BAB III METODOLOGI PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Identifikasi tanaman kemangi dilakukan di Laboratorium
Farmakognosi Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta dengan mengacu pada buku panduan menurut Steenis (1975),
untuk memastikan bahwa tanaman yang digunakan benar-benar tanaman
kemangi.
2. Pengumpulan daun kemangi
Daun kemangi diperoleh dari Pasar Tradisional Beringharjo,
Yogyakarta. Bagian tanaman yang digunakan adalah bagian daun berwarna
hijau yang masih segar. Daun dipisahkan dari batang dan bunga, kemudian
dilakukan pencucian untuk menghilangkan kotoran yang kemungkinan masih
terdapat di daun.
3. Destilasi minyak atsiri daun kemangi
Destilasi uap dan air dilakukan dengan menimbang terlebih dahulu
bobot daun kemangi segar, kemudian didestilasi menggunakan air selama 4-6
jam. Daun kemangi berada di atas air dengan adanya pembatas sehingga air
tidak menyentuh daun kemangi secara langsung. Kemudian uap air dan
minyak dialirkan melalui pendingin dan hasil destilasi ditampung. Destilat
yang dihasilkan adalah berupa minyak dan air. Digunakan natrium sulfat
anhidrat untuk menarik air dari hasil destilat minyak atsiri, sehingga yang
4. Karakterisasi minyak atsiri daun kemangi a. Pemeriksaan organoleptis
Pemeriksaan organoleptis minyak atsiri dilakukan dengan melihat
warna, kejernihan, dan bau minyak atsiri hasil destilasi uap dan air.
Minyak kemangi memiliki warna kuning jernih, bau khas menyengat dan
mudah menguap (Dewi, 2008).
b. Pengukuran nilai bobot jenis minyak kemangi
Piknometer dicuci dan dibersihkan dengan air dan etanol 96%.
Dikeringkan dengan arus udara kering. Menimbang piknometer yang
bersih dan kering dengan seksama. Mengisi piknometer dengan air hingga
penuh, lalu direndam dalam air es sehingga suhunya mencapai ± 2ºC di
bawah suhu percobaan. Kemudian piknometer dikeluarkan dan dibiarkan
hingga suhu piknometer mencapai suhu ruangan, kemudian pipa kapiler
ditutup. Usap air yang menempel di dinding piknometer kemudian
ditimbang dengan seksama. Melihat kerapatan air pada suhu percobaan.
Kemudian piknometer dicuci dan dibersihkan, dan digunakan untuk
menghitung kerapatan minyak atsiri daun kemangi dengan cara yang sama
dengan perlakuan pada air. Di replikasi sebanyak tiga kali.
c. Pengukuran nilai indeks bias
Pengukuran indeks bias menggunakan alat hand refractometer
pada cahaya terang dan dilihat dengan memutar skala sampai terlihat garis
batas gelap dan terang dengan jelas.
5. Identifikasi kualitatif minyak atsiri daun kemangi dengan metode KLT
Fase diam yang digunakan silika gel GF254 dan fase gerak yang
digunakan untuk daun kemangi adalah n-heksana - etilasetat (10:1 v/v).
Deteksi menggunakan sinar UV 254 dan 366 nm dengan penampak bercak
yang digunakan adalah vanilin asam sulfat, dengan standar eugenol.
6. Penyiapan media uji
Pembuatan media MHA yaitu mencampurkan serbuk MHA 34 g
dalam aquadest 1000 ml. Pembuatan media MHB mencampurkan 21 g dalam
aquadest 1000 ml. Kemudian disterilkan dalam autoklaf 121C pada 1 atm selama 15 menit.
