1
APLIKASI SPEKTROFOTOMETRI UV DAN KALIBRASI
MULTIVARIAT UNTUK ANALISIS PARASETAMOL, GUAIFENESIN DAN KLORFENIRAMIN MALEAT DALAM SIRUP
Erfan Sriman Famarani Gulo, Abdul Rohman, Florentinus Dika Octa Riswanto
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta
INTISARI
Kebutuhan akan obat dengan zat aktif multikomponen semakin meningkat dalam kalangan masyarakat, sehingga membutuhkan peningkatan pengawasan mutu produk obat dalam menjamin keamanan dan khasiat yang dihasilkan. Berbagai metode telah dikembangkan untuk penjaminan mutu produk obat, seperti metode spektrofotometri. Akan tetapi, metode spektrofotometri tidak dapat digunakan dalam analisis senyawa multikomponen, mengingat keterbatasan metode tersebut dalam mengatasi overlapping spektra senyawa. Oleh karena itu, diperlukan suatu modifikasi metode, yakni dengan mengkombinasikan kemometrika dan spektrofotometri, sehingga masalah overlapping tersebut dapat teratasi.
Metode spektrofotometri yang dikombinasikan dengan kemometrika kalibrasi multivariat partial least square (PLS) digunakan dalam analisis sediaan farmasi sampel sirup dengan komposisi parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat. Evaluasi metode didasarkan pada nilai koefisien determinasi (R2), root mean square error of calibration (RMSEC), dan root mean square error of calibration validation (RMSECV).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa analisis sediaan farmasi sampel sirup dengan komposisi parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat menggunakan metode kombinasi spektrofotometri dan kemometrika belum berhasil dilakukan. Untuk model kalibrasi, diperoleh nilai R2 PCT 0,994, GG 0,999 dan CTM 0,999. Nilai RMSEC PCT 0,289, GG 0,099 dan CTM 0,078. Untuk model validasi, diperoleh nilai R2 PCT 0,999, GG 0,999 dan CTM 0,998. Nilai RMSECV PCT 0,116, GG 0,084 dan CTM 0,219.
ABSTRACT
The need of a drug with active ingredient multicomponent increasing in the community, thus requiring an increase in the quality control of medicinal products in ensuring the safety and efficacy of the resulting. Various methods have been developed for quality assurance of drug products, such as spectrophotometric method. However, the spectrophotometric method can not be used in the analysis of multicomponent compound, given the limitations of the method to resolve overlapping spectra of compounds. Therefore, we need a modification of the method, by combining chemometrics and spectrophotometry, so that the overlapping issue can be resolved.
Spectrophotometric method combined with chemometrics multivariate calibration partial least square (PLS) was used in the analysis of pharmaceutical syrup samples with the composition of paracetamol, guaifenesin and chlorpheniramine maleate. Evaluation methods are based on the coefficient of determination (R2), root mean square error of calibration (RMSEC), and root mean square error of calibration validation (RMSECV).
The results showed that the analysis of pharmaceutical syrup samples with the composition of paracetamol, guaifenesin and chlorpheniramine maleate using a combination of spectrophotometric and chemometrics method was unsuccessful. For the calibration models, the value of R2 PCT 0,994, GG 0,999 and CTM 0,999. Value RMSEC PCT 0,289, GG 0,099 and CTM 0,078. For the model of validation, the value of R2 PCT 0,999, GG 0,999 and CTM 0,998. Value RMSECV PCT 0,116, GG 0,084 and CTM 0,219.
APLIKASI SPEKTROFOTOMETRI UV DAN KALIBRASI MULTIVARIAT UNTUK ANALISIS PARASETAMOL, GUAIFENESIN DAN
KLORFENIRAMIN MALEAT DALAM SIRUP SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Erfan Sriman Famarani Gulo
NIM : 118114147
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
i
APLIKASI SPEKTROFOTOMETRI UV DAN KALIBRASI MULTIVARIAT UNTUK ANALISIS PARASETAMOL, GUAIFENESIN DAN
KLORFENIRAMIN MALEAT DALAM SIRUP SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Erfan Sriman Famarani Gulo
NIM : 118114147
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
ii
vi
HALAMAN PERSEMBAHAN
“If you can run away and return, if you can fall asleep and wake up, if you're
broken, you should be able to put yourself back together” –
Noragami.
”
“No matter what anyone says...what you're about to
do...is right!” – Yato”
“Y ay a a y a
. B ’
“
- Lailah
Gifty Akita, Pearls of Wisdom : Great Mind.
Karya kecil yang kupersembahkan kepada :
Tuhan Yang Maha Pengasih dan Penyayang
Ayah dan Bunda yang tercinta, Fangato Gulö dan Afasari Dachi
Saudara-Saudariku yang kusayangi, Kakak Erni, Fandi dan Sri
vii PRAKATA
Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa, atas berkat dan rahmat-Nya
sehingga skripsi ini yang berjudul “Aplikasi Spektrofotometri UV dan Kalibrasi Multivariat Untuk Senyawa Parasetamol, Guaifenesin dan Klorfeniramin Maleat” dapat penulis selesaikan dengan baik.
Skripsi ini diajukan untuk memenuhi sebagian persyaratan memperoleh
gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) pada Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta.
Dalam proses penelitian dan penyusunan naskah skripsi ini, banyak
pihak-pihak yang telah meluangkan waktu dan memberikan kontribusi yang besar, baik
dalam materi, dukungan, kritik dan saran kepada penulis. Untuk itu, dalam
kesempatan ini, penulis ingin mengucapkan terimakasih kepada :
1. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt., selaku dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma.
2. Bapak Prof. Dr. Abdul Rohman, M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing yang
dengan penuh kesabaran memberikan bimbingan dan pengarahan, ilmu,
dukungan serta waktu dan tenaga dalam memecahkan setiap masalah selama
proses penelitian dan penyusunan naskah skripsi ini.
3. Bapak Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc., selaku dosen pembimbing
pendamping yang dengan penuh kesabaran memberikan dukungan, semangat,
viii
4. Dosen penguji yang akan memberikan pengarahan, kritik dan saran kepada
penulis dalam menyelasikan naskah skripsi ini.
5. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku Dosen Pembimbing Akademik yang
telah membantu penulis selama proses perkuliahan.
6. Ibu Agustina Setiawati, M.Sc., Apt., selaku Kepala Laboratorium Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma, yang telah memberikan izin untuk
menggunakan fasilitas laboratorium untuk melaksanakan penelitian.
7. Balai besar POM di Yogyakarta yang telah memberikan informasi dan bantuan
mencari sumber bahan baku kerja dalam proses penelitian ini.
8. P.T. Combiphar Indonesia, yang telah memberikan baku parasetamol yang
sangat bermanfaat selama proses penelitian ini.
