ANALISIS PARASETAMOL, KAFEIN, DAN PROPIFENAZON
Metode analisis obat untuk penetapan kadar adalah spektofotometri UV yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat PLS. Metode ini mampu menetapkan kadar senyawa multikomponen yang mempunyai masalah
overlapping pada spektra UV.
Metode spektrofotomeri UV yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat partial least square (PLS) digunakan untuk analisis senyawa multikomponen dalam sediaan farmasi tanpa adanya tahap pemisahan.Tiga model campuran parasetamol, propifenazon, dan kafein akan dioptimasi untuk analisis menggunakan spektrofotometri UV dan kalibrasi multivariat PLS. Model kalibrasi akan dibuat dengan membuat 20 campuran sintetik dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 220-313 nm dengan interval 3 nm. Kemudian dievaluasi berdasarkan koefisien determinasi (R2), kesalahan pemodelan kalibrasi root mean square error of calibration (RMSEC) dan kesalahan pemodelan kalibrasi pada validasi root mean square error of
calibration validation (RMSECV).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa spektrofotometri UV yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat PLS dapat digunakan untuk analisis senyawa multikomponen dalam sediaan farmasi tanpa adanya tahap pemisahan. Nilai koefisien determinasi untuk hubungan antara konsentrasi sebenarnya dengan konsentrasi terprediksi tanpa validasi silang leave one out pada parasetamol, propifenazon, dan kafein adalah 0,9994 ; 0,9878; 0,9919 dengan nilai RMSEC 0,027; 0,082; 0,043 dan nilai koefisien determinasi dengan validasi silang leave one out 0,997; 0,983; 0,982 dengan nilai RMSECV 0,062; 0,095; 0,982. Nilai presentase kedekatan kadar terhitung dengan kadar dalam etiket untuk parasetamol, propifenazon, dan kafein adalah 90,70%; 90,49%; 103,38%.
ANALYSIS PARACETAMOL, CAFFEINE, AND combined with multivariate calibration PLS. This method can to assay for analysis multicomponent drug have a problem of overlapping in spektra UV.
The method UV spectrophotometric couple with multivariate calibration partial least square (PLS) has been developed for quantitative analysis of multicomponent drugs without separations step. Three mixture model paracetamol, propifenazone, and caffeine will be optimized for analysis using UV spectrophotometric and PLS multivariate calibration. The calibration model is prepared by developing a series 20 mixture of synthetic and measured absorbance at a wavelength of 220-313 nm with an interval of 3 nm. The evaluation of calibration model will be relied on coefficient of determination (R2), root mean
square error of calibration (RMSEC) and root mean square error of calibration validation (RMSECV).
The results showed that UV spectrophotometry combined with multivariate calibration PLS can be used for quantitative analysis of multicomponent drugs without separations step. The coefficient of determination for the relationship between the actual consentration with predicted concentration without the leave-one-out cross validation on paracetamol, propifenazone, and caffeine is 0.9994; 0.9878; 0.9919 with RMSEC value 0.027; 0.082; 0.043 and the coefficient of determination with a leave-one-out cross validation 0.997; 0.983; 0.982 for RMSECV value 0.062; 0.095; 0.982. Percentage recovery for paracetamol, propifenazone, and caffeine is 90,70%; 90,49%; 103,38%.
ANALISIS PARASETAMOL, KAFEIN, DAN PROPIFENAZON DENGAN METODE SPEKTROFOTOMETRI UV DAN KEMOMETRIKA TANPA
TAHAP PEMISAHAN
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Arief Dzulfianto
NIM : 118114157
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
i
ANALISIS PARASETAMOL, KAFEIN, DAN PROPIFENAZON DENGAN METODE SPEKTROFOTOMETRI UV DAN KEMOMETRIKA TANPA
TAHAP PEMISAHAN
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Arief Dzulfianto
NIM : 118114157
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
ii
iv
Halaman Persembahan
Everybody is a genius. But if you judge a fish by its
ability to climb a tree it will live its whole life believing
that it is stupid
-
Albert Einstein –
TERUNTUK
Allah SWT yang Maha Pemberi Petunjuk dan Pemberi
Kemudahan di segala Hal
Keluarga yang selalu memberikan dukungan dan doa
v
vii
PRAKATA
Puji Syukur dan terima kasih kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala
rahmat dan karunia– NYA sehingga Skripsi dengan judul “Analisis Parasetamol,
Kafein, dan Propifenazon dengan Metode Spektrofotometri UV dan Kemometrika
tanpa Tahap Pemisahan“ ini dapat diselesaikan dengan baik.
Selama menulis Skripsi ini, penulis menyadari bahwa ada begitu banyak
pihak yang telah berkontribusi besar dalam proses pengerjaan Skripsi ini. Oleh
karena itu penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada :
1. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt., selaku dekan Universitas Sanata
Dharma
2. Prof. Dr. Abdul Rohman, M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing utama yang
dengan penuh kesabaran memberikan masukan, ilmu, perhatian, dan support
yang telah diberikan dari awal penelitian hingga selesainya Skripsi ini.
3. Bapak Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc., selaku dosen pembimbing
pedamping yang juga memberikan semangat, bimbingan, kritik dan saran
kepada penulis agar Skripsi ini selesa dengan baik.
4. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku dosen pembimbing akademik yang
memberikan dukungan dan semangat kepada penulis dalam proses pengerjaan
skripsi ini dan selama menjalankan studi di Fakultas Farmasi Universitas
viii
5. Dosen penguji yang akan memberikan kritik dan saran yang akan membuat
penulisan naskah ini menjadi lebih baik.
6. PT. Konimex yang telah bersedia memberikan bahan baku standart
parasetamol, kafein, dan propifenazon untuk dianalisis dalam pembuatan
skripsi ini.
7. Mas Bimo dan Pak Kethul selaku staff Laboratorium Kimia Analisis
Instrumental yang telah memberikan banyak kemudahan kepada penulis
dalam proses penelitian ini.
8. Bapak, Ibu, Mas Shodiq, Mbak Citra, Hanif untuk segala doa, dukungan,
motivasi dan perhatian kepada penulis selama pembuatan skripsi ini.
9. Kakak Ipar yang selalu menyediakan makanan agar penulis tidak kelaparan
saat pembuatan naskah skripsi ini.
10.Ade, Jalaq, Erfan, Opphi, Devina selaku rekan sekelompok skripsi yang sudah
berjuang bersama dan membantu dalam proses penelitian skripsi ini.
11.Teman–teman FST B 2011 yang selalu memberikan semangat dalam
pembuatan skripsi.
12.Arinda Sulistyawati, Ade Savitri atas kebersamaan yang selalu memberikan
support, mengajak travelling agar penulis tidak stress dalam pengerjaan proses
skripsi ini.
13.Ary, Alva, Alip, Dajal, Ampau, Alpin, Tepe, Eka, Emre sebagai sahabat yang
selalu memberikan dukungan dan motivasi kepada penulis dalam proses
ix
14.BIGFAM yang selalu memberikan support kepada penulis dalam pembuatan
skripsi.
15.Seluruh Crew Unik Merchandise yang memberikan semangat dalam
pembuatan skripsi.
16.Seluruh teman, baik di Universitas Sanata Dharma maupun di luar yang selalu
memberikan semangat dan dukungan dalam pembuatan skripsi.
17.Semua pihak yang membantu penulis selama proses penelitian hingga
selesainya skripsi, yang tidak dapat penulis sebutkan satu – persatu.
Penulis menyadari bahwa tugas akhir ini masih memiliki banyak
kekuangan dan ketidak sempurnaan, maka itu penulis mengharapkan kritik dan
saran dari semua pihak.
Akhir kata, semoga penilitian skripsi yang penulis lakukan dapat
bermanfaat bagi perkembangan di dunia kefarmasian.
