BAB III METODOLOGI PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Penelitian ini menetapkan kadar parasetamol, propifenazon, kafein dalam sediaan tablet kombinasi secara spektrofotometri UV yang dihubungkan dengan kalibrasi multivariat tanpa tahap pemisahan.
Analisis secara spektrofotometri UV-kalibrasi multivariat dilakukan dengan cara :
1. Scanning spektra standar
Scanning standar dilakukan dengan membuat standar parasetamol dan
kafein dengan konsentrasi 5 µg/mL dan dilakukan scanning spketra pada panjang gelombang 220-400 nm.
2. Pemilihan interval pengukuran dan panjang gelombang pengukuran untuk
set kalibrasi
a. Dilakukan pengamatan spektra dari hasil pengukuran campuran standar parasetamol, propifenazon, dan kafein. Dipilih rentang panjang gelombang saat campuran senyawa mulai memberikan serapan sampai campuran memberikan serapan mendekati nilai 0 b. Rentang panjang gelombang yang dipilih adalah 220-310 nm. Interval
pengukuran yang dipilih adalah 3 nm agar diperoleh data pengamatan dalam jumlah yang cukup untuk dapat menggambarkan hubungan variabel.
3. Penyiapan larutan set kalibrasi dan set validasi eksternal
a. Standar parasetamol, propifenazon, kafein masing–masing ditimbang secara seksama 50 mg, dimasukkan dalam labu takar 100 mL,
dilarutkan dengan pelarut akuabides, diultrasonifikasi selama 10 menit, dan ditambahkan dengan pelarut sampai batas tanda.
b. Pembuatan 20 larutan set kalibrasi dan 10 set validasi , dilakukan dengan cara: setiap larutan antara dipipet sejumlah tertentu, dimasukkan dalam labu takar 10 mL dan diencerkan dengan pelarut akuabides hingga diperoleh kadar sesuai Tabel III untuk set kalibrasi dan Tabel IV untuk set validasi eksternal.
Tabel III. Komposisi campuran sintetik parasetamol, propifenazon, dan kafein untuk model kalibrasi
No Parasetamol (µg/mL) Propifenazon (µg/mL) Kafein (µg/mL) 1 5,8 3,5 1,5 2 7,1 3,1 1,2 3 5,2 3,4 0,5 4 6,6 4,7 0,6 5 4 4,3 0,7 6 6,1 3,6 0,8 7 5,6 4,4 2 8 3,9 3,9 0,9 9 6,3 2,1 1,8 10 3,8 2,3 1 11 7 3,6 2 12 6,8 2,9 1,9 13 4,5 4,4 1,4 14 6,4 2,6 0,7 15 5 3,6 1,2 16 7,3 16 1,6 17 6,1 2,4 0,8 18 6,3 4,7 1,2 19 4,5 3,6 1,2 20 7,2 3,4 1,9
Tabel IV. Komposisi campuran sintetik paracetamol Parasetamol, Kafein, Propifenazon untuk validasi eksternal
No Parasetamol (µg/mL) Propifenazon (µg/mL) Kafein (µg/mL) 1 5,9 4,6 1,7 2 7,8 3,6 1,3 3 6,3 2 1,8 4 4,8 3,2 0,7 5 7,6 4,1 2 6 5,8 2,9 1,9 7 6,7 3,3 0,8 8 7,2 2,7 1,2 9 8,4 3,7 1 10 4,9 3,7 1,1
4. Uji keseragaman bobot tablet
Sejumlah 20 sediaan tablet, dihitung bobot rata-rata tiap tablet. Sediaan tablet memenuhi syarat apabila ditimbang satu per satu, tidak ada lebih dari 2 tablet yang menyimpang dari bobot rata-rata lebih besar dari 5% dan tidak ada satu tablet pun yang bobotnya menyimpang dari bobot rata-rata lebih dari 10% (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1995).
5. Analisis Sampel
a. Ditimbang 20 sampel tablet secara seksama, dicatat bobot setiap tablet, dilakukan pengujian keseragaman bobot tablet, digerus sampai homogen. b. Ditimbang seksama dengan jumlah tertentu yang setara dengan 25 mg
parasetamol, 15 mg propifenazon, dan 5 mg kafein dilarutkan dalam labu takar 100 mL, dilarutkan dalam sebagian pelarut akuabides, diultrasonikasi selama 15 menit, dan diencerkan dengan pelarut sampai batas tanda. Larutan disaring menggunakan kertas saring.
c. Dari larutan yang telah disaring, dipipet sebanyak 5,0 mL dan dimasukkan dalam labu takar 50 mL, kemudian ditambahkan pelarut sampai batas tanda.
d. Dari larutan (c) tersebut dipipet lagi sebanyak 2,0 mL dan dimasukkan dalam labu takar 10 mL, kemudian ditambahkan pelarut sampai batas tanda.
e. Dilakukan scanning dari larutan tersebut pada panjang gelombang 220-310 nm dengan interval absorbansi 3 nm.
f. Dilakukan penetapan kadar parasetamol, propifenazon, dan kafein sebanyak 6 kali. Kadar dihitung dengan metode kalibrasi multivariat
partial least square (PLS).