9. P.T. Konimex yang telah memberikan baku guaifenesin dan klorfeniramin maleat
yang sangat bermanfaat selama proses penelitian ini.
10. Seluruh dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang
telah mendidik dan membantu penulis selama proses perkuliahan.
11. Mas Bimo, Mas Kethul, dan Mas Ottok selaku Laboran, Karyawan Laboratorium
Kimia Analisis Instrumental, dan Pengelola Gudang Laboratorium yang
membantu penulis selama proses penelitian.
12. Ayah, Bunda, saudara-saudariku tercinta yang selalu mendoakan, memberikan
dukungan, kesabaran, semangat, harapan kepada penulis selama proses
ix
13. Keponakanku yang kusayangi, Eca, Faiz dan Jeslyn atas doanya, yang selalu
menghibur dan mendukung penulis dalam menyelesaikan naskah skripsi ini.
14. Ade, Arif dan Jalaq sebagai sahabat dan rekan kerja yang telah memberikan
dukungan, kritik dan saran, meluangkan waktu dalam membantu penulis selama
proses penelitian dan penyusunan naskah skripsi ini.
15. Devina dan Sophia selaku rekan kerja yang telah berjuang bersama, memberikan
dukungan, kritik dan saran dalam proses penelitian skripsi ini.
16. Mbak Yola, Teguh, Yonas dan Tomi sebagai sahabat yang telah memberikan
solusi dan bantuan kepada penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.
17. Teman-teman FST B 2011 dan seluruh teman-teman angkatan 2011 atas
kekompakkan dan kebersamaan yang luar biasa.
18. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu, yang turut
membantu dalam penyelesaian naskah skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kata kesempurnaan.
Oleh karena itu, kritik dan saran sangat penulis harapkan. Penulis berharap, semoga
skripsi ini memberikan manfaat bagi pembaca dan dapat menjadi acuan dalam
pengembangan ilmu kefarmasian.
Yogyakarta, Mei 2016
x DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ... i
HALAMAN PERSETUJUAN ... ii
HALAMAN PENGESAHAN ... iii
PERNYATAAN KEASLIAN PENULIS ... iv
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ... v
HALAMAN PERSEMBAHAN ... vi
PRAKATA ... vii
DAFTAR ISI ... x
DAFTAR TABEL ... xiii
DAFTAR GAMBAR ... xv
DAFTAR LAMPIRAN ... xvii
INTISARI ... xix
ABSTRACT ... xx
BAB I. PENGANTAR ... 1
A. Latar Belakang ... 1
B. Rumusan Masalah ... 3
C. Keaslian Penelitian ... 3
D. Manfaat Penelitian ... 4
E. Tujuan Penelitian ... 5
BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA... 6
xi
B. Parasetamol, Guaifenesin, Klorfeniramin maleat ... 7
1. Parasetamol ... 7
2. Guaifenesin ... 8
3. Klorfeniramin maleat ... 9
C. Spektrofotometri UV-Vis ... 9
D. Analisis Multikomponen Secara Spektrofotometri UV ... 12
E. Kemometrika ... 14
F. Validasi Metode Analisis ... 16
1. Presisi ... 16
2. Akurasi ... 17
3. Selektivitas ... 18
G. Landasan Teori ... 18
H. Hipotesis ... 20
BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ... 21
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ... 21
B. Variabel Penelitian ... 21
1. Variabel Bebas ... 21
2. Variabel Tergantung ... 21
3. Variabel Pengacau ... 21
C. Defenisi Operasional ... 22
D. Bahan Penelitian ... 22
xii
F. Tata Cara Penelitian ... 23
1. Scanning spektra standar ... 23
2. Pemilihan Interval dan Panjang Gelombang ... 23
3. Penyiapan Larutan set Kalibrasi ... 24
4. Pembuatan Standar Adisi CTM ... 25
5. Analisis Sampel ... 25
6. Analisis Statistik ... 26
7. Analisis Data Sampel ... 28
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 30
A. Analisis Senyawa Multikomponen ... 30
B. Validasi Model Kalibrasi Multivariat Partial Least Square (PLS) ... 37
C. Penetapan Kadar Sediaan Farmasi ... 43
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ... 48
A. Kesimpulan ... 48
B. Saran ... 48
DAFTAR PUSTAKA ... 50
LAMPIRAN ... 53
xiii
DAFTAR TABEL
Tabel I. Kriteria penerimaan nilai RSD ... 17
Tabel II. Nilai % recovery ... 18
Tabel III. Komposisi campuran sintetik parasetamol (PCT), guaifenesin (GG)
dan klorfeniramin maleat (CTM) untuk model kalibrasi ... 24
Tabel IV. Nilai sebenarnya dan terhitung hasil kalibrasi PLS dari calibration set
yang mengandung parasetamol (PCT), guaifenesin (GG) dan
klorfeniramin maleat (CTM) tanpa validasi silang (cross validation)
pada λ 220-310 nm ... 34
Tabel V. Nilai sebenarnya dan terhitung hasil kalibrasi PLS dari calibration set
yang mengandung parasetamol (PCT), guaifenesin (GG) dan
klorfeniramin maleat (CTM) validasi silang (cross validation) pada λ
220-310 nm ... 38
Tabel VI. Hasil persamaan, R2, RMSECV dan PRESS yang diperoleh dari
hubungan antara nilai sebenarnya dan nilai terhitung validasi silang
(cross validation) pada λ 220-310 nm ... 39
Tabel VII. Hasil penetapan kadar prediksi parasetamol (PCT) dalam sediaan
farmasi sirup menggunakan metode spektrofotometri UV-PLS ... 45
Tabel VIII. Hasil penetapan kadar prediksi guaifenesin (GG) dalam sediaan
xiv
Tabel IX. Hasil penetapan kadar prediksi klorfeniramin maleat (CTM) dalam
sediaan farmasi sirup menggunakan metode spektrofotometri UV-PLS
xv
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur parasetamol ... 7
Gambar 2. Struktur guaifenesin ... 8
Gambar 3. Struktur klorfeniramin maleat ... 9
Gambar 4. Instrumentasi spektrofotometri UV doublebeam ... 11
Gambar 5. Overlay spektra UV parasetamol (PCT), guaifenesin (GG), klorfeniramin maleat (CTM) dan spektra UV campuran ketiga senyawa yang diukur pada λ 220-400 nm ... 30
Gambar 6. Overlay spektra UV sampel sediaan farmasi (sirup) dan spektra UV campuran baku parasetamol (PCT), guaifenesin (GG) dan klorfeniramin maleat (CTM) yang diukur pada λ 220-310 nm ... 32
Gambar 7. Overlay spektra UV campuran baku parasetamol (PCT), guaifenesin (GG) dan klorfeniramin maleat (CTM) yang diukur pada λ 220-310 nm ... 33
Gambar 8. Kurva hubungan nilai sebenarnya dengan nilai terhitung pada model kalibrasi multivariat PLS parasetamol ... 36
Gambar 9. Kurva hubungan nilai sebenarnya dengan nilai terhitung pada model kalibrasi multivariat PLS guaifenesin ... 36
Gambar 10. Kurva hubungan nilai sebenarnya dengan nilai terhitung pada model kalibrasi multivariat PLS klorfeniramin maleat ... 37
xvi
Gambar 12. Data dan parameter hasil validasi silang guaifenesin (GG) dengan
teknik leave-one-out ... 41
Gambar 13. Data dan parameter hasil validasi silang klorfeniramin maleat (CTM)
