BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
E. Tata cara penelitian
Determinasi buah nanas dilakukan di Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta berdasarkan Backer dan
van Den Brink (1963) dengan mencocokan karakteristik buah nanas yang digunakan dengan gambar, taksonomi, dan keterangan kelompok tumbuhan. Hal ini dilakukan untuk mengetahui kebenaran identitas tanaman yang digunakan dalam penelititan serta untuk meminimalisir adanya kesalahan yang terjadi ketika pengambilan sampel.
2. Pengumpulan kulit buah nanas.
Kulit buah nanas diperoleh dari pasar Stan, Maguwoharjo, kabupaten Sleman, Yogyakarta. kulit yang diambil berasal dari buah yang memiliki jenis dan tingkat kematangan yang sama.
3. Pembuatan ekstrak kulit buah nanas.
Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Soares, Vaz, Correia, Pessoa, dan Carneiro-da-Cunha (2012) dengan beberapa modifikasi. a. Preparasi buah nanas (Ananas comosus (L.) Merr).
Buah Nanas dicuci dengan air mengalir, dikeringkan, dan dikupas. Kulit buah sebanyak 70,0 g dipotong kecil-kecil kemudian dicampur dengan air deionisasi 4°C (1:1 w/w) dan dihaluskan menggunakan blender. Larutan jus disaring dengan menggunakan kain katun tipis lalu disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit. Supernatan kemudian dikumpulkan dalam gelas beker untuk proses selanjutnya.
b. Purifikasi dengan teknik ethanol precipitation
Supernatan dari kulit buah nanas sebanyak 100,0 mL didinginkan hingga mencapai suhu 4°C kemudian ditambahkan dengan etanol 90% dengan perbandingan 1:3. Campuran diaduk menggunakan magnetic stirrer selama 5
menit dan didiamkan selama 24 jam pada suhu 4°C sehingga didapatkan endapan koloidal putih hingga kuning muda. Setelah terjadi pengendapan, campuran kemudian diuapkan untuk memisahkan etanol menggunakan vacuum rotary evaporator dengan suhu 50°C selama 30 menit. Endapan dikumpulkan dalam cawan petri dan dipekatkan menggunakan waterbath dengan suhu 50°C selama 3 jam. Cairan kental berwarna kekuningan dikumpulkan sebagai ekstrak kulit buah nanas.
4. Analisis kualitatif
Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Panda (2000) dengan beberapa modifikasi. BSA sebanyak 0,5 mL dengan konsentrasi 50 mg/mL dilarutkan ke dalam 10,0 mL air deionisasi, ekstrak kulit buah nanas sebanyak 250,0 mg dilarutkan ke dalam 50,0 mL air deionisasi, dan ninhidrin sebanyak 350,0 mg dilarutkan ke dalam 100,0 mL etanol 90%. Larutan BSA diambil sebanyak 1 mL lalu dimasukan ke dalam tabung reaksi dan ditambah dengan larutan ninhidrin sebanyak 5 mL. Campuran dipanaskan pada suhu 100°C selama 15 menit sehingga muncul warna biru-ungu yang menandakan terjadi reaksi antara asam amino dengan ninhidrin. Analisis yang sama juga dilakukan untuk larutan ekstrak kulit buah nanas dan air deionisasi. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.
5. Penetapan kadar enzim bromelain ekstrak kulit buah nanas
Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Ahmed (2005) dengan beberapa modifikasi.
a. Pembuatan larutan uji
Ekstrak kulit buah nanas ditimbang sebanyak 250,0 mg dan dilarutkan ke dalam 25,0 mL aquadest (5°C) sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 10000 µg/mL.
b. Pembuatan larutan pembanding BSA
BSA sebanyak 0,5 mL dengan konsentrasi 50 mg/mL dilarutkan ke dalam 25,0 mL aquadest (5°C). Larutan tersebut diambil sebanyak 4,0; 5,5; 7,0; 8,5 dan 10,0 mL lalu ditambah dengan aquadest (5°C) hingga 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan pembanding BSA sebesar 400, 550, 700, 850 dan 1000 µg/mL.