6. Analisis statistik kalibrasi multivariat (PLS)
a. Model Kalibrasi Multivariat PLS
1) Data konsentrasi dan absorbansi kelompok larutan kalibrasi yang disajikan dalam kertas kerja perangkat lunak Microsoft Excel dipindahkan ke dalam kertas kerja Minitab® 16 (trial) dengan fungsi
copy-paste.
2) Pengolahan data statistik partial least square (PLS) dipilih dengan menggunakan pilihan Stat pada panel kerja Minitab 16, kemudian dipilih regression partial least square.
3) Setelah muncul jendela baru dari program Minitab 16, dilakukan pembuatan model PLS parasetamol dengan cara; kolom response diisi dengan pilihan variabel konsentrasi PCT dan kolom model
dipilih variabel absorbansi pada panjang gelombang 220-310 nm. Untuk pembuatan model PLS kafein dibuat dengan cara; kolom
response diisi dengan pilihan variabel konsentrasi CAF dan kolom model dipilih variabel absorbansi pada panjang gelombang 220-310
nm.
4) Diperoleh nilai terhitung dan nilai sebenaryna dari model kalibrasi multivariat PLS parasetamol dan kafein, nilai tersebut kemudian dipindahkan ke dalam kertas kerja perangkat lunak Microsoft Excel dengan fungsi copy-paste.
5) R2 didapat dari hubungan korelasi atau kedekatan nilai antara nilai sebenarnya (sumbu X) dengan nilai terhitung (sumbu Y).
6) RMSEC dapat dihitung menggunakan rumus √∑ dimana x adalah nilai sebenarnya (actual), y adalah nilai terhitung (calculated), dan n adalah banyak nya data konsentrasi yang dirandomisasi yaitu 20.
b. Cross Validation Leave-one-out
1) Data dipindahkan dari kertas kerja perangkat lunak Microsoft Excel dengan menggunakan fungsi copy-paste ke dalam kertas kerja Minitab 16.
2) Dipilih model kalibrasi PLS dengan menekan pilihan stat pada panel kerja, kemudian dipilih regression partial least square.
3) Proses validasi model kalibrasi dilakukan dengan, dimasukan variabel konsentrasi PCT ke dalam response dan variabel
absorbansi ke dalam kolom model. Kemudian tekan tombol option yang selanjutnya ditentukan tambahan proses leave-one-one. Perlakuan sama diberlakukan untuk proses validasi CAF.
4) Diperoleh nilai sebenarnya dan nilai terhitung, serta nilai PRESS dari tahap validasi internal dan selanjutnya dipindahkan ke dalam kertas kerja perangkan lunak Microsoft Excel dengan fungsi
copy-paste.
5) Akurasi dan presisi model kalibrasi ditinjau dari nilai R2 dan nilai RMSECV dengan membuat hubungan linier antara nilai sebenarnya dan nilai terhitung. Diperoleh persamaan linear y=bx+a hubungan antara nilai sebenarnya dan terhitung yang nantinya akan digunakan untuk memperoleh nilai RMSECV.
7. Anasilis data Sampel
a. Akurasi dan presisi model kalibrasi multivariat parasetamol dan kafein dinyatakan secara statistik dengan nilai R2, RMSEC, RMSECV, RMSEP dan PRESS.
b. Konsentrasi sampel dihitung dengan koefisien dari masing-masing model untuk senyawa parasetamol dan kafein sesuai dengan rumus :
Keterangan :
X = Konsentrasi terhitung sampel (µg/mL) ts = koefisien dari model kalibrasi
= koreksi kesalahan yang mungkin erjadi pada model kalibras PLS
c. Kadar sampel dihitung dengan menggunakan rumus :
̅ )
Keterangan :
Ct = konsentrasi sampel terprediksi oleh model (µg/mL) Fp = Faktor Pengenceran
̅ = Berat rata-rata penimbangan keseluruhan sampel tablet (mg (tab)) X = Berat penimbangan sampel (mg)
d. Akurasi dari proses penetapan kadar ditetapkan dengan persen perolehan kembali dengan rentang yang dapat diterima menurut Wood (1998) adalah sebesar 90-107%
e. Presisi dari proses penetapan kadar ditetapkan dengan nilai RSD dengan nilai maksimal yang masih dapat diterima menurut Gonzales dan Herrador (2007) adalah sebesar 11,3%.
Analisis kalibrasi multivariat dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak Minitab® 16 (trial). Kertas kerja perangkat lunak Excel 2010 digunakan untuk menentukan konsentrasi secara random masing–masing zat aktif dan untuk menghubungkan antara konsentrasi sebenarnya dan konsentrasi yang ditemukan atau terprediksi.