Yogyakarta, 10 Desember 2015
x
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ii
HALAMAN PENGESAHAN iii
HALAMAN PERSEMBAHAN iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA v
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI vi
PRAKATA vii
DAFTAR ISI x
DAFTAR TABEL xiii
DAFTAR GAMBAR xv
DAFTAR LAMPIRAN xviii
DAFTAR SINGKATAN xx
INTISARI xxi
ABSTRACT xxii
BAB I PENGANTAR 1
A. Lalar Belakang 1
1. Perumusan masalah 3
2. Keaslian Penelitian 3
3. Manfaat penelitian 4
B. Tujuan Penelitian 4
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA 6
xi
1. Parasetamol 6
2. Kafein 7
3. Propifenazon 8
B. Spektrofotometri UV/VIS 8
C. Analisis Multikompeen secara Spektrofotometri UV 10
1. Kemungkinan pertama 11
2. Kemungkinan kedua 11
3. Kemungkinan ketiga 12
D. Kemometrika 13
E. Validasi Metode Analisis Kalibrasi Multivariat 15
1. Presisi 16
2. Akurasi 18
3. Selektivitas 19
F. Landasan Teori 19
G. Hipotesis 21
BAB III METODOLOGI PENELITIAN 22
A.Jenis dan Rancangan Penelitian 22
B.Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 22
1. Variabel 22
2. Definisi Operasional 22
C.Bahan Penelitian 23
D.Alat Penelitian 23
xii
1. Scanning spektra standar 24
2. Pemilihan interval pengukuran dan panjang gelombang pengukuran
untuk set kalibrasi 24
3. Penyiapan larutan set kalibrasi dan set validasi eksternal 24
4. Uji keseragaman bobot tablet 26
5. Analisis sampel 27
6. Analisis statistik kalibrasi multivariat (PLS) 27
a. Model kalibrasi multivariat PLS 27
b. Cross validation leave one-out 28
7. Analisis data sampel 29
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 32
A. Analisis parasetamol, propifenazon, kafein secara simultan menggunakan
metode spektrofotometri UV 32
B. Optimasi kalibrasi multivariat menggunakan partial least square (PLS)
34
C. Validasi model kalibrasi multivariat PLS 38
1. Validasi silang (cross validation) 39
2. Validasi eksternal 45
D. Penetapan kadar sampel sediaan farmasi 47
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 50
A. Kesimpulan 50
B. Saran 51
xiii
LAMPIRAN 55
xiv
DAFTAR TABEL
Tabel I. Kriteria penerimaan nilai RSD 18
Tabel II. Nilai % recovery 19
Tabel III. Komposisi campuran sintetik parasetamol, propifenazon, dan
kafein untuk model kalibrasi 25
Tabel IV. Komposisi campuran sintetik paracetamol Parasetamol, Kafein,
Propifenazon untuk validasi eksternal 26
Tabel V. Nilai konsentrasi sebenarnya (actual response) vs konsentrasi
terhitung (calculated response) menggunakan spektrofotometri
UV-PLS pada panjang gelombang 220-313 nm 34
Tabel VI. Hasil persamaan , R2, dan RMSEC yang didapat dari hubungan antara nilai kadar sebenarnya (actual value) vs nilai terhitung
(calculated value) dengan metode spektrofotometri UV-PLS pada
panjang gelombang 220-313 nm 37
Tabel VII. Nilai sebenarnya dan nilai terhitung hasil kalibrasi pls dari sampel
yang dilakukan validasi silang (cross validation) yang
mengandung parasetamol (PCT), propifenazon (PROPI), dan
xv
Tabel VIII. Evaluasi nilai sebenarnya dan terhitung hasil kalibrasi PLS dari
10 larutan set validasi yang mengandung parasetamol (PCT),
propifenazon (PROPI), dan kafein (KAF). 44
Tabel IX. Rekapitulasi evaluasi parameter validasi metode spektrofotometri
UV- PLS 45
Tabel X. Hasil penetapan kadar prediksi parasetamol dalam sediaan
farmasi tablet menggunakan metode spektrofotometri UV-PLS
49
Tabel XI. Hasil penetapan kadar prediksi propifenazon dalam sediaan
farmasi tablet menggunakan metode spektrofotometri UV-PLS
49
Tabel XII. Hasil penetapan kadar prediksi kafein dalam sediaan farmasi
xvi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur kimia paracetamol 6
Gambar 2. Struktur kimia kafein 7
Gambar 3. Struktur kimia propifenazon 8
Gambar 4. Instrumentasi spektrofotometri UV double beam 10
Gambar 5. Spektrum absorbsi tidak saling tumpang tindih 11
Gambar 6. Spektrum absorpsi tumpang tindih satu arah 12
Gambar 7. Spektrum absorpsi tumpang tindih dua arah 12
Gambar 8. Spektra Uv parasetamol (PCT), propifenazon (PROPI), kafein
(KAF), dan spektra Uv campuran PCT, PROPI, dan KAF yang
diukur pada panjang gelombang 220-400 nm 32
Gambar 9. Spektra Uv sampel sediaan farmasi (tablet) dan spektra Uv
campuran baku parasetamol (PCT), propifenazon (PROPI), kafein
(KAF) yang diukur pada panjang gelombang 200-400 nm. 33
Gambar 10. Kurva hubungan antara kadar parasetamol sebenarnya (actual
response) vs kadar terhitung (calculated response) parasetamol
dengan metode spektrofotometri UV – PLS pada panjang
xvii
Gambar 11. Kurva hubungan antara kadar propifenazon sebenarnya (actual
response) vs kadar terhitung (calculated response) propifenazon
dengan metode spektrofotometri UV – PLS pada panjang
gelombang 220 -313 nm 36
Gambar 12. Kurva hubungan antara kadar kafein sebenarnya (actual response)
vs kadar terhitung (calculated response) kafein dengan metode
spektrofotometri UV – PLS pada panjang gelombang 220 -313
nm. 36
Gambar 13. Data dan parameter hasil validasi silang parasetamol dengan
teknik leave one- out 40
Gambar 14. Data dan parameter hasil validasi silang propifenazon dengan
teknik leave one-out 40
Gambar 15. Data dan parameter hasil validasi silang kafein dengan teknik
leave one-out 41
Gambar 16. Kurva hubungan antara kadar parasetamol sebenarnya (actual
response) vs kadar terhitung (calculated respons) hasil validasi
silang leave one-out dengan metode spektrofotometri UV-PLS
pada panjang gelombang 220-313 nm 42
Gambar 17. Kurva hubungan antara kadar propifenazon sebenarnya (actual
xviii
silang leave one-out dengan metode spektrofotometri UV-PLS
pada panjang gelombang 220-313 nm 42
Gambar 18. Kurva hubungan antara kadar kafein sebenarnya (actual response)
vs kadar terhitung (calculated respons) hasil validasi silang leave
one-out dengan metode spektrofotometri UV-PLS pada panjang
gelombang 220-313 nm 43
Gambar 19. Overlay spektra 6 sampel sediaan farmasi dalam pelarut
xix
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Keseragaman Bobot 56
Lampiran 2. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square
(PLS) parasetamol dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik
tanpa validasi silang leave one-out 57
Lampiran 3. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square
(PLS) propifenazon dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik
tanpa validasi silang leave one-out 58
Lampiran 4. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square
(PLS) kafein dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik tanpa
validasi silang leave one-out 59
Lampiran 5. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square
(PLS) parasetamol dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik
dengan validasi silang leave one-out. 60
Lampiran 6. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square
(PLS) propifenazon dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik
dengan validasi silang leave one-out 61
Lampiran 7. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square
(PLS) kafein dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik
xx
Lampiran 8. Data pengukuran absorbansi kurva baku dengan
spektrofotometri UV pada panjang gelombang 220-313 nm
64
Lampiran 9. Data pengukuran absorbansi sampel dengan spektrofotometri
UV pada panjang gelombang 220-313 nm 66
Lampiran 10. Perhitungan kadar parasetamol pada sampel tablet
menggunakan hasil koefisien validasi silang 68
Lampiran 11. Perhitungan kadar propifenazon pada sampel tablet
menggunakan hasil koefisien validasi silang 70
Lampiran 12. Perhitungan kadar kafein pada sampel tablet menggunakan
hasil koefisien validasi silang 72
Lampiran 13. Sertifikat analisis baku kafein 74
Lampiran 14. Sertifikat analisis baku propifenazon 75
xxi
DAFTAR SINGKATAN
PCT : parasetamol
PROPI : propifenazon
KAF : kafein
UV : ultraviolet
VIS : visible
R2 : koefisien determinasi
RMSEC : root mean square error of calibration
RMSECV : root mean square error of cross validation
RMSEP : root mean square error of prediction
PRESS : predicted residual sum of squares
xxii
INTISARI
Metode analisis obat untuk penetapan kadar adalah spektofotometri UV yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat PLS. Metode ini mampu menetapkan kadar senyawa multikomponen yang mempunyai masalah
overlapping pada spektra UV.