7. Uji daya antibakteri minyak atsiri daun kemangi dengan metode difusi sumuran
a. Penyiapan larutan uji
Dari hasil destilasi dibuat berbagai variasi pengenceran dengan
melarutkan minyak atsiri dengan etanol 96%. Dibuat beberapa variasi
konsentrasi destilat minyak kemangi yaitu 2,5%; 5%; 10%; 15%; 20%; 50%
dan 100%. Konsentrasi 100% minyak kemangi sebagai kontrol positif dan
b. Pembuatan suspensi bakteri
Diambil 1-3 ose kultur murni bakteri Staphylococcus epidermidis
dan Bacillus subtilis, diinokulasikan ke dalam 10 ml MHB dan divortex
serta diinkubasi 37C selama 24 jam. Dibuat suspensi bakteri sesuai standar Mc Farland 0,5 (1,5.108 CFU/ml).
c. Uji daya antibakteri minyak atsiri daun kemangi terhadap
Staphylococcus epidermidis dan Bacillus subtilis dengan difusi sumuran
Pada uji ini digunakan kontrol sterilitas media dan kontrol
pertumbuhan bakteri uji. Kontrol sterilitas media ini berfungsi untuk
memastikan bahwa media yang digunakan bebas dari kontaminan. Kontrol
ini dibuat dengan menuang media MHA pada cawan petri steril.
Sedangkan kontrol pertumbuhan uji berfungsi untuk melihat bakteri
apakah suspensi bakteri yang digunakan dapat tumbuh dengan baik.
Pembuatan media ini dengan menambahkan bakteri uji pada media MHA
kemudian dilakukan pour plate pada cawan petri steril.
Pembuatan media untuk difusi sumuran menggunakan
perbandingan media dengan volume 1:6. Satu bagian, yaitu 5 ml
digunakan sebagai layer bawah, dituang ke dalam cawan petri steril dan
dibiarkan memadat terlebih dahulu. Enam bagian, yaitu 30 ml digunakan
sebagai layer atas, yang dituang setelah media diinokulasi dengan bakteri
uji.
Pembuatan lubang sumuran pada media MHA menggunakan
variasi konsentrasi minyak atsiri, kontrol pelarut (etanol 96%) dan kontrol
positif (minyak kemangi 100%). Pembuatan lubang menembus layer atas,
sedangkan layer bawah sebagai alas supaya sampel tidak menyebar ke
dasar cawan petri.
Minyak atsiri dengan berbagai variasi konsentrasi diinokulasikan
sebanyal 50 l dan diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37C. Saat akan diinkubasi sebelumnya cawan petri dibungkus menggunakan plastic wrab.
Daya antibakteri yang diamati berdasarkan zona hambat yang terbentuk
dibandingkan kontrol pelarut etanol 96% dikurangi dengan diameter
sumuran yang digunakan (8mm). Dilakukan replikasi 3 kali.
8. Penentuan nilai KHM dan KBM dengan dilusi padat
Uji ini menggunakan tiga macam kontrol, yaitu kontrol sterilitas media,
kontrol pertumbuhan bakteri, dan kontrol negatif (kontrol pelarut). Kontrol
pelarut ini berfungsi untuk melihat apakah pelarut yang digunakan untuk
melarutkan minyak atsiri, yaitu etanol 96% memiliki aktivitas menghambat
pertumbuhan bakteri uji atau tidak. Pembuatannya dengan cara menambahkan
bakteri uji dan etanol 96% ke dalam media MHA, kemudian dilakukan pour
plate ke dalam cawan petri steril.
a. Uji daya antibakteri dengan dilusi padat
Untuk pengujian antibakteri dengan dilusi padat, variasi konsentrasi
minyak kemangi didapatkan berdasarkan daya hambat yang diperoleh
pada difusi sumuran. Konsentrasi terkecil yang mempunyai aktivitas
konsentrasinya diturunkan dan dinaikkan untuk nantinya dapat diketahui
nilai KHM dan KBM dari minyak atsiri daun kemangi.
Pembuatan suspensi dilakukan untuk kedua bakteri uji yang
kekeruhannya sudah dibandingkan dengan standar Mc Farland 0,5 dan
diinkubasi selama 24 jam. Variasi konsentrasi minyak kemangi yang telah
ditentukan sebanyak 1 ml bersama dengan suspensi bakteri sebanyak 1 ml
dimasukkan ke dalam cawan petri steril secara pour plate. Diinkubasikan
selama 24 jam dengan suhu 37oC.