32
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Analisis parasetamol, propifenazon, kafein secara simultan menggunakan metode spektrofotometri UV
Spektra UV parasetamol, propifenazon, kafein dengan konsentrasi masing-masing 5 ppm dapat dilihat pada Gambar 8 dari gambar ini nampak bahwa ketiga senyawa mempunyai spektra yang overlapping. Dengan bekembangnya teknologi, saat ini tersedia suatu perangkat kalibrasi multivariat yang dapat mengatasi masalah spektra yang overlapping seperti ini.
Gambar 8. Spektra UV parasetamol (PCT), propifenazon (PROPI), kafein (KAF), dan spektra UV campuran PCT, PROPI, dan KAF yang diukur pada panjang
gelombang 220-400 nm PCT PROP KAF Spektra Uv campuran PCT, PROPI, dan KAF
Untuk suksesnya analisis ketiga senyawa ini (PCT, PROPI, dan KAF) dengan bantuan kalibrasi multivariat kemometrika, maka spektra UV sampel yang akan di analisis harus mempunyai spektra UV yang mirip dengan spektra UV baku, karena jika spektra baku campuran ketiga senyawa obat dengan sampel sediaan farmasi yang akan dianalisis tidak mirip, maka perlu diperhatikan adanya bahan tambahan dalam sampel yang membuat spektra tidak mirip dengan baku. Dari Gambar 9 nampak bahwa sediaan farmasi (tablet) dan campuran baku ketiga senyawa (PCT, PROPI, dan KAF) mempunyai pola spektra yang mirip.
Gambar 9. Spektra UV sampel sediaan farmasi (tablet) dan spektra UV campuran baku parasetamol (PCT), propifenazon (PROPI), kafein (KAF)
yang diukur pada panjang gelombang 200-400 nm
Spektra campuran baku (PCT, PROPI, dan KAF)
Spektra sampel sediaan farmasi (tablet)
B. Optimasi kalibrasi multivariat menggunakan partial least
square (PLS)
Partial least square (PLS) digunakan untuk melakukan pengolahan
data karena mampu menghasilkan model kalibrasi dengan kemampuan prediksi yang baik untuk jumlah data yang banyak. Data absorbansi dari 20
set kalibrasi disiapkan sebagai model kalibrasi diukur pada panjang
gelombang 220-313 nm dengan interval panjang gelombang 3 nm. Pada
partial least square (PLS) dilakukan pemilihan panjang gelombang, hal ini
bertujuan untuk memperoleh kinerja model yang optimum meskipun pada metode partial least square (PLS) secara komputerisasi dapat mencakup seluruh spektrum (El Gindy, 2006).
Kebaikan suatu model kalibrasi dapat dilihat dari nilai koefisien determinasi (R2) dan nilai RMSEC (root mean square error of calibration). Hasil dari analisis varian untuk senyawa parasetamol, propifenazon, dan kafein adalah nilai p = 0,000 menunjukkan bahwa terdapat hubungan yang signifikan antara kedua variabel dalam hal ini konsetrasi dan absorbansi. Selisih antara nilai sebenarnya dan nilai terhitung yang dihasilkan sangat kecil yang menunjukkan pengukuran yang dilakukan oleh model kalibrasi baik, kemudian diproses menggunakan Microsoft Excel untuk menentukan nilai R2 dan nilai RMSEC.
Sebagaimana dalam analisis instrumental pada umumnya, maka tahapan pertama yang dilakukan adalah menyiapkan model kalibrasi dengan membuat campuran yang terdiri dari parasetamol, propifenazon, dan kafein
dengan komposisi konsentrasi obatnya sebagaimana dalam Tabel V yang merupakan hasil pengolahan data yang diperoleh dari pembuatan model kalibrasi parasetamol, propifenazon, dan kafein. Konsentrasi sebenarnya adalah konsentrasi yang dibuat berdasarkan bilangan acak pada tahap pembuatan set kalibrasi, sedangkan konsntrasi terhitung merupakan konsentrasi yang diprediksikan oleh model kalibrasi PLS.