dengan teknik leave-one-out ... 41
Gambar 14. Kurva hubungan antara nilai parasetamol sebenarnya dan nilai
terhitung hasil validasi silang leave one-out ... 42
Gambar 15. Kurva hubungan antara nilai guaifenesin sebenarnya dan nilai
terhitung hasil validasi silang leave one-out ... 42
Gambar 16. Kurva hubungan antara nilai klorfeniramin maleat sebenarnya dan
nilai terhitung hasil validasi silang leave one-out ... 43
Gambar 17. Overlay spektra 6 sampel sediaan farmasi yang diukur pada panjang
xvii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Sertifikat analisis baku parasetamol ... 54
Lampiran 2. Sertifikat analisis baku guaifenesin ... 55
Lampiran 3. Sertifikat analisis baku klorfeniramin maleat ... 56
Lampiran 4. Data Penimbangan Standar Adisi Klorfeniramin maleat ... 57
Lampiran 5. Data pengukuran spektrofotometer UV 20 campuran sintetik untuk model PLS pada panjang gelombang 220 – 310 nm yang diukur dengan interval pengukuran 2 nm ... 58
Lampiran 6. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square (PLS) parasetamol dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik tanpa validasi internal ... 62
Lampiran 7. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square (PLS) guaifenesin dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik tanpa validasi internal ... 63
Lampiran 8. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square (PLS) klorfeniramin maleat dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik tanpa validasi internal ... 64
xviii
Lampiran 10. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square (PLS)
guaifenesin dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik validasi
internal ... 66
Lampiran 11. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square (PLS) klorfeniramin maleat dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik validasi internal ... 67
Lampiran 12. Data nilai koefisien dari model PLS parasetamol ... 68
Lampiran 13. Data nilai koefisien dari model PLS guaifenesin ... 69
Lampiran 14. Data nilai koefisien dari model PLS klorfeniramin maleat ... 70
Lampiran 15. Data pengukuran spektrofotometri UV enam replikasi sampel pada panjang gelombang 220 – 310 nm yang diukur dengan interval pengukuran 2 nm ... 71
Lampiran 16. Perhitungan kadar parasetamol pada sampel sirup menggunakan hasil koefisien validasi silang ... 73
Lampiran 17. Perhitungan kadar guaifenesin pada sampel sirup menggunakan hasil koefisien validasi silang ... 75
xix INTISARI
Kebutuhan akan obat dengan zat aktif multikomponen semakin meningkat dalam kalangan masyarakat, sehingga membutuhkan peningkatan pengawasan mutu produk obat dalam menjamin keamanan dan khasiat yang dihasilkan. Berbagai metode telah dikembangkan untuk penjaminan mutu produk obat, seperti metode spektrofotometri. Akan tetapi, metode spektrofotometri tidak dapat digunakan dalam analisis senyawa multikomponen, mengingat keterbatasan metode tersebut dalam mengatasi overlapping spektra senyawa. Oleh karena itu, diperlukan suatu modifikasi metode, yakni dengan mengkombinasikan kemometrika dan spektrofotometri, sehingga masalah overlapping tersebut dapat teratasi.
Metode spektrofotometri yang dikombinasikan dengan kemometrika kalibrasi multivariat partial least square (PLS) digunakan dalam analisis sediaan farmasi sampel sirup dengan komposisi parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat. Evaluasi metode didasarkan pada nilai koefisien determinasi (R2), root mean square error of calibration (RMSEC), dan root mean square error of calibration validation (RMSECV).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa analisis sediaan farmasi sampel sirup dengan komposisi parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat menggunakan metode kombinasi spektrofotometri dan kemometrika belum berhasil dilakukan. Untuk model kalibrasi, diperoleh nilai R2 PCT 0,994, GG 0,999 dan CTM 0,999. Nilai RMSEC PCT 0,289, GG 0,099 dan CTM 0,078. Untuk model validasi, diperoleh nilai R2 PCT 0,999, GG 0,999 dan CTM 0,998. Nilai RMSECV PCT 0,116, GG 0,084 dan CTM 0,219.
xx ABSTRACT
The need of a drug with active ingredient multicomponent increasing in the community, thus requiring an increase in the quality control of medicinal products in ensuring the safety and efficacy of the resulting. Various methods have been developed for quality assurance of drug products, such as spectrophotometric method. However, the spectrophotometric method can not be used in the analysis of multicomponent compound, given the limitations of the method to resolve overlapping spectra of compounds. Therefore, we need a modification of the method, by combining chemometrics and spectrophotometry, so that the overlapping issue can be resolved.
Spectrophotometric method combined with chemometrics multivariate calibration partial least square (PLS) was used in the analysis of pharmaceutical syrup samples with the composition of paracetamol, guaifenesin and chlorpheniramine maleate. Evaluation methods are based on the coefficient of determination (R2), root mean square error of calibration (RMSEC), and root mean square error of calibration validation (RMSECV).
The results showed that the analysis of pharmaceutical syrup samples with the composition of paracetamol, guaifenesin and chlorpheniramine maleate using a combination of spectrophotometric and chemometrics method was unsuccessful. For the calibration models, the value of R2 PCT 0,994, GG 0,999 and CTM 0,999. Value RMSEC PCT 0,289, GG 0,099 and CTM 0,078. For the model of validation, the value of R2 PCT 0,999, GG 0,999 and CTM 0,998. Value RMSECV PCT 0,116, GG 0,084 and CTM 0,219.
1 BAB I PENGANTAR
A. Latar Belakang
Dewasa ini, obat merupakan suatu kebutuhan dalam kehidupan sehari-hari.
Obat dalam arti luas adalah zat kimia yang dalam takaran tertentu dan dengan
penggunaan yang tepat dapat dimanfaatkan untuk mencegah penyakit,
menyembuhkan penyakit atau memelihara kesehatan. Hal tersebut selaras dengan
kecenderungan masyarakat untuk mengobati dirinya sendiri (self medication)
sebelum mendapat pertolongan tenaga medis, khususnya pada penyakit yang
tergolong ringan seperti pilek, batuk, deman, dan sebagainya (Shankar et al., 2002).