Metode spektrofotomeri UV yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat partial least square (PLS) digunakan untuk analisis senyawa multikomponen dalam sediaan farmasi tanpa adanya tahap pemisahan.Tiga model campuran parasetamol, propifenazon, dan kafein akan dioptimasi untuk analisis menggunakan spektrofotometri UV dan kalibrasi multivariat PLS. Model kalibrasi akan dibuat dengan membuat 20 campuran sintetik dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 220-313 nm dengan interval 3 nm. Kemudian dievaluasi berdasarkan koefisien determinasi (R2), kesalahan pemodelan kalibrasi root mean square error of calibration (RMSEC) dan kesalahan pemodelan kalibrasi pada validasi root mean square error of
calibration validation (RMSECV).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa spektrofotometri UV yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat PLS dapat digunakan untuk analisis senyawa multikomponen dalam sediaan farmasi tanpa adanya tahap pemisahan. Nilai koefisien determinasi untuk hubungan antara konsentrasi sebenarnya dengan konsentrasi terprediksi tanpa validasi silang leave one out pada parasetamol, propifenazon, dan kafein adalah 0,9994 ; 0,9878; 0,9919 dengan nilai RMSEC 0,027; 0,082; 0,043 dan nilai koefisien determinasi dengan validasi silang leave one out 0,997; 0,983; 0,982 dengan nilai RMSECV 0,062; 0,095; 0,982. Nilai presentase kedekatan kadar terhitung dengan kadar dalam etiket untuk parasetamol, propifenazon, dan kafein adalah 90,70%; 90,49%; 103,38%.
xxiii
ABSTRACT
The method analysis of drug for assay is a UV spectrophotometry combined with multivariate calibration PLS. This method can to assay for analysis multicomponent drug have a problem of overlapping in spektra UV.
The method UV spectrophotometric couple with multivariate calibration partial least square (PLS) has been developed for quantitative analysis of multicomponent drugs without separations step. Three mixture model paracetamol, propifenazone, and caffeine will be optimized for analysis using UV spectrophotometric and PLS multivariate calibration. The calibration model is prepared by developing a series 20 mixture of synthetic and measured absorbance at a wavelength of 220-313 nm with an interval of 3 nm. The evaluation of calibration model will be relied on coefficient of determination (R2), root mean
square error of calibration (RMSEC) and root mean square error of calibration validation (RMSECV).
The results showed that UV spectrophotometry combined with multivariate calibration PLS can be used for quantitative analysis of multicomponent drugs without separations step. The coefficient of determination for the relationship between the actual consentration with predicted concentration without the leave-one-out cross validation on paracetamol, propifenazone, and caffeine is 0.9994; 0.9878; 0.9919 with RMSEC value 0.027; 0.082; 0.043 and the coefficient of determination with a leave-one-out cross validation 0.997; 0.983; 0.982 for RMSECV value 0.062; 0.095; 0.982. Percentage recovery for paracetamol, propifenazone, and caffeine is 90,70%; 90,49%; 103,38%.
1
BAB I PENGANTAR
A. Latar Belakang
Salah satu obat yang digunakan luas di masyarakat adalah obat
sakit kepala, dan sakit gigi seperti campuran parasetamol, kafein, dan
propifenazon. Saat ini banyak obat sakit kepala dan sakit gigi beredar di
masyarakat luas, campuran parasetamol, kafein, dan propifenazon banyak
tersedia dalam bentuk sediaan tablet dengan berbagai merek dagang (Tan &
Rahardja, 2007).
Dalam ilmu farmasi, pemeriksaan mutu obat mutlak diperlukan
agar obat dapat sampai pada targetnya dengan kadar yang tepat. Adanya
pengembangan metode spektrofotometri UV yang dikombinasikan dengan
kalibrasi multivariat dapat menganalisis senyawa multikomponen yang
memiliki spektra UV overlapping (Danzer et al, 2004).
Spektrofotometri UV-VIS biasanya hanya digunakan untuk
menganalisis satu senyawa saja. Saat ini dengan berkembangnya perangkat
lunak yang semakin modern dan teknologi semakin canggih, perangkat
lunak komputer terutama analisis multivariat, spektrofotometri UV-VIS
digunakan untuk menganalisis campuran beberapa senyawa obat secara
simultan dengan menggabungkan spektrofotometri UV-VIS dengan
sederhana untuk analisis suatu analit dalam campuran seperti parasetamol,
propifenazon, dan kafein.
Dilihat dari senyawa yang akan dianalisis, parasetamol pada larutan
asam mempunyai panjang gelombang maksimal di sekitar 245 nm dengan
nilai = 688a, pada larutan alkali 257 nm = 715b, kafein dalam
air asam mempunyai λmaks 273nm dan mempunyai nilai sebesar
504a, kafein tidak mempunyai λmaks pada air basa, dan propifenazon dalam
air asam λmaks 240nm mempunyai nilai sebesar 400a; dalam air basa
λmaks 245 , 265nm mempunyai nilai sebesar 385b (Moffat, et al.,
2011). Hal ini bisa dilihat bahwa ketiga senyawa ini akan saling tumpang
tindih atau overlapping, maka perlu adanya pendekatan metode kalibrasi
multivariat “kemometrika” untuk analisis parasetamol, kafein, dan
propifenazon.
Penelitian yang telah berhasil dalam penetapan kadar menggunakan
metode spekrofotmetri UV-VIS yang digabungkan dengan metode kalibrasi
multivariat kemometrik adalah untuk analisis kombinasi obat untuk pereda
rasa nyeri adalah penetapan kadar parasetamol, guaifenesin, dan
klorfeniramin maleat secara simultan (Ardiyanti, 2014).
Penggunaan metode spektrofotometri UV-VIS dengan pendekatan
metode kalibrasi multivariat kemometrika untuk analisis kombinasi
parasetamol, kafein, dan propifenazon dalam sediaan farmasi (tablet) akan
1. Perumusan masalah
Berdasarkan latar belakang yang sudah diuraikan di atas, maka
permasalahan yang muncul adalah :
a. Bagaimana kondisi optimum metode spektrofotometri UV yang
dikombinasikan dengan teknik kalibrasi multivariat PLS untuk
analisis sediaan tablet parasetamol, kafein, dan propifenazon?
b. Bagaimana validasi spektrofotometri UV yang dikombinasikan
dengan kalibrasi multivariat untuk analisis campuran parasetamol,
kafein, dan propifenazon?
c. Bagaimana aplikasi spektrofotometri UV yang dikombinasikan
dengan kalibrasi multivariat untuk penetapan kadar parasetamol,
propifenazon, dan kafein dalam sediaan farmasi tanpa tahap
pemisahan ?
2. Keaslian Penelitian
Yang sudah pernah dilaporkan untuk analisis senyawa
multikomponen dengan spektrofotometri UV yang dikombinasikan kalibrasi
multivariat secar simultan adalah :
a. Kombinasi spektrofotometri UV dan kalibrasi multvariat untuk
analisis parasetamol, guaifenesin, dan klorfeniramin maleat secara
simultan (Ardiyanti, 2014).
b. Analisis sulfametoksazol dan trimetropim secara spektrofotometri
UV dan trimetropim secara simultan tanpa tahap pemisahan
Hasil penelusuran publikasi – publikasi ilmiah menunjukkan bahwa
analisis campuran parasetamol, kafein, dan propifenazon secara simultan
dalam sediaan farmasi secara spektrofotometri UV–Vis yang
dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat belum pernah dilaporkan.
3. Manfaat Penelitian
a. Manfaat Metodelogis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan
alternatif metode analisis untuk menetapkan kadar Parasetamol,
kafein, dan propifenazon dalam sediaan farmasi yang memenuhi
persyaratan validitas yang baik.
b. Manfaat Teoritis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan
tambahan informasi ilmiah mengenai validasi metode penetapan
kadar Parasetamol, kafein, dan propifenazon dalam sediaan farmasi
secara spektrofotometri UV–Vis.
c. Manfaat praktis. Penelitian ini diharapkan dapat digunakan untuk
menetapkan kadar campuran parasetamol, propifenazon, dan kafein
dalam sediaan farmasi yang banyak beredar di pasaran.