Tabel V. Nilai konsentrasi sebenarnya (actual response) vs konsentrasi terhitung (calculated response) menggunakan spektrofotometri UV-PLS tanpa
cross validation pada panjang gelombang 220-313 nm N
o
Konsentrasi (µg/mL)
PCT PROPI KAF
Sebenarnya Terhitung Sebenarnya Terhitung Sebenarnya Terhitung
1 5,8 5,77066 3,5 3,51837 1,5 1,47959 2 7,1 7,05251 3,1 2,89564 1,2 1,29613 3 5,2 5,20979 3,4 3,54848 0,5 0,41901 4 6,6 6,59923 4,7 4,68976 0,6 0,61707 5 4 3,9998 4,3 4,3271 0,7 0,66428 6 6,1 6,15229 3,6 3,60682 0,8 0,78476 7 5,6 5,62027 4,4 4,48832 2,0 1,96576 8 3,9 3,88761 3,9 3,91042 0,9 0,90564 9 6,3 6,30969 2,1 2,14829 1,8 1,76964 10 3,8 3,79138 2,3 2,33285 1 1,00518 11 7 7,01089 3,6 3,67687 2 1,9727 12 6,8 6,78876 2,9 2,86851 1,9 1,89113 13 4,5 4,50794 4,4 4,23057 1,4 1,48311 14 6,4 6,43501 2,6 2,64747 0,7 0,68175 15 5 4,99175 3,6 3,58413 1,2 1,22162 16 7,3 7,29625 3,2 3,18993 1,6 1,63279 17 6,1 6,07108 2,4 2,32971 0,8 0,83733 18 6,3 6,23926 4,7 4,62668 1,2 1,24191 19 4,5 4,52631 3,6 3,56571 1,2 1,20179 20 7,2 7,23951 3,4 3,51437 1,9 1,82882
Sampel kalibrasi ini selanjutnya dimodelkan dengan menggunakan kalibrasi multivariat partial least square (PLS). Parasetamol dimodelkan
pada panjang gelombang 313 nm. Pemilihan panjang gelombang 220-313 nm bertujuan untuk mengurangi sebagian data yang mungkin bersifat tidak informatif dan untuk mendapatkan model kalibrasi dengan kemampuan prediksi yang optimum. Adapun kurva hubungan antara nilai kadar terprediksi dan nilai aktual parasetamol, propifenazon, kafein dalam
set kalibrasi dapat dilihat pada Gambar 10, 11, 12. berikut :
Gambar 10. Kurva hubungan antara kadar parasetamol sebenarnya (actual
value) vs kadar terhitung (calculated value) parasetamol dengan metode
spektrofotometri UV-PLS pada panjang gelombang 220 -313 nm
5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 Actual Response C a lc u la te d R e s p o n s e PLS Response Plot (response is PROPI) 10 components
Gambar 11. Kurva hubungan antara kadar propifenazon sebenarnya (actual
value) vs kadar terhitung (calculated value) propifenazon dengan metode
spektrofotometri UV-PLS pada panjang gelombang 220 -313 nm
7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 Actual Response C a lc u la te d R e s p o n s e PLS Response Plot (response is PCT) 10 components
2,00 1,75 1,50 1,25 1,00 0,75 0,50 2,00 1,75 1,50 1,25 1,00 0,75 0,50 Actual Response C a lc u la te d R e s p o n s e PLS Response Plot (response is CAFF) 10 components
Gambar 12. Kurva hubungan antara kadar kafein sebenarnya (actual value) vs kadar terhitung (calculated value) kafein dengan metode spektrofotometri
UV-PLS pada panjang gelombang 220 -313 nm
Tabel VI. Hasil persamaan , R2, dan RMSEC yang didapat dari hubungan antara nilai kadar sebenarnya (actual value) vs nilai terhitung (calculated
value) dengan metode spektrofotometri UV-PLS tanpa cross validation pada
panjang gelombang 220-313 nm
PCT PROPI KAF
Persamaan y = 0,9994x + 0,0034 y = 0,9878x + 0,0426 y = 0,9919x + 0,0101
R2 0,9994 0,9878 0,9919
RMSEC 0,027445698 0,082897315 0,043408954
Dari Tabel VI yang merupakan hasil konsentrasi sebenarnya dan konsentrasi terhitung kemudian diproses menggunakan perangkat lunak
ms.excel 2010 untuk menentukan nilai R2 dan nilai RMSEC.
RMSEC menunjukkan selisih kadar prediksi dengan kadar aktual sehingga jika nilai RMSEC nya semakin kecil maka model – model tersebut dapat dikatakan semakin baik karena faktor kesalahannya semakin kecil (Pindyck and Rubinfeld, 1998).
Hasil persamaan , R2, dan RMSEC dapat dilihat pada Tabel VI. Nilai RMSEC (root mean square error of calibration) yang diperoleh adalah 0,027 untuk PCT, 0,082 untuk PROPI, dan 0,043 untuk KAF. Nilai RMSEC yang diperoleh sangat baik karena mendekati 0.
C. Validasi model kalibrasi multvariat PLS
Kemampuan prediksi dari model kalibrasi multivariat divalidasi degan dua proses yaitu validasi internal dan validasi eksternal. Validasi internal (cross validation) bertujuan untuk menangani masalah overfitting yang seringkali terjadi dalam proses pembuatan model, sedangkan validasi eksternal bertujuan untuk mengetahui kemampuan prediksi dari keseluruhan model kalibrasi multivariat PLS dengan menetapkan konsentrasi larutan yang telah diketahui.