Seiring dengan berkembangnya dunia industri farmasi yang memproduksi
obat-obat influenza dalam berbagai merek dagang, yang mana setiap komposisi dalam
proses produksi produk sediaan farmasi yang kurang lebih sama. Peningkatan
produksi sediaan farmasi ini perlu diimbangi dengan peningkatan dalam hal
pengawasan mutu, sehingga setiap produk yang beredar tersebut dapat
dipertanggungjawabkan keamanan dan khasiatnya. Adapun hal yang berkaitan
langsung dengan kedua hal tersebut adalah kandungan bahan aktif dalam sediaan
obat. Kombinasi parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat sering digunakan
sebagai zat aktif untuk meringankan gejala batuk dan pilek, penyakit yang hampir
Dalam dunia industri farmasi, proses penjaminan mutu yang cepat dan
handal mutlak diperlukan. Oleh karena itu, kebutuhan suatu metode analisis yang
cepat dan memenuhi persyaratan kesahihan suatu metode yang dapat menunjang hal
tersebut sangat tinggi. Spektrofotometer UV merupakan salah satu metode yang
sederhana, cepat dan lazim digunakan dalam laboratorium industri farmasi untuk
analisis suatu sediaan obat. Hanya saja, spektrofotometri UV biasanya digunakan
dalam analisis sediaan obat dengan zat aktif tunggal. Penggunaan instrumen
spektrofotometer UV dalam analisis sediaan obat multikomponen sangat sulit
dilakukan, mengingat permasalahan spektra yang tumpang-tindih antar komponen.
Untuk mengatasi permasalahan tersebut, diperlukan pengolahan data secara statistik
yakni menggunakan metode kalibrasi multivariat “kemometrika”. Kombinasi metode
spektrofotometri UV dengan kalibrasi multivariat dapat digunakan dalam
menganalisis senyawa multikomponen yang memiliki spektra UV overlapping
(Danzer et al, 2004).
Metode kemometrika yang paling sering dikombinasikan dengan
spektrofotometri UV adalah metode kalibrasi multivariat partial least square (PLS).
Kalibrasi multivariat PLS merupakan metode yang menggunakan suatu kombinasi
linier dari variabel prediktor daripada menggunakan variabel biasa. Pemilihan metode
kalibrasi multivariat partial least square (PLS) didasarkan pada kelebihan metode ini
yang mampu memprediksi dengan cara yang lebih baik ketika terdapat spektra yang
tumpang tindih satu sama lain (Sohrabi et al., 2009). Kombinasi kedua metode ini
guaifenesin dan klorfeniramin maleat dalam sediaan sirup farmasi, sehingga metode
ini diharapkan dapat diaplikasikan secara rutin oleh pihak-pihak yang
berkepentingan.
1. Rumusan Masalah
Berdasarkan pada latar belakang permasalahan yang telah diuraikan di atas,
maka dapat diuraikan beberapa rumusan masalah sebagai berikut:
a. Apakah metode spektrofotometri UV yang dikombinasikan dengan teknik
kemometrika kalibrasi multivariat PLS untuk analisis sediaan sampel sirup
dengan komposisi parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat merupakan
metode yang valid?
b. Apakah kombinasi metode spektroskopi UV dengan teknik kalibrasi multivariat
PLS tanpa proses pemisahan dapat digunakan untuk menetapkan kadar
parasetamol, guaifenesin, dan klorfeniramin maleat dalam sirup?
2. Keaslian Penelitian
Hasil penelusuran publikasi-publikasi ilmiah menunjukkan bahwa analisis
campuran parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat secara simultan dalam
sediaan sampel sirup secara spektrofotometri UV-Vis yang dikombinasikan dengan
kemometrika kalibrasi multivariat belum pernah dilaporkan. Beberapa penelitian
yang telah berhasil menetapkan kadar senyawa multikomponen dengan metode
a. Kombinasi spektrofotometri UV dan kalibrasi multivariat untuk analisis
parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat dalam sediaan tablet secara
simultan tanpa tahap pemisahan oleh Yani Ardiyanti (2014).
b. Penetapan kadar parasetamol, ibuprofen, dan kafein secara simultan dengan
kombinasi spektrofotometri UV dan pendekatan kalibrasi multivariat oleh
Khosayand et al., (2008).
3. Manfaat Penelitian
Manfaat yang dapat diperoleh dari penelitian ini:
a. Manfaat Metodologis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan ilmiah tentang
penggunaan metode spektroskopi UV yang dikombinasikan dengan
teknik kalibrasi multivariat dalam analisis kadar parasetamol,
guaifenesin dan klorfeniramin maleat sediaan sampel sirup.
b. Manfaat Teoretis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan tambahan informasi ilmiah
mengenai validasi metode penetapan kadar sampel sirup dengan
komposisi parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat dalam
sediaan farmasi secara spektrofotometri UV–Vis.
c. Manfaat Praktis
Hasil penelitian ini diharapkan dapat digunakan untuk menetapkan
kadar campuran parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat
B. Tujuan Penelitian
Secara umum penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan
spektrofotometri UV untuk analisis campuran parasetamol, guaifenesin dan
klorfeniramin maleat dalam sediaan sampel sirup secara langsung tanpa melakukan
pemisahan terlebih dahulu. Secara khusus, penelitian ini bertujuan untuk :
1. Mengetahui validitas metode spektrofotometri UV yang dikombinasikan
dengan teknik kalibrasi multivariat PLS untuk analisis campuran
parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat secara simultan
dalam sediaan sirup.
2. Menetapkan kadar sediaan sampel sirup parasetamol, guaifenesin dan
klorfeniramin maleat dengan metode spektrofotometri UV yang
6 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Sirup
Sirup adalah larutan oral yang merupakan sediaan cair yang dibuat untuk
pemberian oral, mengandung sukrosa (tidak kurang dari 64,0 % dan tidak lebih dari
66,0 %) atau gula lain kadar tinggi dengan atau tanpa bahan pengaroma, atau pewarna
yang larut dalam air atau campuran kosolven-air (Anonim, 1979; Anonim, 1995).
Sirup yang mengandung bahan pemberi rasa tapi tidak mengandung zat-zat
obat (bahan aktif) dinamakan pembawa. Sirup dimaksudkan pembawa yang
memberikan rasa enak pada zat obat yang ditambahkan kemudian, baik dalam
peracikan resep atau dalam pembuatan formula standar. Sedangkan sirup obat adalah
sirup yang mengandung bahan terapeutik atau bahan obat (Ansel, 1989).