B. Tujuan Penelitian
1. Mengetahui optimasi metode spektrofotometri UV yang
dikombinasikan dengan teknik kalibrasi multivariat PLS untuk
2. Mengetahui validasi spektrofotometri UV yang dikombinasikan
dengan kalibrasi multivariat untuk analisis campuran parasetamol,
propifenazon, dan kafein tanpa tahap pemisahan.
3. Mengetahui aplikasi spektrofotometri UV yang dikombinasikan
dengan kalibrasi multivariat untuk penetapan kadar campuran
6
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Kombinasi Obat Pereda Nyeri
Parasetamol dan Propifenazon merupakan obat yang secara luas
digunakan dalam penanganan rasa nyeri (analgetika) dan demam
(antipiretika). Kafein sering dikombinasikan dengan Parasetamol dan
Propifenazon untuk memperkuat efek analgetiknya melalui mekanisme
vasokonstriktif guna untuk mengobati nyeri kepala. Karena terjadi efek
potensiasi, maka dosis masing–masing komponennya diturunkan sehingga
efek samping dapat dikurangi (Tan & Rahardja, 2007).
1. Parasetamol
Struktur parasetamol dapat dilihat pada Gambar 1 memiliki rumus
kimia C8H9NO2 (BM. 151,2) berbentuk kristal atau serbuk berkristal, larut dalam air 1 g dalam 70 mL (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan
Makanan RI, 1979); larut dalam etanol, metanol, dimetilformamid, etilen
diklorid, aseton, dan etil asetat; sangat sedikit larut dalam kloroform; sedikit
larut dalam eter; praktis tidak larut dalam petroleum eter, pentana, dan
Gambar 1. Struktur kimia parasetamol
Spektrum UV parasetamol pada larutan asam mempunyai panjang
gelombang maksimal di sekitar 245 nm dengan nilai = 688a, pada
larutan alkali 257 nm = 715b (Moffat, et al., 2004).
2. Kafein
Struktur Kafein dapat dilihat pada Gambar 2 memiliki rumus kimia
C8H10N4O2(BM. 194,2) berbentuk kristal putih atau serbuk kristal putih.
Gambar 2. Struktur kimia kafein
Titik didih pada 238ºC. Ketika dikristalisasi dari air, kafein
mengandung 1 molekul air dari hasil kristalisasi, tapi bebas dari air ketika
dikristalisasi menggunakan etanol, kloroform atau eter. Larut pada pirol,
pada tetrahidrofuran yang mengandung ± 4% air; larut pada etil asetat; larut
1 g dalam 46 mL air, 1 g dalam 5,5 mL air pada suhu 80ºC, 1 g dalam 1,5
suhu 60ºC, 1g dalam 50 mL aseton, 1 g dalam 5,5 mL kloroform, 1 g dalam
530 mL eter, 1 g dalam 100 mL benzen, 1 g dalam 22 mL benzen mendidih,
sedikit larut dalam petroleum eter. Kelarutan dalam air dapat ditingkatkan
menggunakan benzoat , sinamat, sitrat atau salisilat. pKa kafein 10,4 (40º).
Dalam air asam mempunyai λmaks 273 nm dengan nilai sebesar 504a.
Tidak memiliki λmaks pada air basa (Moffat, et al., 2011).
3. Propifenazon
Struktur propifenazon dapat dilihat pada Gambar 3 memiliki rumus
kimia (C14H18N2O) berbentuk bubuk kristal berwarna putih.
Gambar 3. Struktur kimia propifenazon
Titik didih 103ºC, Larut dalam air 1 g / 400 mL ; sangat larut dalam
etanol dan kloroform; larut dalam eter. Dalam air asam λmaks 240 nm
mempunyai nilai sebesar 400a ; dalam air basa λmaks 245 nm , 265
nm mempunyai nilai sebesar 385b (Moffat, et al., 2011) B. Spektrofotometri UV/VIS
Serapan radiasi digunakan dalam analisis spektrofotometri UV-VIS
dan inframerah. Spektrofotometri UV adalah anggota teknis analisis
dekat (190-380 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer (Mulja
dan Suharman,1995).
Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan atas interaksi antara
radiasi elektromagnetik dengan materi (atom, ion, atau molekul). Interaksi
yang menyebabkan adanya perpindahan energi dari sinar radiasi ke materi
disebut absorbsi (Pecsok et al, 1976). Bila cahaya jatuh pada senyawa, maka
sebagian dari cahaya diserap oleh molekul-molekul sesuai dengan strukur
dari molekul. Setiap senyawa mempunyai tingkatan energi yang spesifik
(Mulja dan Suharman,1995).
Sinar UV memberikan energi yang cukup untuk terjadinya transisi
elektronik. Keadaan paling rendah disebut keadaan dasar (ground state).
Transisi–transisi elektronik akan meningkatkan energi molekular dari
keadaan dasar ke satu atau lebih tingkat energi tereksitasi. Jika molekul
dikenai radiasi elektromagnetik maka molekul tersebut akan menyerap
radiasi elektromagnetik yang energinya sesuai dan terjadi eksitasi ke tingkat
energi yang lebih tinggi disebut orbital elektron anti ikatan (Gandjar dan
Rohman, 2007).
Spektrofotometer double beam merupakan alat pengembangan dari
spektrofotometer single beam karena keterbatasan yang dimiliki oleh
spektrofotometer single beam. Spektrofotometer double beam dapat dilihat
Gambar 4. Instrumentasi spektrofotometri UV double beam
Spektrofotometer double beam memiliki dua sinar yang dibentuk
oleh potongan cermin yang digunakan untuk memecah sinar. Sinar pertama
melewati larutan blanko dan sinar kedua melewati sampel, dengan
dilakukannya sistem ini maka spektrofotometer double beam dapat
mengkoreksi perubahan respon absorbansi akibat perbedaan intensitas
cahaya, fluktuasi pada kelistrikan instrumen dan absorbansi blanko (Haven,
Tetrault, and Schenken, 1994).
C. Analisis Multikomponen secara Spektrofotometri UV Apabila dua atau lebih komponen mempunyai absorbansi pada
panjang gelombang yang sama dan keduanya tidak saling bergantung satu
sama lain maka pengukuran spektrofotometri memberikan harga
penjumlahan absorbansi dari setiap komponen (Swarbick, 1997). Prinsip
tersebut dapat digunakan dalam analisis multikomponen dengan cara
mencari absorbansi atau beda absorbansi tiap – tiap komponen yang akan
dihitung masing–masing kadar campuran tersebut secara serentak atau salah
satu komponen dalam campurannya dengan komponen yang lainya (Mulja
dan Suharman, 1995).
Menurut Day and Underwood (2002), ada tiga kemungkinan profil
spektrum absorpsi yang dihasilkan dari dua komponen campuran yaitu:
1.
Kemungkinan pertamaSpektra tanpa tumpang tindih atau sekurangnya dimungkinkan
untuk menemukan suatu panjang gelombang yang mana x menyerap dan y
tidak, serta panjang gelombang serupa untuk mengukur y. Konstituen x dan
y diukur masing – masing pada panjang gelombang λ1 dan λ2 seperti dilihat
pada Gambar 5 :
Gambar 5. Spektrum absorpsi pada panjang gelombang masing – masing komponen tidak saling tumpang tindih (Day dan Underwood, 2002)
2. Kemungkinan kedua
Spektra tumpang tindih satu arah, y tidak menganggu pengukuran x
pada λ1, tetapi x menyerap cukup banyak bersama–sama y pada λ2.