1. Validasi Silang (cross validation)
Model kalibrasi ketiga senyawa obat (PCT, PROPI, dan KAF) yang dihasilkan mampu memberikan prediksi yang baik dengan nilai koefisien determinasi (R2) parasetamol 0,9994, propifenazon 0,9878, kafein 0,9919. Selanjutnya model kalibrasi ini dilakukan validasi silang (cross validation) dengan menggunakan teknik leave-one out. Dalam teknik ini, salah satu sampel kalibrasi (misal sampel nomor 1) dikeluarkan, lalu sampel ini dimodelkan dengan sampel yang tersisa. Selanjutnya dihitung nilai terprediksi sampel 1 dari model kalibrasi sampel yang tersisa. Hal ini dilakukan terus–menerus sampai sampel dikeluarkan satu persatu dan
dimodelkan dengan sampel kalibrasi yang tersisa. Hasilnya dapat dilihat pada Tabel VII. hubungan antara nilai sebenarnya suatu analit dengan nilai terprediksi yang sudah divalidasi (cross validation) menggunakan teknik
leave-one out dengan metode PLS pada panjang gelombang 220-313 nm.
Tabel VII. Nilai sebenarnya dan nilai terhitung hasil kalibrasi pls dari sampel yang dilakukan validasi silang (cross validation) yang mengandung
parasetamol (PCT), propifenazon (PROPI), dan kafein (KAF)
Nomor Campuran
Konsentrasi (µg/mL)
PCT PROPI KAF
Sebenarnya Terhitung Sebenarnya Terhitung Sebenarnya Terhitung
1 5,75522 5,69975 3,65866 3,68038 1,38956 1,37482 2 7,05381 7,01071 2,79465 2,63207 1,35455 1,44016 3 5,20955 5,247 3,45997 3,46215 0,48775 0,51071 4 6,59437 6,58473 4,72492 4,72601 0,58667 0,59199 5 4,01261 4,03477 4,30025 4,33714 0,66383 0,58482 6 6,14643 6,19104 3,59539 3,58442 0,80239 0,80994 7 5,62441 5,62749 4,29166 4,20458 2,08606 2,15583 8 3,89111 3,8241 3,8917 3,76535 0,91807 1,08007 9 6,31005 6,31886 2,16611 2,24273 1,7571 1,70521 10 3,79433 3,79379 2,40636 2,48704 0,96856 0,94366 11 6,99635 7,04102 3,7108 3,94612 1,96758 1,85372 12 6,79089 6,7795 2,83819 2,81941 1,9054 1,90402 13 4,4964 4,49102 4,30366 4,26383 1,44517 1,4633 14 6,43525 6,51072 2,6318 2,68849 0,69071 0,66018 15 4,97807 4,97735 3,5743 3,57149 1,19961 1,19533 16 7,3197 7,33268 3,18242 3,18466 1,62454 1,62625 17 6,06316 5,96793 2,30895 2,21968 0,85277 0,89704 18 6,24785 6,1207 4,63017 4,58746 1,25553 1,28817 19 4,53748 4,54785 3,59021 3,58918 1,19482 1,19348 20 7,24297 7,42754 3,63985 3,86225 1,74932 1,61917 Persamaan y = 1,0125x - 0,071 y = 0,9919x + 0,0358 y = 0,9718x + 0,035 R2 0,997 0,983 0,982 RMSECV 0,0620 0,0954 0,0630 PRESS 0,156 0,782 0,279
Dari hasil diatas dapat dilihat bahwa nilai koefisien determinasi (R2) yang dihasilkan > 0,9 dan nilai RMSECV dan PRESS yang dihasilkan
rendah (mendekati nol) maka kemampuan model untuk memprediksi semakin baik.
Data dan parameter hasil validasi silang leave one-out parasetamol, propifenazon, dan kafein dapat dilihat pada Gambar 13, 14, 15 :
PLS Regression: PCT versus 253; 256; 259; 262; 271; 274; 277; 280; ...
Cross-validation Leave-one-out Components to evaluate Set
Number of components evaluated 10 Number of components selected 9
Analysis of Variance for PCT
Source DF SS MS F P
Regression 9 25,2606 2,80673 1657,48 0,000 Residual Error 10 0,0169 0,00169
Total 19 25,2775
Model Selection and Validation for PCT
Components X Variance Error R-Sq PRESS R-Sq (pred) 1 0,92489 20,1053 0,204618 23,5800 0,067156 2 0,98766 7,2132 0,714641 9,8431 0,610599 3 0,99980 1,8612 0,926369 2,7101 0,892786 4 0,99995 0,2489 0,990155 0,4887 0,980665 5 0,99996 0,1082 0,995718 0,4678 0,981493 6 0,99999 0,0916 0,996378 0,3407 0,986521 7 0,99999 0,0249 0,999013 0,2802 0,988913 8 1,00000 0,0188 0,999257 0,1578 0,993756 9 1,00000 0,0169 0,999330 0,1566 0,993807 10 0,0151 0,999404 0,1919 0,992410
Gambar 13. Data dan Parameter Hasil Validasi Silang Parasetamol dengan Teknik Leave One- Out
PLS Regression: PROPI versus 253; 256; 259; 262; 271; 274; 277; 280; ...