Kandungan sakarosa dalam sirup terletak antara 50 sampai 65 %, akan tetapi
umumnya terletak antara 60 sampai 65 %. Dalam larutan gula yang jenuh (kira-kira
66%) tidak memungkinkan pembentukan jamur karena dengan larutan berkonsentrasi
tinggi, air yang penting untuk perkembangan jamur ditarik melalui osmosis. Atas
dasar ini sediaan dengan sukrosa berkonsentrasi tinggi dinilai lebih baik. Meskipun
demikian harus diperhatikan, bahwa dengan meningkatnya kandungan gula dari sirup
B. Parasetamol, Guaifenesin, Klorfeniramin maleat
Parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat sering dijumpai dalam
sediaan farmasi untuk mengatasi batuk dan pilek. Kebanyakan batuk dan pilek
disebabkan oleh infeksi virus pada saluran pernafasan bagian atas (ISPA). Penyakit
ini sebenarnya dapat sembuh dengan sendirinya, namun masyarakat memilih untuk
mengkonsumsi obat-obatan untuk mengurangi gejala yang timbul. Obat-obatan ini
dapat diperoleh tanpa menggunakan resep dokter (Over the Counter/OTC)
(Blenkinsoop et al., 2009).
Obat batuk dan pilek merupakan salah satu segmen terbesar obat OTC.
Dengan adanya peningkatan kebutuhan obat batuk dan pilek, maka mendorong
kompetisi perusahaan-perusahaan farmasi untuk memproduksi obat-obatan tersebut.
Dengan demikian diperlukan pula metode analisis yang cepat, handal dan sederhana
untuk menganalisis obat-obat batuk dan pilek multikomponen tersebut (Sawant dan
Borkar, 2012).
1. Parasetamol
Parasetamol (PCT) (Gambar 1) dengan rumus kimia C8H9NO2 (BM 151,2)
berbentuk kristal atau serbuk berkristal, sedikit larut dalam air dingin, lebih larut
dalam air panas; larut dalam etanol, metanol, dimetilformamid, etilen diklorid, aseton,
dan etil asetat; sangat sedikit larut dalam kloroform; sedikit larut dalam eter; praktis
tidak larut dalam petroleum eter, pentane, dan benzen. Spektrum UV parasetamol
dengan nilai �11% = 688, pada larutan alkali 257 nm (�11% = 715) (Moffat et al.,
2004).
Gambar 1. Struktur Parasetamol 2. Guaifenesin
Guaifenesin (GG) (Gambar 2) dengan rumus kimia C10H14O4 (BM 198,2)
berbentuk kristal putih atau sedikit kristal abu-abu atau agregrat yang berbentuk
kristal. Kelarutan guaifenesin adalah 1 g dalam 33 mL air, 1 g dalam 11 mL etanol, 1
g dalam 11 mL kloroform, 1 g dalam 100 mL eter, larut dalam gliserol dan propilen
glikol, sebagian larut dalam benzen, praktis tidak larut dalam petroleum eter.
Spektrum UV guaifenesin pada larutan asam mempunyai panjang gelombang
maksimal di sekitar 273 nm dengan nilai �11% = 125 (Moffat et al., 2004).
3. Klorfeniramin Maleat
Klorfeniramin maleat (CTM) (Gambar 3) dengan rumus kimia C16H19CIN2,
C4H4O4 (BM 390,9) berbentuk serbuk kristal putih, larut 1 mg/mL dalam 300 mL
ethanol, 1 mg/mL dalam 240 mL Kloroform, 1 mg/mL dalam 160 mL air, 1 mg/mL
dalam 130 mL metanol, sukar larut dalam benzen dan eter. Klorfeniramin maleat
memiliki absorbansi pada panjang gelombang 265 nm dalam pelarut asam dengan
nilai �11% = 302, dan pada panjang gelombang 262 nm pada pelarut basa dengan nilai
�11% = 205 (Moffat et al., 2004).
Gambar 3. Struktur Klorfeniramin Maleat
C. Spektrofotometri UV-Vis
Spektrofotometri ultraviolet-visibel (UV-Vis) adalah salah satu teknik
analisis fisika-kimia yang mengamati tentang interaksi atom atau molekul dengan
radiasi elektromagnetik pada daerah panjang gelombang 190-380 nm (UV) atau
380-780 nm (Vis) (Mulja dan Suharman, 1995).
Spektrofotometri UV adalah pengukuran suatu interaksi antara radiasi
gelombang (λ) 190-380 nm (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI,
1995).
Prinsip kerja spektrofotometri UV-Vis berdasarkan interaksi antara radiasi
elektromagnetik dengan atom, ion, atau molekul. Serapan atom menyebabkan
peralihan atau transisi elektronik, yaitu peningkatan energi elektron dari keadaan
dasar (ground state) ke satu atau lebih tingkat energi yang lebih tinggi atau tereksitasi
(excited state). Transisi terjadi jika energi yang dihasilkan oleh radiasi sama dengan
energi yang diperlukan untuk melakukan transisi (Watson, 2003).
Pada umumnya prinsip kerja spektrofotometri adalah berdasarkan atas
interaksi antara radiasi elektromagnetik dengan materi. Materi dapat berupa atom, ion
atau molekul, sedangkan radiasi elektromagnetik merupakan salah satu jenis energi
yang ditransmisikan dalam ruang kecepatan tinggi (Khopkar, 1990). Interaksi radiasi
elektromagnetik dengan bahan yaitu bila cahaya jatuh pada senyawa maka sebagian
dari cahaya diserap oleh molekul-molekul sesuai struktur dari molekul. Setiap
senyawa mempunyai tingkatan tenaga yang spesifik.
Semua molekul dapat menyerap radiasi elektromagnetik di daerah UV-Vis
karena memiliki elektron sekutu maupun menyendiri, yang dapat dieksitasikan ke
tingkat energi yang lebih tinggi. Sementara panjang gelombang yang menunjukkan
terjadinya serapan tergantung pada kuat lemahnya ikatan elektron dalam molekul
Spektrofotometer double beam (Gambar 4) merupakan pengembangan dari
spektrofotometer single beam karena keterbatasan yang dimiliki oleh
spektrofotometer single beam.
Gambar 4. Instrumentasi spektrofotometri UV double beam
Spektrofotometer double beam memiliki dua sinar yang dibentuk oleh
potongan cermin yang digunakan untuk memecah sinar. Sinar pertama melewati
larutan blanko dan sinar kedua melewati sampel. Dengan dilakukannya sistem ini
maka spektrofotometer double beam dapat mengkoreksi perubahan respon absorbansi
akibat perbedaan intensitas cahaya, fluktuasi pada kelistrikan instrumen dan
absorbansi blanko (Haven et al., 1994).
