010 xG selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti M199 baru, disuspensikan pelan-pelan. Suspensi sel disentrifuse lagi 2010 xG selama 5 menit, cuci ulang, supernatan dibuang. Sel ditambah 1ml medium pertumbuhan yang mengandung 10% PBS dan diresuspensikan sehingga homogen. Kemudian sel ditumbuhkan dalam beberapa buah tabung biakan kecil, diinkubasikan dalam inkubator aliran 5% CO2. Setelah 24 jam, medium diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian lebih lanjut.
b. Panen sel Vero. Setelah jumlah sel cukup siap panen, sel dicuci dengan fBS satu kali sebanyak 3 ml. Kemudian diberi tripsin 0,25% sebanyak 1ml untuk melepaskan sel-sel. Setelah itu dituang dalam conical steril yang sudah berisi M199 sebanyak 7 ml, bilas dengan 3ml FBS 10%. Hasil bilasan dituang ke conical yang sama, sentrifuse 2010 xG selama 5 menit. Sel dicuci 1x lagi dengan menggunakan medium yang sama untuk menghilangkan sisa tripsin. Pelet ditambah media kultur sebanyak 1ml, dihitung jumlah selnya dengan menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 3x104 sel/100µl dan siap digunakan.
8. Uji sitotoksisitas fraksi protein umbi rumput teki
a. Sel HeLa. Sebanyak 100 μl suspensi sel HeLa dengan kepadatan 3x104/100 μl dimasukkan dalam sumuran-sumuran 96-well plate yang telah berisi 100 μl fraksi protein umbi teki dengan kadar 200 µg/ml pada sumuran A1, B1 dan C1 pada kolom 1, kemudian pada sumuran A2, B2 dan C2 di kolom 2 ditambahkan 100 μl suspensi sel HeLa pada sumuran yang telah berisi 100 μl fraksi protein umbi rumput teki dengan kadar 100 µg/ml, demikian seterusnya hingga diperoleh seri kadar yang terendah yang digunakan dalam penelitian. Kemudian diinkubasi bersama fraksi protein satu seri kadar selama 24 jam. Replikasi pembacaan dilakukan 3 kali dengan memberikan perlakuan yang sama terhadap 6 baris sumuran. Sebagai kontrol, 100 µl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium RPMI 1640 dan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 , sedangkan untuk faktor koreksi, 100 µl sampel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium RPMI 1640 dan
dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2. Selanjutnya 96-well plate diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37oC, dalam inkubator dengan aliran 5% CO2.
Pada akhir inkubasi, ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 10 μl MTT 2,5 μg/ml dalam media RPMI 1640, lalu diinkubasikan semalam pada suhu 37oC, dalam inkubator dengan aliran CO2 5%. Sel hidup akan bereaksi dengan MTT dan membentuk warna ungu. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 100 μl reagen stopper pada setiap sumuran dan inkubasi semalam pada suhu kamar. Serapan setiap sumuran dibaca deangan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm. Besarnya serapan berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup.
b. Sel Vero. Uji sitotoksisitas fraksi protein umbi rumput teki pada sel Vero dilakukan dengan menggunakan langkah yang sama dengan uji sitotoksisitas pada sel HeLa. Perbedaannya hanya terletak pada media yang digunakan, yakni menggunakan M199 untuk sel Vero.