Cross-validation Leave-one-out Components to evaluate Set
Number of components evaluated 10 Number of components selected 6
Analysis of Variance for PROPI
Source DF SS MS F P
Regression 6 11,1372 1,85620 97,19 0,000 Residual Error 13 0,2483 0,01910
Total 19 11,3855
Model Selection and Validation for PROPI
Components X Variance Error R-Sq PRESS R-Sq (pred) 1 0,90026 10,8752 0,044816 12,8357 0,000000 2 0,98657 8,4317 0,259437 10,9423 0,038923 3 0,99979 6,7868 0,403906 10,1894 0,105050 4 0,99995 0,8378 0,926414 1,8014 0,841781 5 0,99997 0,4074 0,964222 1,5964 0,859788 6 0,99999 0,2483 0,978193 0,7820 0,931315 7 0,2010 0,982342 1,5140 0,867021 8 0,1676 0,985277 1,9253 0,830901 9 0,1487 0,986944 2,1089 0,814772 10 0,1391 0,987779 2,2584 0,801640
Gambar 14. Data dan parameter hasil validasi silang propifenazon dengan teknik leave one-out
PLS Regression: CAFF versus 253; 256; 259; 262; 271; 274; 277; 280; ...
Cross-validation Leave-one-out Components to evaluate Set
Number of components evaluated 10 Number of components selected 6
Analysis of Variance for CAFF
Source DF SS MS F P
Regression 6 4,58881 0,764801 123,21 0,000 Residual Error 13 0,08069 0,006207
Total 19 4,66950
Model Selection and Validation for CAFF
Components X Variance Error R-Sq PRESS R-Sq (pred) 1 0,91806 4,15945 0,109231 4,81996 0,000000 2 0,98819 2,53358 0,457420 3,53777 0,242366 3 0,99979 2,02138 0,567109 3,04110 0,348731 4 0,99995 0,42619 0,908729 0,94181 0,798306 5 0,99997 0,15410 0,966999 0,82296 0,823758 6 0,99999 0,08069 0,982719 0,27957 0,940128 7 0,06369 0,986361 0,41103 0,911976 8 0,04728 0,989875 0,56049 0,879969 9 0,04080 0,991263 0,58235 0,875287 10 0,03800 0,991863 0,58169 0,875428
Gambar 15. Data dan parameter hasil validasi silang kafein dengan teknik
Validasi silang juga dapat menentukan jumlah komponen optimum yang mencirikan data (Ardiyanti, 2014). Berdasarkan hasil validasi silang ini diketahui parasetamol mempunyai 9 komponen, propifenazon mempunyai 6 komponen, dan kafein mempunyai 6 komponen.
Adapun profil hubungan antara kadar prediksi dan kadar aktual parasetamol, propifenazon, kafein dengan validasi silang leave one-out pada Gambar 16, 17, 18 : 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 Actual Response C a lc u la te d R e s p o n s e Fitted C rossv al Variable PLS Response Plot (response is PCT) 9 components
Gambar 16. Kurva hubungan antara kadar parasetamol sebenarnya (actual
value) vs kadar terhitung (calculated value) hasil validasi silang leave one-out
dengan metode spektrofotometri UV-PLS pada panjang gelombang 220-313 nm
5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 Actual Response C a lc u la te d R e s p o n s e Fitted C rossv al Variable PLS Response Plot (response is PROPI) 6 components
Gambar 17. Kurva hubungan antara kadar propifenazon sebenarnya (actual
value) vs kadar terhitung (calculated value) hasil validasi silang leave one-out
dengan metode spektrofotometri UV-PLS pada panjang gelombang 220-313 nm 2,25 2,00 1,75 1,50 1,25 1,00 0,75 0,50 2,25 2,00 1,75 1,50 1,25 1,00 0,75 0,50 Actual Response C a lc u la te d R e s p o n s e Fitted C rossv al Variable PLS Response Plot (response is CAFF) 6 components
Gambar 18. Kurva hubungan antara kadar kafein sebenarnya (actual value) vs kadar terhitung (calculated value) hasil validasi silang leave one-out dengan
metode spektrofotometri UV-PLS pada panjang gelombang 220-313 nm
Parameter validasi pada analisis multivariat adalah presisi dan akurasi. Presisi dideskripsikan dengan nilai RMSEC (root mean square
error of calibration), RMSECV (root mean square error of cross validation), , dan PRESS (predicted residual sum of squares), yang mana
semakin kecil nilainya semakin kecil kesalahan prediksi dan semakin baik kemampuan model untuk memprediksi atau semakin baik presisinya. Akurasi dinyatakan dalam koefisien determinasi (R2). Semakin dekat R2 dengan 1 menunjukkan hubungan antara nilai aktual dan nilai prediksi yang semakin baik atau semakin baik presisinya. Selain itu akurasi juga dapat dideskripsikan dengan persamaan y= Bx + A, yang mana x = kadar sebenarnya dan y = kadar terprediksi. Akurasi yang baik jika nilai A mendekati 0 dan B mendekati 1 (Danzer et al, 2004).