Penyerapan (absorpsi) sinar UV dan sinar tampak umumnya dihasilkan oleh
eksitasi elektron-elektron ikatan, sehingga panjang gelombang pita yang menyerap
dapat dihubungkan dengan ikatan yang ada dalam suatu molekul. Dalam
spektrofotometer UV-Vis, suatu radiasi dikenakan pada larutan (sampel) dan
intensitas sinar radiasi yang diteruskan diukur besarnya. Radiasi yang diserap oleh
yang diserap. Serapan terjadi jika radiasi/foton yang mengenai sampel memiliki
energi yang sama dengan energi yang diperlukan untuk perubahan tenaga. Kekuatan
radiasi dapat mengalami penurunan dengan adanya penghamburan dan pemantulan
cahaya (Rohman, 2012).
Kesalahan dalam pengukuran menggunakan spektrofotometer dapat
ditimbulkan oleh beberapa hal, antara lain: adanya bekas jari yang menempel pada
dinding kuvet, adanya gelembung gas atau partikel yang tidak larut yang berada
dalam jalan optis, stabilitas sampel serta konsentrasi analit. Untuk meminimalkan
kesalahan tersebut salah satunya dengan cara mengendalikan konsentrasi analit
sehingga didapatkan nilai serapan antara 0,2-0,8. Persentase kesalahan analisis yang
dihasilkan pada pembacaan serapan 0,2-0,8 yang masih dapat diterima yaitu sebesar
0,5-1 % (Mulja dan Suharman, 1995).
D. Analisis Multikomponen Secara Spektrofotometri UV
Spektrofotometri UV-Vis merupakan salah satu metode pengukuran
berdasarkan pada interaksi radiasi elektromagnetik dengan sampel di daerah panjang
gelombang 200-800 nm. Berbagai publikasi telah melaporkan analisis parasetamol,
guaifenesin dan klorfeniramin maleat secara spektrofotometri UV-Vis, dalam
campuran dengan obat lain, terutama dihubungkan dengan perkembangan perangkat
lunak kemometrika (Khosayand, 2008).
Khosayand et al. (2008) telah berhasil menetapkan kandungan parasetamol,
menggunakan spektrofotometri UV yang dikombinasikan dengan kemometrika
kalibrasi multivariat PLS dan principal component-artificial neural network.
Yani Ardiyanti (2014) telah berhasil melakukan analisis penetapan
kandungan parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat secara simultan
dengan menggunakan metode kombinasi antara spektrofotometri UV dan
kemometrika kalibrasi multivariat PLS dalam sediaan tablet. Hasil uji yang
didapatkan untuk parasetamol 639,38 mg/tab ± 0,82, guaifenesin 102,61 mg/tab ±
1,45 dan klorfeniramin maleat 1,98 mg/tab ± 2,64.
Penggunaan kalibrasi multivariat-spektrofotometri UV telah dilaporkan
untuk analisis parasetamol, difenhidramin serta fenilpropanolamin, yang mana
parasetamol adalah komponen dalam jumlah banyak, sementara dua lainnya dalam
jumlah sedikit. Analisis campuran ini dapat dilakukan tanpa pemisahan terlebih
dahulu dengan kalibrasi multivariat PLS terhadap spektra campuran ketiganya.
Meskipun rasio molaritas parasetamol dengan lainnya adalah 38 : 1 (dengan
difenhidramin) dan 25 : 1 (dengan fenilpropanolamin), akan tetapi keduanya dapat
dianalisis dengan akurasi dan presisi yang baik tanpa adanya gangguan dari bahan
tambahan tablet (Goicoechea dan Olivieri, 1999). Peneliti ini juga melaporkan bahwa
penggunaan CLS kurang memuaskan karena rendahnya nilai absorbansi
E. Kemometrika
Menurut International Chemometrics Society, kemometrika adalah ilmu
pengetahuan yang menghubungkan pengukuran yang dibuat pada suatu proses atau
sistem kimiawi melalui penggunaan ilmu matematika dan metode statistik. Dari sini
dapat diketahui bahwa ilmu matematika dan statistika mendukung pemahaman
kemometrika. Kemometrika dikenalkan ke dalam spektroskopi untuk meningkatkan
kualitas data yang diperoleh. Meskipun pada awal penggunaannya hanya untuk
mengolah data spektra, akan tetapi saat ini kemometrika memungkinkan untuk
memperlakukan sejumlah besar informasi yang berasal dari konsentrasi komponen
sampel dalam jangka waktu yang cepat (Rohman, 2014).
Metode kemometrika telah dikenalkan dan digunakan secara luas dalam
bidang analisis obat seperti kalibrasi multivariat dan analisis pengelompokkan seperti
principle component analysis dan discriminant analysis (Massart and Buydens,
1988). Kalibrasi multivariat merupakan teknik yang paling sering digunakan terutama
untuk analisis multi-komponen (Miller and Miller, 2010).
Diantara jenis kalibrasi multivariat, teknik kalibrasi classical least squares
(CLS), stepwise multiple linear regression (SMLR), principle component regression
(PCR) dan partial least squares (PLS) merupakan jenis yang paling sering
digunakan. Kalibrasi PCR merupakan analisis faktor yang mana hanya spektra yang
tidak memberi ko-linieritas yang digunakan dalam kalibrasi. PCR mengaplikasikan
teknik multivariat analisis komponen utama atau principal component analysis (Che
dengan algoritma kuadrat terkecil yang menghubungkan antara dua matriks, data
spectra pada matriks X dan nilai referens pada matriks Y. PLS sering digunakan
dalam spektroskopi untuk mengekstrak informasi spektra yang mengandung
puncak-puncak yang tumpang suh, adanya pengganggu, serta adanya derau (noise) dari
instrumen yang digunakan untuk mengumpulkan data (Syahariza et al., 2005).
Teknik kalibrasi PCR dan PLS dilakukan dalam 3 tahap yaitu : (1) kalibrasi;
(2) validasi; dan (3) analisis sampel yang tidak diketahui (Osborne et al., 1997).
Secara umum, kalibrasi multivariat mempunyai tahap kalibrasi yang diikuti validasi
(dengan validasi sampel secara terpisah atau dengan validasi silang tengan teknik
leave one out) dan tahap prediksi (sampel baru). Jika hasil tahap kalibrasi dan validasi
yang digunakan memenuhi kriteria (korelasi yang tinggi, kesalahan yang kecil) maka
model yang dikembangkan selanjutnya digunakan untuk mengestimasi konsentrasi
campuran dari sampel yang belum diketahui konsentrasinya.
