BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
1. Preparasi sampel alga coklat Sargassum polycystum C. Agardh
Alga coklat Sargassum polycystum C. Agardh dikumpulkan, dicuci dengan air mengalir dan menggunakan tangan untuk menghilangkan sedimen dan epifit yang menempel, kemudian dipanaskan dengan autoklaf pada suhu 1200 C selama 30 menit untuk menginaktifkan enzim polifenol oksidase. Selanjutnya dikeringkan dengan oven pada suhu 90°C dan diserbuk dengan derajat halus 20/30. Penetapan kadar air serbuk alga dilakukan dengan menggunakan metode Karl Fischer. Serbuk alga coklat Sargassum polycystum C. Agardh ditimbang sebanyak 2 g, kemudian tambahkan 10 mL metanol, lalu didiamkan selama 1 hari pada suhu kamar. Dilakukan pre-titrasi pada alat, lalu dilakukan uji kebocoran alat, hingga didapat angka drift 10-50 pada alat. Standardisasi dilakukan dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
cara spuit berisi air ditimbang, kemudian 1 tetes air dimasukkan ke dalam alat. Kemudian ditimbang kembali untuk menentukan berat air yang dimasukkan dan kesetaraan air dihitung. Dimasukkan 1 mL metanol dan dititrasi dengan alat (blanko). Kadar air dihitung. Dimasukkan 1 mL sampel, titrasi dengan alat, kadar air dalam sampel dihitung. Kadar air dalam sampel dihitung dengan menggunakan rumus: Kadar air = − (10) ×100% ditimbang yang berat blanko x
x = angka yang muncul pada alat (%) dikali 10.000 mg atau berat yang dimaksudkan untuk konversi.
2. Uji kualitatif senyawa fenolik a. Preparasi ekstrak
Tiga puluh mL metanol 80% ditambahkan pada 10 g serbuk alga dengan derajad halus 20/30. Lalu diletakkan ke dalam wadah dan dipanaskan pada
waterbath selama ± 1 jam. Kemudian didinginkan pada suhu ruang dan disaring menggunakan corong Buchner yang sesuai dengan dilapisi kertas saring. Ditambahkan 5 mL metanol 80% dan disaring kembali (Fong, 1992).
b. Uji tanin dan polifenol
Sejumlah volume yang setara dengan 10 g ekstrak metanol 80% yang telah disiapkan sebelumnya pada langkah preparasi ekstrak, diuapkan menggunakan waterbath. Ditambahkan 25 mL akuadest panas dan dicampur secara merata. Dibiarkan hingga dingin pada suhu kamar. Ditambahkan 3-4 tetes larutan NaCl 10%. Kemudian ekstrak disaring dengan menggunakan vacuum.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
Filtrat dibagi ke dalam 4 tabung masing-masing 3 mL. Pada tabung I ditambahkan 4-5 tetes larutan gelatin 1%. Pada tabung II ditambahkan 4-5 tetes pereaksi garam gelatin (gelatin 1% dan NaCl 10 %). Pada tabung III ditambahkan 3-4 tetes ferri klorida. Tabung IV dijadikan kontrol dan tidak ditambahkan pereaksi apapun. Diamati warna yang terbentuk pada setiap tabung (Fong, 1992).
3. Isolasi crude phlorotannin dari alga coklat Sargassum polycystum C. Agardh
Serbuk alga ditimbang sebanyak 80 g, sesuai dengan kapasitas sohxlet, kemudian dimasukkan ke dalam kertas filter Schleicher dan Schuell. Setelah itu dimasukkan ke dalam labu soxhlet. Kemudian pelarut metanol diberikan sebanyak 2 kali sirkulasi. Soxhletasi dilakukan dengan suhu 120±200C kurang lebih selama 30 jam.