RMSECV menggambarkan kemampuan prediksi, nilai RMSECV dapat ditentukan dari nilai PRESS, semakin kecil nilai RMSECV maka kemampuan model untuk memprediksi semakin baik (El-Gindy et al., 2006).
2. Validasi Eksternal
Validasi eksternal dilakukan dengan cara menetapkan konsentrasi 10 larutan validasi dengan hasil yang dapat dilihat pada Tabel VIII. Nilai sebenarnya merupakan nilai yang dibuat pada proses penentuan konsentrasi larutan, sementara itu nilai terhitung merupakan nilai yang diperoleh dari penetapan konsentrasi larutan dengan koefisien model kalibrasi yang telah melewati proses validasi internal.
Tabel VIII. Evaluasi nilai sebenarnya dan terhitung hasil kalibrasi PLS dari 10 larutan set validasi yang mengandung parasetamol (PCT), propifenazon
(PROPI), dan kafein (KAF).
No
Konsentrasi (µg/mL)
PCT PROPI KAF
Sebenarnya Terhitung Sebenarnya Terhitung Sebenarnya Terhitung
1 5,3 5,378 4,4 4,241 2,8 2,942 2 7,7 7,682 3 3,181 2,2 2,33 3 6,2 6,092 2,2 2,01 2,8 2,745 4 4,8 4,712 2,8 2,735 2 1,844 5 7,5 7,442 3,7 3,634 1,1 0,951 6 5,8 5,702 2,5 2,655 1,1 0,939 7 6,7 6,541 2,7 2,804 0,9 1,067 8 7,1 7,011 2,2 2,326 1,2 1,113 9 8,4 8,313 3,1 3,239 1 1,183 10 4,8 4,714 3,3 3,167 1,1 1,12 persamaan y = 0,9946x - 0,0365 y = 0,9196x + 0,2496 y = 1,014x - 0,0194 R2 R² = 0,9975 R² = 0,9564 R² = 0,967 RMSEP 0,0982 0,1454 0,1421
Data yang diperoleh dari Tabel VIII menjelaskan kemampuan prediksi dari model kalibrasi PLS yang diperoleh setelah tahap cross
validation. Kemampuan prediksi yang masih dapat diterima pada validasi
eksternal terlihat dengan nilai R2 yang diperoleh untuk parasetamol 0,9975, untuk propifenazon 0,956, dan untuk kafen 0,967 serta nilai RMSEP parasetamol 0,0982, profipenazon 0,1454, dan kafein 0,1421.
Tabel IX. rekapitulasi evaluasi parameter validasi metode spektrofotometri UV- PLS
Tahap
Parameter
Validasi PCT PROPI KAFF
Kalibrasi RMSEC 0,027 0,082 0,043
R² 0,9994 0,9878 0,9919
a 0,0034 0,0426 0,0101
b 0,9994 0,9878 0,9919
Validasi Internal RMSECV 0,062 0,095 0,063
cross validation R2 0,997 0,983 0,982 PRESS 0,156 0,782 0,279 a -0,071 0,0358 0,035 b 1,0125 0,9919 0,9718 Validasi Eksternal RMSEP 0,0982 0,1454 0,1421 R2 0,9975 0,9564 0,967 a -0,0365 0,2496 -0,0194 b 0,9946 0,9196 1,014
Melihat parameter yang dihasilkan dari uji validasi silang dapat dilihat pada Tabel IX. dengan teknik leave one-out dan validasi eksternal yang sudah dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa model ini masih baik digunakan untuk penetapan kadar sampel sediaan farmasi, karena nilai R2 > 0,9 , RMSEP dan RMSECV-nya kecil.
D. Penetapan kadar sampel sediaan farmasi
Pada penelitian ini yang digunakan sebagai sampel adalah sediaan farmasi dalam bentuk tablet yang mengandung parasetamol, propifenazon, dan kafein. Selanjutnya sediaan ini dibuat dalam konsentrasi yang berada dalam kisaran yang tercakum dalam kurva kalibrasi.