Kalibrasi PLS dievaluasi dengan menggunakan root mean square error of
calibration (RMSEC) dan koefisien determinasi (R2). Selanjutnya model PLS
diujisilangkan menggunakan teknik “leave one out”. Dalam teknik ini, salah satu
sampel kalibrasi dikeluarkan dari model PLS dan sisa sampel yang ada digunakan
untuk pemodelan dengan PLS. Sampel yang dihilangkan selanjutnya dihitung dengan
model PLS baru yang dikembangkan. Prosedur tersebut dilakukan berulang kali,
menghilangkan satu demi satu sampel kalibrasi hingga didapatkan harga R2 yang
F. Validasi Metode Analisis
Danzer et al. (2004) menuliskan bahwa kalibrasi di dalam analisis kimia
mengacu pada hubungan antara jumlah atau kadar sampel x = fs (Q) dan fungsi
terukur y = f(z) yang bisa berupa spektrum, kromatogram atau yang lain. Kehandalan
analisis multikomponen harus divalidasi sesuai dengan kriteria yang umum yaitu
selektivitas, akurasi dan presisi, selanjutnya dapat dihitung nilai kritis multivariat dan
batas deteksi. Dalam kalibrasi multivariat, harus dihindari kolinieritas variabel yang
disebabkan oleh konsentrasi sampel kalibrasi.
1. Presisi
Ketidakpastian kalibrasi dan prediksi kadar yang tidak diketahui dihitung
dengan root mean standard error of calibration (RMSEC) dan root mean square
error of cross validation (RMSECV) dengan persamaan dibawah ini :
RMSEC = ŝ � = ( �
mengukur presisi kalibrasi multivariat adalah nilai predictive residual error sum
of squares (PRESS), yang dihitung dengan persamaan berikut :
� � = 2 = �=1 �2 = �=1( � � − � �䟒〱 )2 (3)
Kriteria presisi diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif
atau koefisien variasi 2% atau kurang untuk kadar analit 100%. Kriteria tersebut
sangat fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah
sampel, dan kondisi laboratorium seperti pada Tabel I.
Tabel I. Kriteria penerimaan nilai RSD (Horwitz cit. Gonzales, Herrador, and Asuero, 2010).
Analit % Fraksi analit Konsentrasi
analit Nilai RSD (%)
Ada tidaknya suatu kesalahan sistematik dapat diketahui dari fungsi
recovery. Kadar yang diprediksi model (ĉ) dibandingkan dengan kadar actual
sampel validasi (c) dengan persamaan regresi sebagai berikut :
ĉ=α + βc (4)
Koefisien regresi ideal adalah jika nilai α = 0 dan β = 1 (Danzer et al., 2004).
Akurasi dinyatakan sebagai persen kembali analit yang ditambahkan, nilai
kecermatan dapat dinyatakan dengan persen perolehan kembali (% recovery).
Tabel II. Nilai % recovery sebagai fungsi dari nilai konsentrasi analit dalam matriks sampel (Wood, 1998)
Analit pada matrix sampel (%) Recovery yang diterima (%)
100 98 – 102
Secara umum, selektivitas sistem multikomponen dapat ditetapkan secara
kualitatif dan kuantitatif. Dalam kalibrasi multivariat, selektivitas biasanya
dihitung dengan condition number. Namun condition number tidak
memperhitungkan kadar masing-masing komponen dan hanya memberikan
batasan besarnya kesalahan yang diperbolehkan (Danzer et al., 2004).
G. Landasan Teori
Kombinasi senyawa obat parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat
sering digunakan sebagai zat aktif untuk meringankan gejala batuk dan pilek,
penyakit yang hampir seluruh orang pernah mengalaminya. Indikasi obat tersebut
adalah sebagai analgesik, antipiretik, ekspektoran dan antihistamin (Hardman et al.,
1996).
Ketiga zat aktif tersebut mempunyai sifat kelarutan yang mirip. Parasetamol
dalam natrium hidroksida 1 N, mudah larut dalam etanol. Klorfeniramin maleat
sangat mudah larut dalam air, mudah larut dalam etanol, agak sukar larut dalam
kloroform. Parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat masing-masing dapat
ditetapkan kadarnya menggunakan spektrofotometri UV-Vis. Spektrum UV
parasetamol dalam larutan asam memiliki serapan maksimum di sekitar 245 nm dan
serapan maksimum dalam larutan basa pada 257 nm. Spektrum UV guaifenesin
dalam larutan asam memiliki serapan maksimum di sekitar 273 nm. Spektrum UV
klorfeniramin maleat dalam larutan asam memiliki serapan maksimum pada 265 nm,
dan serapan maksimum dalam larutan basa pada 262 nm. Serapan maksimum ketiga
zat aktif tersebut berada dalam range panjang gelombang yang berdekatan, yang
menyebabkan spektrum serapan ketiga senyawa tersebut tumpang tindih. Untuk itu,
metode analisis spektrofotometri UV-Vis yang dikombinasikan dengan kemometrika
kalibrasi multivariat dapat digunakan sebagai metode analisis untuk ketiga senyawa
yang tumpang tindih tersebut.
Proses penetapan kadar secara simultan dari dua atau lebih kombinasi
senyawa obat multikomponen yang mengkombinasikan metode analisis
spektrofotometri UV dengan kemometrika kalibrasi multivariat dikategorikan
berhasil apabila nilai koefisien determinasi (R2) hubungan antara kadar sebenarnya
dengan kadar terprediksi >0,99, dan RMSECV (root mean square error of cross
H. Hipotesis
1. Spektrofotometri ultraviolet yang dikombinasikan dengan teknik kalibrasi
multivariat dapat digunakan untuk analisis campuran parasetamol, guaifenesin
dan klorfeniramin maleat dalam sediaan sampel sirup.
2. Spektrofotometri ultraviolet yang dikombinasikan dengan teknik kalibrasi
multivariat dapat diaplikasikan untuk penetapan kadar parasetamol, guaifenesin
21 BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Jenis penelitian ini termasuk penelitian noneksperimental dengan rancangan
penelitian deskriptif. Jenis penelitian noneksperimental karena subyek penelitian
tidak diberi perlakuan. Rancangan penelitian bersifat deskriptif karena peneliti hanya
mendeskripsikan keadaan yang ada.
B. Variabel Penelitian 1. Variabel Bebas
Variabel bebas penelitian ini adalah variasi konsentrasi larutan campuran
senyawa parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat.
2. Variabel Tergantung
Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah konsentrasi sampel larutan
parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat.
3. Variabel Pengacau
Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah kemurnian standar
analisis parasetamol, guaifenesin, dan klorfeniramin maleat yang digunakan, kualitas
C. Defenisi Operasional
1. R2 atau R-sq merupakan koefisien determinasi yang menggambarkan
kemampuan nilai konsentrasi sebenarnya dalam menjelaskan hubungan terhadap
nilai terhitung.