Konsentrasi x ditetapkan dan absorbansi larutan pada λ1. Absorbansi yang
pada λ2. Absorbansi ini dikurangkan dari absorbansi terukur larutan pada λ2
sehingga akan diperoleh absorbansi yang disebabkan oleh y, konsentrasi y
dapat diukur dengan cara yang lazim, seperti dilihat pada Gambar 6 :
Gambar 6. Spektrum absorpsi tumpang tindih satu arah (Day dan Underwood, 2002)
3. Kemungkinan ketiga
spektra tumpang tindih dua arah. Bila tidak ditemukan panjang
gelombang yang mana x atau y menyerap secara eksklusif, maka perlu
memecahkan dua persamaan serempak dengan dua derivative. Analisis
kuantitatif jenis ini dapat dilakukan dengan aplikasi metode panjang
gelombang berganda atau derivative, seperti dilihat pada Gambar 7 :
D. Kemometrika
Menurut International Chemometrics Society (Kumpulan ahli
kemometrika internasional), kemometrika adalah ilmu pengetahuan yang
menghubungkan pengukuran yang dibuat pada suatu proses atau sistem
kimiawi melalui penggunaan ilmu matematika dan statistika. Dari sini dapat
diketahui bahwa ilmu matematika dan statistika mendukung pemahaman
kemometrika. Kemometrika dikenalkan ke dalam spektroskopi untuk
meningkatkan kualitas data yang diperoleh. Meskipun, pada awal
penggunaannya hanya untuk mengolah data spektra, akan tetapi saat ini
kemometrika memungkinkan untuk memperlakukan sejumlah besar
informasi yang berasal dari konsentrasi komponen sampel dalam jangka
waktu yang cepat (Rohman, 2014).
Metode–metode analisis farmasi seperti spektroskopi mampu
memberikan sejumlah data beberapa komponen secara simultan dalam satu
kali pembacaan sampel. Situasi semacam ini, yang mana beberapa variabel
(parameter) diukur untuk tiap sampel akan menghasilkan data multivariat.
Diantara jenis kalibrasi multivariat, teknik kalibrasi classical least squares
(CLS), stepwise multiple linear regression (SMLR), principle component
regression (PCR), dan partial least square (PLS) merupakan jenis yang
paling sering digunakan (Rohman, 2012).
Kalibrasi classical least squares (CLS) didasarkan pada hukum
Beer yang mana absorbansi pada setiap panjang gelombang proporsional
(PCR) dan partial least squares (PLS) termasuk jenis Inverse Least square
(ILS) (Rohman, 2012).
PLS mampu memprediksi secara lebih baik daripada PCR ketika
ada baseline linier yang acak dan atau spektra komponen utama yang
tumpang tindih (Sohrabi et al., 2009). Dalam PLS, variabel yang
menunjukkan korelasi tinggi dengan variabel respon lebih dipilih karena
lebih efektif untuk mempredisi. Kombinasi linier variabel prediktor dipilih
dari yang memiliki korelasi tinggi dengan variabel respon dan dapat
menjelaskan variasi dalam variabel prediktor (Miller dan Miller, 2010).
Kalibrasi PCR Merupakan analisis faktor yang mana hanya spektra
yang tidak memberi ko-linieritas yang digunakan dalam kalibrasi. PCR
mengaplikasikan teknik multivariat analisis komponen utama atau principal
component analysist (Che Man et al., 2010). Sementara itu, kalibrasi PLS
merupakan jenis regresi yang dihitung dengan algoritma kuadrat terkecil
yang menghubungkan antara dua matriks, data spektra pada matriks X dan
nilai referens pada matriks Y. PLS sering digunakan dalam spektroskopi
untuk mengekstrak informasi dari spektra yang mengandung puncak-puncak
yang tumpang suh, adanya pengganggu, serta adanya derau (noise) dari
instrumen yang digunakan untuk mengumpulkan data (Syahariza et al.,
2005).
Kalibrasi PCR dan PLS dilakukan dalam 3 tahap yaitu : (1)
kalibrasi; (2) validasi; dan (3) analisis sampel yang tidak diketahui (Osborne
yang diikuti validasi (dengan validasi sampel secara terpisah atau dengan
validasi silang tengan teknik leave one out) dan tahap prediksi (sampel
baru). Jika hasil tahap kalibrasi dan validasi yang digunakan memenuhi
kriteria (korelasi yang tinggi, kesalahan yang kecil) maka model yang
dikembangkan selanjutnya digunakan untuk mengestimasi konsentrasi
campuran dari sampel yang belum diketahui konsentrasinya
Kalibrasi PLS merupakan kalibrasi terbalik (inverse calibration)
dimana sumbu x (absorbansi) dan sumbu y (konsentrasi) dengan
menggunakan validitas yaitu root mean square error of calibration
(RMSEC), root mean square error of prediction (RMSEP) dan koefisien
determinasi (R2). Selanjutnya model PLS diujisilangkan menggunakan teknik “leave one out”. Dalam teknik ini, salah satu sampel kalibrasi
dikeluarkan dari model PLS dan sisa sampel yang ada digunakan untuk
pemodelan dengan PLS. Sampel yang dihilangkan selanjutnya dihitung
dengan model PLS baru yang dikembangkan. Prosedur tersebut dilakukan
berulang kali, menghilangkan satu demi satu sampel kalibrasi hingga
didapatkan harga R2 mendekati 1 (Rohman and Cheman, 2011). Menurut El Gindy (2006), pemilihan panjang gelombang pada PLS diperlukan supaya
kinerja model dapat optimum meskipun metode ini secara komputerisasi
dapat menghitung seluruh spektrum.
E. Validasi Metode Analisis Kalibrasi Multivariat
Validasi metode analisis merupakan suatu prosedur yang
asas memberikan hasil seperti yang diharapkan dengan kecermatan dan
ketelitian yang memadai. Persoalan analisis era modern ini yaitu sangat
kecilnya kadar senyawa yang dianalisis dan kompleksnya matrik sampel
yang dianalisis (Mulja dan Suharman,1995).
Validasi metode analisis merupakan suatu persyaratan dasar untuk
menjamin kualitas dan kehandalan hasil dari semua aplikasi metode analisis
(Ermer dan Miler, 2005).
1. Presisi
Presisi suatu metode analisis adalah derajat kesesuaian antara hasil
pengukuran ketika metode tersebut diaplikasikan secara berulang-ulang
pada sampel yang homogen. Presisi biasanya ditunjukkan dengan standar
deviasi atau koefisien variasi dari sebuah seri pengukuran (Anonim,2005).
Presisi dalam USP dibagi menjadi tiga macam yaitu :
a. Repeatability adalah derajat keterulangan metode analisis jika
analisis dilakukan di laboratorium yang sama pada hari yang sama
dengan alat yang sama pula.
b. Intermediate precision adalah derajat keterulangan metode analisis
jika analisis dilakukan pada laboratorium yang sama dengan hari
yang berbeda, analisis yang berbeda dan atau alat yang berbeda.
c. Reproducibility adalah derajat keterulangan metode analisis jika
analisis dilakukan pada laboratorium yang berbeda (Anonim,
Presisi suatu prosedur analisis menunjukkan kedekatan nilai
(derajat penyebaran) antara serangkaian pengukuran yang dilakukan dari
proses multiple sampling dari sekumpulan sampel homogen dengan kondisi
yang telah ditentukan.
Presisi seringkali diekspresikan dengan simpangan baku (SD) atau
simpangan baku relatif (RSD) dari serangkaian data. Perhitungan RSD
menggunakan rumus :
X
x 100% (1)
Keterangan : SD = simbangan baku serangkaian data
X = Rata – rata data
(Gandjar dan Rohman, 2007)
Ketidakpastian kalibrasi dan prediksi kadar yang tidak diketahui
dihitung dengan standard error of calibration (SEC) dan standard error of
prediction (SEP). Parameter lain untuk mengukur presisi kalibrasi
multivariat adalah nilai predictive residual error sum of squares (PRESS).
PRESS dihitung seperti menghitung SEP dengan menggunakan sampel
validasi (Danzer et al., 2004).
Kriteria presisi diberikan jika metode memberikan simpangan baku
relatif atau koefisien variasi 2% atau kurang untuk kadar analit 100%.
Kriteria tersebut sangat fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang
Tabel I. Kriteria penerimaan nilai RSD
Analit % Fraksi analit Konsentrasi
analit Nilai RSD (%)
(Horwitz cit. Gonzales, Herrador, and Asuero, 2010).