Pada penelitian ini terlebih dahulu dilakukan uji keseragaman bobot agar dapat diketahui tablet mana yang beratnya menyimpang dari
berat rata-rata tablet. Uji keseragaman bobot tablet dilakukan dengan mengambil sampel tablet sebanyak 20 tablet kemudian dihitung bobot rata– ratanya. Dari hasil penimbangan didapatkan bobot rata–rata 20 tablet adalah 655,635 mg sehingga diketahui bahwa tablet merk S mengandung bahan tambahan kurang lebih 650 mg karena kandungan tablet mengandung parasetamol 250 mg, propifenazon 150 mg, kafein 50 mg, dan sisa dari senyawa aktif adanya bahan tambahan atau bahan pengisi (talk) mengandung 200 mg. Menurut Farmakope Edisi III untuk tablet yang memiliki bobot rata–rata > 500 mg syarat keseragaman bobotnya tidak lebih dari 2 tablet yang masing–masing bobotnya menyimpang dari 5%, dan tidak satu tabletpun bobotnya menyimpang dari 10% (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1979). Dari hasil penimbangan tidak ada satu pun bobot tablet yang menyimpang dari bobot rata- rata tablet.
Penetapan kadar sampel dilakukan dengan melarutkan sejumlah serbuk yang sudah digerus dan dihomogenkan ke dalam pelarut akuabides lalu diukur menggunakan spektrofotometri UV pada panjang gelombang 220-313 nm.
Profil overlay spektra dari 6 sampel terlihat pada Gambar 19. :
Gambar 19. Overlay spektra 6 sampel sediaan farmasi dalam pelarut akuabides pada panjang gelombang 200-400 nm.
Data absorbansi sampel dengan interval 3 nm pada panjang gelombang 220-313 nm dikalikan dengan koefisien yang didapatkan dari validasi silang menggunakan teknik leave one-out, sehingga didapatkan hasil penetapan kadar parasetamol, propifenazon, dan kafein dengan menggunakan spektrofotometer UV-PLS. Hasil penetapan kadar sampel sediaan farmasi dapat dilihat pada Tabel X, XI, XII .
Tabel X. Hasil penetapan kadar prediksi parasetamol dalam sediaan farmasi tablet menggunakan metode spektrofotometri UV-PLS
Evaluasi PCT Sampel
1 2 3 4 5 6
Calculated 4,388 4,636 4,592 4,792 4,658 3,981
Penimbangan 65,25 65,10 65,10 65,20 65,25 65,10
Pengenceran 5000 5000 5000 5000 5000 5000
bobot rata rata
(tab) 655,635 655,635 655,635 655,635 655,635 655,635
Etiket (mg) 250 250 250 250 250 250
kadar mg/tab 220,454 233,45 231,234 240,935 234,018 200,467
Rata – rata
kadar mg/tab 226,76 mg/tab = 90,70%
SD 14,49
RSD 6,39 %
Tabel XI. Hasil penetapan kadar prediksi propifenazon dalam sediaan farmasi tablet menggunakan metode spektrofotometri UV-PLS
Evaluasi PROPI Sampel 1 2 3 4 5 6 Calculated 2,705 2,913 2,766 2,881 2,628 2,298 Penimbangan 65,25 65,10 65,10 65,20 65,25 65,10 Pengenceran 5000 5000 5000 5000 5000 5000
bobot rata rata
(tab) 655,635 655,635 655,635 655,635 655,635 655,635
Etiket (mg) 150 150 150 150 150 150
Kadar mg/tab 135,89 146,687 139,284 144,853 132,031 115,718
Rata – rata
kadar mg/tab 135,74 mg/tab = 90,49 %
SD 11,23
Tabel XII. Hasil penetapan kadar prediksi kafein dalam sediaan farmasi tablet menggunakan metode spektrofotometri UV-PLS
Evaluasi KAFF Sampel
1 2 3 4 5 6
Calculated 1,063 1,051 1,072 0,973 1,042 0,964
penimbangan 65,25 65,10 65,10 65,20 65,25 65,10
pengenceran 5000 5000 5000 5000 5000 5000
bobot rata rata
(tab) 655,635 655,635 655,635 655,635 655,635 655,635
Etiket (mg) 50 50 50 50 50 50
kadar mg/tab 53,405 52,924 53,981 48,921 52,35 48,543
Rata – rata
kadar mg/tab 51,69 mg/tab = 103,38%
SD 2,35
RSD 4,55 %
Berdasarkan hasil penetapan kadar sampel diperoleh nilai RSD untuk parasetamol 6,39%, propifenazon 8,27%, dan kafein 4,55%. Menurut Horwitz cit, Gonzales, Herrador, dan Asuero untuk konsentrasi analit dibawah 10 ppm memberikan simpangan baku relatif atau kofisien variasi < 11,3%. Hal ini menunjukkan bahwa ketiga senyawa memiliki presisi yang baik. Rentang kadar untuk parasetamol 212,27–241,25 mg/tab, propifenazon 124,51-146,97 mg/tab, dan kafein 49,34-54,04 mg/tab. Rata-rata kadar untu parasetamol 90,70%, propifenazon 90,49%, dan kafein 103,38%. Menurut Wood (1998) persyaratan rata-rata kadar untuk ketiga senyawa dengan analit matrik pada sampel dibawah 10 ppm adalah 90 – 107% dari yang tertera pada etiket sehingga kadar yang diperoleh pada penelitian ini berada