Ekstrak metanol yang diperoleh kemudian dipekatkan sampai 1/10 dari volume mula-mula. Selanjutnya ditambahkan metanol hingga 120 mL, lalu ditambahkan 120 mL kloroform, dan 45 mL air dalam corong pisah 500 mL. Kemudian digojog dan didiamkan hingga terbentuk dua lapisan. Pisahkan antara lapisan atas dan lapisan bawah. Selanjutnya lapisan atas diekstraksi dengan etil asetat sebanyak dua kali, masing-masing 75 mL pada setiap kali penambahan. Kumpulkan fraksi etil asetat (bagian atas), selanjutnya diuapkan sehingga diperoleh ekstrak yang merupakan crude phlorotannin.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
4. Optimasi metode kolorimetri dengan Folin-Ciocalteau a. Pembuatan larutan standar dan larutan sampel
Pembuatan larutan standar phloroglucinol. Standar phloroglucinol
ditimbang seksama lebih kurang 0,05 g, kemudian dilarutkan ke dalam aseton 75% sampai volume 50,0 mL. Seri konsentrasi larutan intermediet dipipet dari larutan induk sebanyak 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; dan 6,0 mL. Dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL dan dilarutkan ke dalam aseton 75% untuk konsentrasi 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; dan 6,0 ppm.
Pembuatan larutan sampel. Ditimbang 0,05 g fraksi etil asetat alga coklat, kemudian dilarutkan ke dalam aseton 75% hingga volumenya 50,0 mL.
b. Penetapan operating time (OT)
Larutan intermediet dengan konsentrasi 4,0 ppm dipipet sebanyak 0,5 mL dan dimasukkan ke dalam labu takar 50,0 mL yang berisi 2,5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteau yang telah diencerkan dengan akuadest (1:1). Didiamkan selama 2 menit. Ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M, dicampurkan sampai volume 50,0 mL dengan akuadest. Operating time diukur pada spektrofotometer visibel. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang teoritis (750 nm).
c. Penentuan panjang gelombang maksimum (λ maks)
Larutan intermediet dengan konsentrasi 1,0; 3,0; dan 6,0 ppm masing-masing dipipet sebanyak 0,5 mL ke dalam labu takar 50,0 mL yang berisi 2,5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteau yang telah diencerkan dengan akuadest (1:1). Didiamkan selama 2 menit. Ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M, dilarutkan sampai volume 50,0 mL dengan akuadest. Campuran tersebut divortex setiap 15
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
menit, selama 30 detik, sebanyak 2 kali vortex. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit dan diambil bagian supernatannya. Setelah itu ketiga larutan tersebut discan menggunakan spektrofotometer visibel untuk melihat panjang gelombang maksimumnya.
d. Pembuatan seri larutan baku
Masing-masing larutan intermediet dipipet sebanyak 0,5 mL dan dimasukkan ke dalam labu takar 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteau yang telah diencerkan dengan akuadest (1:1). Didiamkan selama 2 menit. Selanjutnya ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M dan dilarutkan dengan akuadest sampai volume 50,0 mL. Campuran tersebut divortex setiap 15 menit, selama 30 detik, sebanyak 2 kali vortex. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit dan diambil bagian supernatannya. Absorbansi diukur pada panjang gelombang hasil scanning dengan menggunakan spektrofotometer visibel. Dihitung persamaan kurva baku yang diperoleh.
5. Estimasi kadar polifenol total pada sampel fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polycystum C. Agardh
Fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polycystum C. Agardh ditimbang lebih kurang 0,05 g dengan seksama, kemudian dilarutkan dalam aseton 75%S sampai volumenya 50,0 ml. Sepuluh mL larutan sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteau yang telah diencerkan dengan akuadest (1:1). Didiamkan selama 2 menit. Selanjutnya ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M dan dilarutkan dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
akuadest sampai volume 50,0 mL. Campuran tersebut divortex setiap 15 menit, selama 30 detik, sebanyak 2 kali vortex. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit dan diambil bagian supernatannya. Diukur absorbansinya pada panjang gelombang hasil scanning larutan baku dengan menggunakan spektrofotometer visibel. Konsentrasi polifenol total dihitung ekivalen dengan phloroglucinol (mg PE/g fraksi).
F. Analisis hasil