Pertumbuhan bakteri dilihat dari kekeruhan media, semakin banyak
pertumbuhan bakteri maka media akan semakin keruh, begitu pula
sebaliknya. Pembacaan hasil daya antibakteri diberi penilaian dengan
notasi (+++) untuk pertumbuhan bakteri yang sangat keruh, (++) keruh, (+)
agak keruh, dan (-) jernih. Kekeruhan media perlakuan dibandingkan
dengan kontrol sterilitas dan kontrol pertumbuhan.
b. Penentuan nilai KHM dan KBM
Penentuan nilai KHM dan KBM dengan melakukan streak plate
dari hasil uji daya antibakteri secara dilusi padat. Media dari hasil uji
dilusi padat berbagai variasi konsentrasi yang memberikan kejernihan
media secara visual, diambil 1 ose dan dilakukan streak plate pada media
MHA steril.
Nilai KHM ditentukan dari konsentrasi terkecil yang menunjukkan
media jernih kemudian dilakukan streak plate dan masih terjadi
menunjukkan media jernih kemudian dilakukan streak plate dan tidak
terjadi pertumbuhan bakteri di tempat dilakukan streak plate.
9. Pembuatan gel anti bau kaki minyak atsiri daun kemangi
Formula gel dalam 100 g (Yuliani, 2005).
R/ Etanol 96% 26,7 g Propilenglikol 12,4 g Larutan carbopol 3% b/v 34,0 g Aquadest 17,2 g Trietanolamin 1,4 g Minyak atsiri 10,0 g
Komposisi minyak atsiri daun kemangi yang dimasukkan dalam
formula didapatkan dari nilai diameter zona hambat yang memberikan nilai
paling besar. Hal ini dilakukan agar daya hambat yang diberikan gel minyak
kemangi adalah yang paling baik.
Dari formula tersebut di atas dilakukan modifikasi sebagai berikut:
Tabel I. Formula sediaan gel anti bau kaki minyak kemangi Material Gel Minyak
Kemangi (gram)
Kontrol Basis Gel Minyak Kemangi (gram) Etanol 96% 24,8 29,1 Propilenglikol 11,5 13,5 Larutan carbopol 3% b/v 31,5 37,1 Aquadest 15,9 18,8 Trietanolamin 1,3 1,5 Minyak atsiri 15 -
Larutan carbopol 3% b/v dibuat dengan cara mengembangkan
carbopol dalam aquadest yang sesuai dalam formula selama 24 jam.
Selanjutnya dicampurkan dengan propilenglikol, aquadest, etanol, minyak
atsiri daun kemangi, dan trietanolamin dengan mixer sampai terbentuk sediaan
gel.
10.Uji sifat fisik sediaan gel anti bau kaki minyak atsiri daun kemangi
Pengukuran sifat fisik gel anti bau kaki minyak kemangi dilakukan
48 jam setelah pembuatan, yang meliputi:
a. Uji viskositas
Pengukuran viskositas dilakukan dengan menggunakan Viscotester Rion
seri VT 04. Sebanyak 100 gram sediaan dimasukkan ke dalam wadah dan
dipasang pada portable viscotester. Viskositas diamati pada skala yang
ditunjukkan jarum penunjuk setelah tercapai kestabilan.
b. Uji daya sebar
Pada satu sisi double plate berskala diletakkan 0,5 g gel dan kemudian
disatukan, didiamkan selama 1 menit, diberi beban 50 g didiamkan 1
menit, diberi tambahan beban 50 g dan didiamkan 1 menit, kemudian
diberi tambahan 50 g, sehingga bobot beban total 150 g, dan didiamkan 1
menit kemudian diukur diameter penyebarannya dengan melihat dari
beberapa sisi.
11.Uji daya antibakteri sediaan gel anti bau kaki minyak atsiri daun kemangi terhadap Staphylococcus epidermidis dan Bacillus subtilis dengan metode difusi sumuran
Dibuat 6 lubang sumuran dengan diameter 8 mm pada cawan petri
yang telah berisi MHA double layer. Masing-masing sumuran diisi 100 mg
gel minyak kemangi, 100 mg kontrol basis gel, 50 µl (minyak kemangi 15%),
100 mg kontrol positif (Clindamycin phosphate gel), 50 µl kontrol negatif
(etanol 96%), kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37ºC. Sebelum
diinkubasi, cawan petri dibungkus menggunakan plastic wrab.