c. Penetapan panjang gelombang maksimum
Larutan baku BSA dengan konsentrasi 400, 700, dan 1000 µg/mL dimasukan ke dalam tabung reaksi dan divortex selama 30 detik, lalu didiamkan selama OT. Larutan diukur serapannya pada panjang gelombang 200-400 nm. d. Pengukuran absorbansi larutan standar dan uji
Larutan BSA dengan konsentrasi 400, 550, 700, 850 dan 1000 µg/mL diukur serapannya pada panjang gelombang maksimum terhadap blanko yang terdiri dari aquadest (5°C). Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. Kemudian, larutan uji dengan konsentrasi 10000 µg/mL diukur serapannya pada panjang gelombang maksimum terhadap blanko yang terdiri dari aquadest (5°C). Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.
e. Estimasi kadar enzim bromelain
Berdasarkan hasil dari prosedur 5 d untuk BSA dan ekstrak kulit buah nanas kemudian dihitung nilai % kadar enzim.
6. Pembuatan larutan uji aktivitas antioksidan
Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Thangaraj (2016) dengan beberapa modifikasi.
a. Pembuatan larutan DPPH
DPPH sebanyak 15,8 mg ditimbang dan dilarutkan ke dalam metanol p.a. hingga 100,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan DPPH sebesar 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.
b. Pembuatan larutan standar rutin
Rutin sebanyak 5,0 mg dilarutkan ke dalam metanol p.a hingga 100,0 mL. Larutan tersebut diambil sebanyak 2,0; 3,0; 4,0; 5.0 dan 6,0 mL lalu ditambah dengan metanol p.a hingga 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar rutin sebesar 10, 15, 20, 25, dan 30 µg/mL.
c. Pembuatan larutan uji
Ekstrak kulit buah nanas sebanyak 250,0 mg ditimbang dan dilarutkan ke dalam aquadest hingga 25,0 mL. Larutan tersebut diambil sebanyak 3,0; 3,5; 4,0; 4,5 dan 5,0 mL lalu ditambah dengan aquadest (5°C) hingga 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 3,0; 3,5; 4,0; 4,5 dan 5,0 mg/mL.
7. Uji Aktivitas Antioksidan
Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Thangaraj (2016) dengan beberapa modifikasi.
a. Uji Pendahuluan
Dalam tiga buah tabung reaksi, masing-masing ditambah dengan larutan DPPH dan air deionisasi, larutan rutin 25 µg/mL, dan larutan bromelain 5 mg/mL sebanyak 1,0 mL kemudian ditambah dengan metanol p.a sebanyak 3 mL. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik dan didiamkan selama 30 menit. Setelah 30 menit, perubahan warna dari ketiga larutan diamati. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.
b. Penentuan operating time (OT)
Dalam tiga buah labu ukur 5 mL, masing-masing ditambah dengan larutan DPPH dan larutan rutin 5, 15, dan 25 µg/mL sebanyak 1,0 mL kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan divortex selama 30 detik dan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometes visibel pada panjang gelombang 517 nm tiap 5 menit selama 1 jam. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.
c. Penetapan panjang gelombang maksimum
Dalam tiga buah labu ukur 10 mL, masing-masing ditambah dengan larutan DPPH sebanyak 0,5; 1,0; dan 1,5 mL, kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas, sehingga diperoleh konsentrasi DPPH sebesar 0,020; 0,040; dan 0,060 mM. Larutan dimasukan ke dalam tabung reaksi dan divortex selama
30 detik, lalu didiamkan selama OT. Larutan diukur serapannya pada panjang gelombang 400-600 nm.
d. Pengukuran absorbansi larutan kontrol DPPH
Larutan DPPH sebanyak 2,0 mL dimasukan ke dalam labu ukur 10 mL dan ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Setelah OT, larutan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.
e. Pengukuran absorbansi larutan uji
Larutan DPPH sebanyak 2,0 mL dimasukan ke dalam labu ukur 10 mL dan ditambah dengan 2 mL larutan pembanding dan larutan uji pada berbagai seri konsentrasi yang telah dibuat, kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan divortex selama 30 detik, lalu didiamkan selama OT. Setelah OT, larutan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.
f. Estimasi aktivitas antioksidan
Berdasarkan hasil dari prosedur 7 d dan e untuk rutin dan ekstrak bromelain kemudian dihitung niai %IC dan IC50.