2. Akurasi
Akurasi suatu metode analisis merupakan kedekatan hasil
pengukuran yang diperoleh dengan metode tersebut dengan nilai yang
sebenarnya. Akurasi suatu metode analisis sebaiknya disajikan dalam
rentang (Anonim, 2005).
%Recovery =
x 100% (2)
Akurasi dinyatakan sebagai persen kembali analit yang
ditambahkan dan nilai kecermatan dapat dinyatakan dengan persen
perolehan kembali (% recovery). Batasan nilai akurasi dapat dilihat pada
Tabel II. Nilai % recovery (Wood, 1998)
Analit pada matrix sampel (%) Recovery yang diterima (%)
100 98 – 102
>10 98 – 102
>1 97 – 103
>0,1 95 – 105
0,01 90 – 107
0,001 90 – 107
0,0001 (1 ppm) 80 – 110
100 ppb 80 – 110
10 ppb 60 – 115
1 ppb 40 – 120
Ada tidaknya suatu kesalahan sistematik dapat diketahui dari fungsi
recovery. Dalam kalibrasi multivariat kadar yang diprediksi model (Ĉ)
dikorelasikan dengan kadar aktual sampel validasi (c) dengan persamaan
regresi sebagai berikut :
Ĉ =
Koefisien regresi ideal jika nilai = 0 dan = 1 (Danzer, et al, 2004).
3. Selektivitas
Secara umum, selektivitas sistem multikomponen dapat ditetapkan
secara kualitatif dan kuantitatif. Dalam kalibrasi multivariat, selektivitas
biasanya dihitung dengan condition number. Namun condition number tidak
memperhitungkan kadar masing masing komponen dan hanya memberikan
F. Landasan Teori
Dalam sediaan obat sering digunakan campuran zat aktif untuk
memperoleh efek teraupetik yang lebih baik. Salah satunya adalah campuran
Parasetamol, Kafein, Propifenazon (Tan & Rahardja, 2007).
Penelitian ini merupakan analisis senyawa multikomponen
sehingga untuk mengatasi overlapping spektra UV yang dihasilkan maka
digunakan kombinasi kalibrasi multivariat untuk pengolahan data dan
validasi metode dilakukan dengan paramater akurasi dan presisi (Danzer et
al, 2004).
Sifat kelarutan dari ketiga zat aktif tersebut mirip. Parasetamol larut
larut dalam air 1 g/ 70 mL. Kafein larut dalam air 1 g/46 mL. Propifenazon
larut dalam air 1 g/400 mL. Parasetamol, Kafein, Propifenazon masing–
masing dapat ditetapkan kadarnya menggunakan spektrofotometri UV- VIS.
Parasetamol memiliki serapan maksimum dalam larutan asam pada 245 nm
dan serapan maksimum dalam larutan basa pada 257 nm, kafein memiliki
serapan maksimum dalam larutan asam pada 273 nm, propifenazon
memiliki serapan maksimum dalam larutan asam pada 240 nm (Moffat, et
al., 2004). Dengan adanya serapan maksimum pada panjang gelombang
yang berdekatan tersebut menyebabkan spektrum serapan ketiga senyawa
tumpang tindih. Metode spektrofotometri UV yang dikombinasikan dengan
kemometrika dapat digunakan sebagai alat analisis untuk ketiga senyawa
Keberhasilan analisis menggunakan spektrofotometri UV yang
dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat dilihat dari koefisien
determinasi (R2) >0,99 , RMSEP (root mean square error of prediction) dan RMSECV (root mean square error of cross validation) yang kecil
(El-Gindy et al., 2006).
G. Hipotesis
1. Spektrofotometri UV yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat
PLS memiliki kemampuan prediksi yang optimal untk senyawa
parasetamol, kafein, dan propifenazon.
2. Spektrofotometri UV-VIS yang dikombinasikan dengan kalibrasi
multivariat PLS merupakan metode yang valid untuk senyawa
parasetamol, kafein, dan propifenazon.
3. Spektrofotometri UV-VIS yang dikombinasikan dengan kalibrasi
multivariat dapat diaplikasikan untuk penetapan kadar senyawa
campuran parasetamol, kafein, propifenazon dalam sediaan tablet oral
22
BAB III
METODELOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Jenis penelitian ini termasuk penelitian noneksperimental dengan
rancangan penelitian deskriptif.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel
a. Variabel Bebas. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah
Konsentrasi larutan campuran model kalibrasi.
b. Variabel Tergantung. Variabel tergantung dari penelitian ini adalah
Konsentrasi sampel sediaan farmasi.
c. Variabel Pengacau. Variabel pengacau dari penelitian ini adalah
pengukuran data absorbansi yang tidak informatif. Dikendalikan
dengan pemusatan pengukuran pada panjang tertentu.
2. Definisi Operasional
a. R-sq atau R2 merupakan koefisien determinasi yang menggambarkan kemampuan nilai konsentrasi dalam menjelaskan hubungan terhadap
nilai terhitung..
b. RMSE (root mean square of error) merupakan stadar deviasi dari
sebuah pemodelan yang menjelaskan seberapa mungkinsuatu model
c. PRESS (predicted error sum of square) merupakan nilai kesalahan
yang dilakukan saat prediksi sampel oleh model kalibrasi dalam
proses cross validation leave-one-out.
d. Set kalibrasi merupakan 20 larutan kalibrasi yang didapat dari
randomisasi menggunakan ms.excel 2010 untuk pembuatan model
kalibrasi multivariat PLS untuk senyawa
e. Set validasi merupakan 10 larutan kalibrasi yang didapat dari
randomisasi menggunakan ms.excel 2010 untuk pembuatan model
kalibrasi multivariat PLS untuk senyawa
C. Bahan Penelitian
Bahan–bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku
parasetamol (PT. Combiphar), baku kafein (PT. Konimex), dan baku propifenazon
(PT. Konimex), akuabides, kertas saring dan sediaan tablet yang mempunyai
komposisi zat aktif parasetamol 250 mg, propifenazon 150 mg, dan kafein 50 mg.
D. Alat Penelitian
Spektrofotometer UV-VIS (Shimadzu) tipe UV 1800 dengan kuvet
kwarsa 1 cm merk Hellma, mikropipet 200 µL dan 1000 µL merk Socorex,
degasser Retsch UR-275, neraca merk Ohaus PAJ1003 dengan kepekaan 0,1 mg
(maksimal 120 g, minimal 0,001 g), serta alat-alat gelas yang lazim digunakan
dalam laboratorium analisis kimia yang terdapat di laboratorium instrumen
E. Tata Cara Penelitian
Penelitian ini menetapkan kadar parasetamol, propifenazon, kafein dalam
sediaan tablet kombinasi secara spektrofotometri UV yang dihubungkan dengan
kalibrasi multivariat tanpa tahap pemisahan.
Analisis secara spektrofotometri UV-kalibrasi multivariat dilakukan
dengan cara :
1. Scanning spektra standar
Scanning standar dilakukan dengan membuat standar parasetamol dan
kafein dengan konsentrasi 5 µg/mL dan dilakukan scanning spketra pada panjang
gelombang 220-400 nm.
2. Pemilihan interval pengukuran dan panjang gelombang pengukuran untuk
set kalibrasi
a. Dilakukan pengamatan spektra dari hasil pengukuran campuran
standar parasetamol, propifenazon, dan kafein. Dipilih rentang
panjang gelombang saat campuran senyawa mulai memberikan
serapan sampai campuran memberikan serapan mendekati nilai 0
b. Rentang panjang gelombang yang dipilih adalah 220-310 nm. Interval
pengukuran yang dipilih adalah 3 nm agar diperoleh data pengamatan
dalam jumlah yang cukup untuk dapat menggambarkan hubungan
variabel.
3. Penyiapan larutan set kalibrasi dan set validasi eksternal
a. Standar parasetamol, propifenazon, kafein masing–masing ditimbang
dilarutkan dengan pelarut akuabides, diultrasonifikasi selama 10
menit, dan ditambahkan dengan pelarut sampai batas tanda.
b. Pembuatan 20 larutan set kalibrasi dan 10 set validasi , dilakukan
dengan cara: setiap larutan antara dipipet sejumlah tertentu,
dimasukkan dalam labu takar 10 mL dan diencerkan dengan pelarut
akuabides hingga diperoleh kadar sesuai Tabel III untuk set kalibrasi
dan Tabel IV untuk set validasi eksternal.
