BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi Tanaman Cocor Bebek (Kalanchoe pinnata (Lam.))
Determinasi tanaman cocor bebek dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Tujuan dilakukan determinasi adalah memastikan kebenaran tanaman yang digunakan oleh peneliti yaitu Kalanchoe pinnata (Lam.). Determinasi dilakukan menggunakan buku Flora of Java (Spermatophytes only) (Backer dan van der Brink, 1963).
2. Pembuatan ekstrak daun cocor bebek
a. Pengumpulan dan cara panen daun cocor bebek. Bibit tanaman cocor bebek diperoleh dari tempat budidaya Merapi Farma Kaliurang, Yogyakarta. Tanaman cocor bebek dibudidayakan di Kebun Obat Universitas Sanata Dharma Kampus III Paingan.
Pemanenan daun dilakukan pada umur tiga bulan. Daun dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran yang menempel pada daun. Daun yang telah dicuci diangin-anginkan kemudian dikeringkan menggunakan pengeringan udara pada tempat teduh dilanjutkan dengan pengeringan oven sampai daun benar-benar kering, ditandai dengan mudah dipatahkan atau mudah hancur bila diremas. Simplisia yang sudah kering diserbuk
menggunakan blender kemudian simplisia diayak menggunakan ayakan mesh 40.
b. Pembuatan ekstrak daun cocor bebek. Metode ekstraksi dimodifikasi dari teknik isolasi senyawa ekstrak etanol daun cocor bebek oleh Nwose (2013). Modifikasi metode dilakukan pada tahap penguapan menggunakan vacuum rotary evaporator dan pelarut etanol 70% yang digunakan. Serbuk daun cocor bebek dimaserasi dengan pelarut etanol 70% dengan perbandingan 2:5 selama 48 jam. Pemisahan serbuk dan maserat dilakukan menggunakan corong Buchner dan kertas saring dengan bantuan pompa vakum. Bagian serbuk disari lagi dengan pelarut etanol dan dimaserasi kembali selama 48 jam. Hasil penyarian dicampur dan diuapkan menggunakan vacuum rotary evaporator dengan suhu 55oC. Pelarut yang tersisa diuapkan kembali pada cawan porselin di atas waterbath dengan suhu 75oC selama 3 jam dengan pengadukan berkala 30 menit.
c. Uji kuantitatif kandungan ekstrak daun cocor bebek. Uji kuantitatif terhadap hasil ekstrak daun cocor bebek dilakukan untuk mengetahui kadar flavonoid pada ekstrak daun cocor bebek. Pengujian kadar flavonoid dilakukan oleh Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu UGM (LPPT UGM). Uji flavonoid dilakukan dengan membuat kurva baku menggunakan standar quersetin, dilanjutkan dengan uji flavonoid pada sampel ekstrak daun cocor bebek menggunakan spektrofotometri visibel pada panjang gelombang 510 nm.
3. Optimasi formula gel
a. Formula. Formula yang digunakan pada penelitian ini mengacu pada formula gel luka bakar ekstrak daun cocor bebek (Hasyim dkk., 2012)
Tabel II. Formula gel untuk luka bakar
Bahan Komposisi (% b/v)
Ekstrak daun cocor bebek 2,5
Carbopol 0,6 Trietanolamin 0,81 Gliserin 25 Propilen glikol 5 Metil paraben 0,18 Etanol 70% 0,5 Aquadest ad 100
Formula tersebut dimodifikasi pada komposisi gelling agent dan humektan menjadi formula baru pada tabel III.
Tabel III. Formula gel hasil modifikasi
Bahan Formula 1 (g) Formula a (g) Formula b (g) Formula ab (g) Ekstrak daun cocor bebek 5 5 5 5
CMC Na 6 7,5 6 7,5 Propilen glikol 20 20 30 30 Trietanolamin 1,62 1,62 1,62 1,62 Metil paraben 0,36 0,36 0,36 0,36 Etanol 70% 1 1 1 1 Aquadest 162 162 162 162 Keterangan tabel:
1 = formula dengan faktor A pada level rendah 6 gram dan faktor B pada level rendah 20 gram.
a = formula dengan faktor A pada level tinggi 7,5 gram dan faktor B pada level rendah 20 gram.
b = formula dengan faktor A pada level rendah 6 gram dan faktor B pada level tinggi 30 gram.
ab = formula dengan faktor A pada level tinggi 7,5 gram dan faktor B pada level tinggi 30 gram.
b. Pembuatan gel. CMC Na dikembangkan terlebih dahulu dalam 100 gram aquadest dengan cara menaburkan CMC Na di atas aquadest (campuran 1), pengembangan CMC Na dilakukan selama 24 jam. Metil paraben dilarutkan menggunakan etanol 70% dan propilen glikol (campuran 2). Campuran 1 dan 2 dicampur dan ditambahkan ekstrak daun cocor bebek kemudian dilakukan proses mixing dengan mixer dengan skala putar 1 selama 5 menit. Trietanolamin ditambahkan pada saat proses mixing pada menit ke-1 untuk mengatur pH sediaan gel anti-inflamasi ekstrak daun cocor bebek.