Tabel IV. Komposisi campuran sintetik paracetamol Parasetamol,
Sejumlah 20 sediaan tablet, dihitung bobot rata-rata tiap tablet. Sediaan
tablet memenuhi syarat apabila ditimbang satu per satu, tidak ada lebih dari 2
tablet yang menyimpang dari bobot rata-rata lebih besar dari 5% dan tidak ada
satu tablet pun yang bobotnya menyimpang dari bobot rata-rata lebih dari 10%
(Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1995).
5. Analisis Sampel
a. Ditimbang 20 sampel tablet secara seksama, dicatat bobot setiap tablet,
dilakukan pengujian keseragaman bobot tablet, digerus sampai homogen.
b. Ditimbang seksama dengan jumlah tertentu yang setara dengan 25 mg
parasetamol, 15 mg propifenazon, dan 5 mg kafein dilarutkan dalam labu
takar 100 mL, dilarutkan dalam sebagian pelarut akuabides,
diultrasonikasi selama 15 menit, dan diencerkan dengan pelarut sampai
c. Dari larutan yang telah disaring, dipipet sebanyak 5,0 mL dan
dimasukkan dalam labu takar 50 mL, kemudian ditambahkan pelarut
sampai batas tanda.
d. Dari larutan (c) tersebut dipipet lagi sebanyak 2,0 mL dan dimasukkan
dalam labu takar 10 mL, kemudian ditambahkan pelarut sampai batas
tanda.
e. Dilakukan scanning dari larutan tersebut pada panjang gelombang
220-310 nm dengan interval absorbansi 3 nm.
f. Dilakukan penetapan kadar parasetamol, propifenazon, dan kafein
sebanyak 6 kali. Kadar dihitung dengan metode kalibrasi multivariat
partial least square (PLS).
6. Analisis statistik kalibrasi multivariat (PLS)
a. Model Kalibrasi Multivariat PLS
1) Data konsentrasi dan absorbansi kelompok larutan kalibrasi yang
disajikan dalam kertas kerja perangkat lunak Microsoft Excel
dipindahkan ke dalam kertas kerja Minitab® 16 (trial) dengan fungsi
copy-paste.
2) Pengolahan data statistik partial least square (PLS) dipilih dengan
menggunakan pilihan Stat pada panel kerja Minitab 16, kemudian
dipilih regression partial least square.
3) Setelah muncul jendela baru dari program Minitab 16, dilakukan
pembuatan model PLS parasetamol dengan cara; kolom response
dipilih variabel absorbansi pada panjang gelombang 220-310 nm.
Untuk pembuatan model PLS kafein dibuat dengan cara; kolom
response diisi dengan pilihan variabel konsentrasi CAF dan kolom
model dipilih variabel absorbansi pada panjang gelombang 220-310
nm.
4) Diperoleh nilai terhitung dan nilai sebenaryna dari model kalibrasi
multivariat PLS parasetamol dan kafein, nilai tersebut kemudian
dipindahkan ke dalam kertas kerja perangkat lunak Microsoft Excel
dengan fungsi copy-paste.
5) R2 didapat dari hubungan korelasi atau kedekatan nilai antara nilai sebenarnya (sumbu X) dengan nilai terhitung (sumbu Y).
6) RMSEC dapat dihitung menggunakan rumus √∑
dimana x
adalah nilai sebenarnya (actual), y adalah nilai terhitung
(calculated), dan n adalah banyak nya data konsentrasi yang
dirandomisasi yaitu 20.
b. Cross Validation Leave-one-out
1) Data dipindahkan dari kertas kerja perangkat lunak Microsoft Excel
dengan menggunakan fungsi copy-paste ke dalam kertas kerja
Minitab 16.
2) Dipilih model kalibrasi PLS dengan menekan pilihan stat pada
panel kerja, kemudian dipilih regression partial least square.
3) Proses validasi model kalibrasi dilakukan dengan, dimasukan
absorbansi ke dalam kolom model. Kemudian tekan tombol option
yang selanjutnya ditentukan tambahan proses leave-one-one.
Perlakuan sama diberlakukan untuk proses validasi CAF.
4) Diperoleh nilai sebenarnya dan nilai terhitung, serta nilai PRESS
dari tahap validasi internal dan selanjutnya dipindahkan ke dalam
kertas kerja perangkan lunak Microsoft Excel dengan fungsi
copy-paste.
5) Akurasi dan presisi model kalibrasi ditinjau dari nilai R2 dan nilai RMSECV dengan membuat hubungan linier antara nilai sebenarnya
dan nilai terhitung. Diperoleh persamaan linear y=bx+a hubungan
antara nilai sebenarnya dan terhitung yang nantinya akan digunakan
untuk memperoleh nilai RMSECV.
7. Anasilis data Sampel
a. Akurasi dan presisi model kalibrasi multivariat parasetamol dan kafein
dinyatakan secara statistik dengan nilai R2, RMSEC, RMSECV, RMSEP dan PRESS.
b. Konsentrasi sampel dihitung dengan koefisien dari masing-masing model
untuk senyawa parasetamol dan kafein sesuai dengan rumus :
Keterangan :
X = Konsentrasi terhitung sampel (µg/mL)
ts = koefisien dari model kalibrasi
= koreksi kesalahan yang mungkin erjadi pada model kalibras
PLS
c. Kadar sampel dihitung dengan menggunakan rumus :
̅ )
Keterangan :
Ct = konsentrasi sampel terprediksi oleh model (µg/mL)
Fp = Faktor Pengenceran
̅ = Berat rata-rata penimbangan keseluruhan sampel tablet (mg (tab)) X = Berat penimbangan sampel (mg)
d. Akurasi dari proses penetapan kadar ditetapkan dengan persen perolehan
kembali dengan rentang yang dapat diterima menurut Wood (1998)
adalah sebesar 90-107%
e. Presisi dari proses penetapan kadar ditetapkan dengan nilai RSD dengan
nilai maksimal yang masih dapat diterima menurut Gonzales dan
Herrador (2007) adalah sebesar 11,3%.
Analisis kalibrasi multivariat dilakukan dengan menggunakan
perangkat lunak Minitab® 16 (trial). Kertas kerja perangkat lunak Excel 2010 digunakan untuk menentukan konsentrasi secara random masing–masing zat
aktif dan untuk menghubungkan antara konsentrasi sebenarnya dan
32
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Analisis parasetamol, propifenazon, kafein secara simultan menggunakan metode spektrofotometri UV
Spektra UV parasetamol, propifenazon, kafein dengan konsentrasi
masing-masing 5 ppm dapat dilihat pada Gambar 8 dari gambar ini nampak
bahwa ketiga senyawa mempunyai spektra yang overlapping. Dengan
bekembangnya teknologi, saat ini tersedia suatu perangkat kalibrasi
multivariat yang dapat mengatasi masalah spektra yang overlapping seperti
ini.
Gambar 8. Spektra UV parasetamol (PCT), propifenazon (PROPI), kafein (KAF), dan spektra UV campuran PCT, PROPI, dan KAF yang diukur pada panjang
gelombang 220-400 nm
PCT
PROP
Untuk suksesnya analisis ketiga senyawa ini (PCT, PROPI, dan
KAF) dengan bantuan kalibrasi multivariat kemometrika, maka spektra UV
sampel yang akan di analisis harus mempunyai spektra UV yang mirip
dengan spektra UV baku, karena jika spektra baku campuran ketiga
senyawa obat dengan sampel sediaan farmasi yang akan dianalisis tidak
mirip, maka perlu diperhatikan adanya bahan tambahan dalam sampel yang
membuat spektra tidak mirip dengan baku. Dari Gambar 9 nampak bahwa
sediaan farmasi (tablet) dan campuran baku ketiga senyawa (PCT, PROPI,
dan KAF) mempunyai pola spektra yang mirip.
Gambar 9. Spektra UV sampel sediaan farmasi (tablet) dan spektra UV campuran baku parasetamol (PCT), propifenazon (PROPI), kafein (KAF)
yang diukur pada panjang gelombang 200-400 nm
Spektra campuran baku (PCT, PROPI, dan KAF)
B. Optimasi kalibrasi multivariat menggunakan partial least
square (PLS)
Partial least square (PLS) digunakan untuk melakukan pengolahan
data karena mampu menghasilkan model kalibrasi dengan kemampuan
prediksi yang baik untuk jumlah data yang banyak. Data absorbansi dari 20
set kalibrasi disiapkan sebagai model kalibrasi diukur pada panjang
gelombang 220-313 nm dengan interval panjang gelombang 3 nm. Pada
partial least square (PLS) dilakukan pemilihan panjang gelombang, hal ini
bertujuan untuk memperoleh kinerja model yang optimum meskipun pada
metode partial least square (PLS) secara komputerisasi dapat mencakup
seluruh spektrum (El Gindy, 2006).
Kebaikan suatu model kalibrasi dapat dilihat dari nilai koefisien
determinasi (R2) dan nilai RMSEC (root mean square error of calibration). Hasil dari analisis varian untuk senyawa parasetamol, propifenazon, dan
kafein adalah nilai p = 0,000 menunjukkan bahwa terdapat hubungan yang
signifikan antara kedua variabel dalam hal ini konsetrasi dan absorbansi.
Selisih antara nilai sebenarnya dan nilai terhitung yang dihasilkan sangat
kecil yang menunjukkan pengukuran yang dilakukan oleh model kalibrasi
baik, kemudian diproses menggunakan Microsoft Excel untuk menentukan
nilai R2 dan nilai RMSEC.
Sebagaimana dalam analisis instrumental pada umumnya, maka
tahapan pertama yang dilakukan adalah menyiapkan model kalibrasi dengan
dengan komposisi konsentrasi obatnya sebagaimana dalam Tabel V yang
merupakan hasil pengolahan data yang diperoleh dari pembuatan model
kalibrasi parasetamol, propifenazon, dan kafein. Konsentrasi sebenarnya
adalah konsentrasi yang dibuat berdasarkan bilangan acak pada tahap
pembuatan set kalibrasi, sedangkan konsntrasi terhitung merupakan
konsentrasi yang diprediksikan oleh model kalibrasi PLS.
Tabel V. Nilai konsentrasi sebenarnya (actual response) vs konsentrasi terhitung (calculated response) menggunakan spektrofotometri UV-PLS tanpa
cross validation pada panjang gelombang 220-313 nm
N o
Konsentrasi (µg/mL)
PCT PROPI KAF
Sebenarnya Terhitung Sebenarnya Terhitung Sebenarnya Terhitung
1 5,8 5,77066 3,5 3,51837 1,5 1,47959
Sampel kalibrasi ini selanjutnya dimodelkan dengan menggunakan
pada panjang gelombang 313 nm. Pemilihan panjang gelombang
220-313 nm bertujuan untuk mengurangi sebagian data yang mungkin bersifat
tidak informatif dan untuk mendapatkan model kalibrasi dengan
kemampuan prediksi yang optimum. Adapun kurva hubungan antara nilai
kadar terprediksi dan nilai aktual parasetamol, propifenazon, kafein dalam
set kalibrasi dapat dilihat pada Gambar 10, 11, 12. berikut :
Gambar 10. Kurva hubungan antara kadar parasetamol sebenarnya (actual
value) vs kadar terhitung (calculated value) parasetamol dengan metode
spektrofotometri UV-PLS pada panjang gelombang 220 -313 nm
5,0
Gambar 11. Kurva hubungan antara kadar propifenazon sebenarnya (actual
value) vs kadar terhitung (calculated value) propifenazon dengan metode
spektrofotometri UV-PLS pada panjang gelombang 220 -313 nm
2,00
Gambar 12. Kurva hubungan antara kadar kafein sebenarnya (actual value) vs kadar terhitung (calculated value) kafein dengan metode spektrofotometri
UV-PLS pada panjang gelombang 220 -313 nm
Tabel VI. Hasil persamaan , R2, dan RMSEC yang didapat dari hubungan antara nilai kadar sebenarnya (actual value) vs nilai terhitung (calculated
value) dengan metode spektrofotometri UV-PLS tanpa cross validation pada
panjang gelombang 220-313 nm
PCT PROPI KAF
Persamaan y = 0,9994x + 0,0034 y = 0,9878x + 0,0426 y = 0,9919x + 0,0101
R2 0,9994 0,9878 0,9919
RMSEC 0,027445698 0,082897315 0,043408954
Dari Tabel VI yang merupakan hasil konsentrasi sebenarnya dan
konsentrasi terhitung kemudian diproses menggunakan perangkat lunak
ms.excel 2010 untuk menentukan nilai R2 dan nilai RMSEC.
RMSEC menunjukkan selisih kadar prediksi dengan kadar aktual
sehingga jika nilai RMSEC nya semakin kecil maka model – model tersebut
dapat dikatakan semakin baik karena faktor kesalahannya semakin kecil
Hasil persamaan , R2, dan RMSEC dapat dilihat pada Tabel VI. Nilai RMSEC (root mean square error of calibration) yang diperoleh
adalah 0,027 untuk PCT, 0,082 untuk PROPI, dan 0,043 untuk KAF. Nilai
RMSEC yang diperoleh sangat baik karena mendekati 0.
C. Validasi model kalibrasi multvariat PLS
Kemampuan prediksi dari model kalibrasi multivariat divalidasi
degan dua proses yaitu validasi internal dan validasi eksternal. Validasi
internal (cross validation) bertujuan untuk menangani masalah overfitting
yang seringkali terjadi dalam proses pembuatan model, sedangkan validasi
eksternal bertujuan untuk mengetahui kemampuan prediksi dari keseluruhan
model kalibrasi multivariat PLS dengan menetapkan konsentrasi larutan
yang telah diketahui.
1. Validasi Silang (cross validation)
Model kalibrasi ketiga senyawa obat (PCT, PROPI, dan KAF) yang
dihasilkan mampu memberikan prediksi yang baik dengan nilai koefisien
determinasi (R2) parasetamol 0,9994, propifenazon 0,9878, kafein 0,9919. Selanjutnya model kalibrasi ini dilakukan validasi silang (cross validation)
dengan menggunakan teknik leave-one out. Dalam teknik ini, salah satu
sampel kalibrasi (misal sampel nomor 1) dikeluarkan, lalu sampel ini
dimodelkan dengan sampel yang tersisa. Selanjutnya dihitung nilai
terprediksi sampel 1 dari model kalibrasi sampel yang tersisa. Hal ini
dimodelkan dengan sampel kalibrasi yang tersisa. Hasilnya dapat dilihat
pada Tabel VII. hubungan antara nilai sebenarnya suatu analit dengan nilai
terprediksi yang sudah divalidasi (cross validation) menggunakan teknik
leave-one out dengan metode PLS pada panjang gelombang 220-313 nm.
Tabel VII. Nilai sebenarnya dan nilai terhitung hasil kalibrasi pls dari sampel yang dilakukan validasi silang (cross validation) yang mengandung
parasetamol (PCT), propifenazon (PROPI), dan kafein (KAF)
Nomor Campuran
Konsentrasi (µg/mL)
PCT PROPI KAF
Sebenarnya Terhitung Sebenarnya Terhitung Sebenarnya Terhitung
1 5,75522 5,69975 3,65866 3,68038 1,38956 1,37482
Dari hasil diatas dapat dilihat bahwa nilai koefisien determinasi
rendah (mendekati nol) maka kemampuan model untuk memprediksi
semakin baik.
Data dan parameter hasil validasi silang leave one-out parasetamol,
propifenazon, dan kafein dapat dilihat pada Gambar 13, 14, 15 :
PLS Regression: PCT versus 253; 256; 259; 262; 271; 274; 277; 280; ...
Cross-validation Leave-one-out Components to evaluate Set
Number of components evaluated 10 Number of components selected 9
Analysis of Variance for PCT
Source DF SS MS F P
Regression 9 25,2606 2,80673 1657,48 0,000 Residual Error 10 0,0169 0,00169
Total 19 25,2775
Model Selection and Validation for PCT
Components X Variance Error R-Sq PRESS R-Sq (pred) 1 0,92489 20,1053 0,204618 23,5800 0,067156 2 0,98766 7,2132 0,714641 9,8431 0,610599 10 0,0151 0,999404 0,1919 0,992410