4. Uji sifat fisik dan stabilitas fisik gel
a. Uji organoleptis dan pH. Uji organoleptis dan pH sediaan dilakukan pada penyimpanan 48 jam dan 4 minggu. Sediaan gel ekstrak daun cocor bebek yang telah diformulasi dilakukan pengamatan fisik meliputi bau, warna, homogenitas, dan pH sediaan. Pengukuran pH menggunakan indikator pH (pH stick) dengan cara memasukkannya ke dalam sediaan gel kemudian warna yang dihasilkan dibandingkan dengan warna standar pada pH stick.
b. Uji viskositas. Uji viskositas dilakukan 48 jam setelah formulasi gel. Masing-masing formula gel ditentukan viskositasnya menggunakan alat Viskometer Rion seri VT 04. Ukuran paddle yang digunakan pada skala 2 (rentang viskositas 100-4000 dPas). Cara pengujiannya yaitu gel dimasukkan ke dalam cup sampai terisi ¾. Paddle dipasang tegak lurus pada Viskometer, kemudian cup dipasang dan rotor dinyalakan. Nilai
viskositas gel dapat diketahui dengan mengamati gerakan jarum penunjuk viskositas.
c. Uji pergeseran viskositas. Pergeseran viskositas gel ekstrak daun cocor bebek diketahui dengan menghitung persentase perubahan viskositas gel setelah penyimpanan selama 4 minggu. Berdasarkan penelitian Yuliani (2010), rumus untuk menghitung persen pergeseran viskositas adalah:
d. Uji daya sebar. Pengukuran daya sebar sediaan gel dilakukan setelah 48 jam pembuatan. Pengukuran daya sebar dilakukan dengan cara gel ditimbang 1 gram kemudian diletakkan di tengah lempeng bulat berskala. Kaca bulat lain dan pemberat diletakkan di atas gel tersebut sehingga berat kaca bulat dan pemberat 125 gram, didiamkan selama 1 menit, kemudian dicatat diameter sebarnya (Garg dkk., 2012).
5. Uji aktivitas anti-inflamasi dengan metode carrageenan-induced paw edema
a. Penyiapan hewan uji. Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus jantan galur Sprague Dawley yang berumur 2-3 bulan dengan berat 100-200 gram. Tikus dipuasakan 12 jam sebelum pengujian.
b. Pembuatan larutan NaCl 0,9%. Sebanyak 0,225 mg NaCl ditimbang kemudian dilarutkan dengan aquadest di dalam labu takar 25 ml.
c. Pembuatan suspensi karagenan-salin 1%. Sebanyak 0,1 g karagenan ditimbang kemudian dilarutkan dengan larutan NaCl 0,9% di dalam labu takar 10 ml.
d. Perlakuan hewan uji. Hewan uji dibagi menjadi 3 kelompok masing-masing terdiri dari 3 ekor tikus, yaitu:
1) Kelompok kontrol negatif injeksi suspensi karagenan-salin 1%.
Telapak kaki kiri belakang tikus diukur menggunakan jangka sorong digital sebelum diinjeksi suspensi karagenan-saline 1% secara suplantar (dinyatakan sebagai Yo). Pengukuran ketebalan telapak kaki tikus dilakukan pada menit ke-0 (sebelum injeksi suspensi karagenan-salin 1%), 30, 60, 120, 180 setelah injeksi suspensi karagenan-karagenan-salin 1%.
2) Kelompok kontrol positif gel Voltadex®.
Telapak kaki kiri belakang tikus diukur menggunakan jangka sorong digital (dinyatakan sebagai Yo), setelah itu dioleskan gel Voltadex®. Satu jam kemudian, telapak kaki kiri belakang diinjeksi 0,5 ml suspensi karagenan-salin 1% secara sub plantar. Pengukuran ketebalan telapak kaki tikus dilakukan pada menit ke-0 (sebelum pengolesan gel Voltadex®), 30, 60, 120, 180 setelah injeksi suspensi karagenan-salin 1%.
3) Kelompok perlakuan gel ekstrak daun cocor bebek formula optimum. Telapak kaki kiri belakang tikus diukur menggunakan jangka sorong digital (dinyatakan sebagai Yo), setelah itu dioleskan gel ekstrak daun
cocor bebek. Satu jam kemudian, telapak kaki kiri belakang diinjeksi 0,5 ml suspensi karagenan-salin 1% secara sub plantar. Pengukuran ketebalan telapak kaki tikus dilakukan pada menit ke-0 (sebelum pengolesan gel ekstrak daun cocor bebek), 30, 60, 120, 180 setelah injeksi suspensi karagenan-salin 1%.
d. Pengukuran persen penghambatan edema. Analisis hasil dilakukan dengan mengukur ketebalan telapak kaki tikus menggunakan jangka sorongdigital. Setelah itu dihitung nilai edema tiap waktu (persamaan 2), nilai AUC total masing-masing perlakuan (persamaan 3) dan didapatkan persen penghambatan edema (persamaan 4).
Nilai edema masing-masing perlakuan tiap jam dihitung dengan rumus: Yu = Yt –Yo ... (2) Keterangan:
Yu = edema kaki tikus pada waktu tertentu (mm)
Yt = tebal kaki tikus pada waktu tertentu setelah diradangkan dengan suspensi karagenan-salin 1% (mm)
Yo = tebal kaki tikus sebelum diradangkan dengan suspensi karagenan-salin 1% (mm)
(Taufiq, Wahyuningtyas, dan Wahyuni, 2008). Nilai AUC total masing-masing perlakuan dengan rumus:
... (3) Keterangan:
= area dibawah kurva dari jam ke-0 sampai jam ke-3 (mm.jam) = edema telapak kaki pada jam ke-(n-1) (mm)
= jam ke-n (jam) = jam ke-(n-1) (jam)
(Taufiq dkk., 2008). Persen penghambatan edema dihitung dengan rumus:
... (4)
Keterangan:
= rata – rata kontrol negatif (mm.jam)
= masing-masing tikus pada kelompok yang diberi perlakuan (mm.jam)
(Taufiq dkk., 2008).