2. RMSE (root mean square of error) merupakan standar deviasi dari sebuah
pemodelan yang menjelaskan seberapa mungkin suatu model kalibrasi
melakukan kesalahan saat memprediksikan sampel.
3. PRESS (predicted error sum of square) merupakan nilai kesalahan yang
dilakukan saat prediksi sampel oleh model kalibrasi dalam proses
cross-validation dengan teknik leave-one-out.
D. Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah standar kerja
parasetamol yang diperoleh dari PT. Combiphar Indonesia, baku guaifenesin dan
klorfeniramin maleat yang diperoleh dari PT. Konimex dengan Certificate of Analysis
(sebagaimana dalam lampiran 1-3), akuades, metanol teknis, sediaan sirup dengan
merk paten produksi perusahaan farmasi Indonesia dibeli dari apotek di Yogyakarta.
Komposisi zat aktif dalam sampel sediaan farmasi sirup terdiri atas parasetamol,
guaifenesin dan klorfeniramin maleat, dan kertas saring.
E. Alat Penelitian
Spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu) tipe UV-1800 dengan kuvet kwarsa
merk Hellma, alat sonikasi, timbangan analitik (Ohauss) tipe PAJ1003 dengan
skala 20-200 µL dan 100-1000 µL merk Socorex®, pipet volum dengan ukuran 1
mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, serta gelas-gelas yang lazim digunakan dalam
laboratorium analisis kimia yang terdapat di laboratorium di Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma.
F. Tata Cara Penelitian
Penelitian ini merupakan proses penetapan kadar parasetamol, guaifenesin
dan klorfeniramin maleat dalam sediaan sampel sirup dengan metode kombinasi
spektrofotometri UV-kalibrasi multivariat tanpa tahap pemisahan. Analisis secara
spektrofotometri UV-kalibrasi multivariat dilakukan dengan cara:
1. Scanning spektra standar
Scanning standar dilakukan dengan membuat standar parasetamol,
guaifenesin dan klorfeniramin maleat dengan konsentrasi 5 µg/mL dan dilakukan
scanning spketra pada panjang gelombang 220-400 nm.
2. Pemilihan interval dan panjang gelombang pengukuran untuk set kalibrasi
a. Dilakukan pengamatan spektra dari hasil pengukuran campuran standar
parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat. Kemudian dipilih rentang
panjang gelombang saat campuran senyawa mulai memberikan serapan sampai
campuran memberikan serapan mendekati nilai 0.
b. Rentang panjang gelombang yang dipilih adalah 220-310 nm. Interval
pengukuran yang dipilih adalah 2 nm agar diperoleh data pengamatan dalam
3. Penyiapan larutan set kalibrasi
a. Standar parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat masing-masing
ditimbang seksama 50 mg, dimasukkan dalam labu takar 100 mL, dilarutkan
dengan pelarut akuades, disonikasi selama 15 menit, dan ditambahkan dengan
pelarut sampai batas tanda.
b. Dibuat 20 larutan model kalibrasi dengan cara setiap larutan standar intermediet
dipipet sejumlah tertentu, dimasukkan dalam labu takar 10 mL dan diencerkan
dengan pelarut akuades hingga diperoleh kadar sesuai Tabel III untuk set
kalibrasi.
4. Pembuatan Standar Adisi CTM
a. Ditimbang seksama 50 mg baku CTM, dimasukkan dalam labu takar 50 mL dan
dilarutkan dengan sebagian pelarut akuades, diultrasonikasi selama 15 menit,
kemudian ditambahkan dengan pelarut akuades sampai batas tanda.
b. Dari larutan (a) tersebut, dipipet sebanyak 5 mL, dimasukkan dalam labu takar
50 mL, kemudian di tambahkan dengan pelarut sampai batas tanda.
5. Analisis Sampel
a. Sediaan sampel sirup dipipet 5 mL, yang setara dengan 120 mg PCT, 25 mg GG
dan 1 mg CTM, dimasukan ke dalam labu takar 50 mL, lalu dilarutkan dalam
sebagian pelarut akuades, diultrasonikasi selama 15 menit, kemudian
ditambahkan akuades sampai batas tanda.
b. Dari larutan (5a) tersebut, sejumlah 5 mL larutan diambil dan dimasukkan ke
dalam labu takar 25 mL, kemudian diencerkan dengan pelarut akuades sampai
batas tanda.
c. Dari larutan (5b) tersebut, sejumlah 1 mL larutan diambil, lalu dimasukkan ke
dalam labu takar 10 mL, dan ditambahkan dengan pelarut akuades sampai batas
tanda.
d. Dilakukan scanning dari larutan tersebut pada panjang gelombang 220-310 nm
dengan interval pengukuran sebesar 2 nm.
e. Dilakukan penetapan kadar PCT, GG dan CTM sebanyak 6 kali replikasi, dimana
5 replikasi (replikasi 2 sampai replikasi 6) dilakukan adisi dengan menggunakan
mL, 4 mL dan 5 mL. Kadar dihitung dengan metode kalibrasi multivariat partial
least square (PLS).
6. Analisis Statistik Kalibrasi Multivariat PLS a. Model Kalibrasi Multivariat PLS
1. Data konsentrasi dan absorbansi kelompok larutan kalibrasi yang disajikan
dalam kertas kerja perangkat lunak Microsoft Excel dipindahkan ke dalam
kertas kerja Minitab® 16 (trial).
2. Pengolahan data statistik partial least square (PLS) dipilih dengan
menggunakan pilihan Stat pada panel kerja Minitab 16, kemudian dipilih
regression partial least square.
3. Setelah muncul jendela baru dari program Minitab® 16, dilakukan
pembuatan model PLS parasetamol dengan cara: kolom response diisi
dengan pilihan variabel konsentrasi PCT dan kolom model dipilih variabel
absorbansi pada panjang gelombang 220-310 nm. Untuk pembuatan model
PLS guaifenesin dibuat dengan cara: kolom response diisi dengan pilihan
variabel konsentrasi GG dan kolom model dipilih variabel absorbansi pada
panjang gelombang 220-310 nm. Untuk pembuatan model PLS klorfeniramin
maleat dibuat dengan cara: kolom response diisi dengan pilihan variabel
konsentrasi CTM dan kolom model dipilih variabel absorbansi pada panjang
gelombang 220-310 nm.
4. Diperoleh nilai terhitung dan nilai sebenarnya dari model kalibrasi
tersebut kemudian dipindahkan ke dalam kertas kerja perangkat lunak
Microsoft Excel.
5. R2 didapat dari hubungan korelasi atau kedekatan nilai antara nilai
sebenarnya (sumbu X) dengan nilai terhitung (sumbu Y).
6. RMSEC dapat dihitung menggunakan rumus ( − )
2
−1 yang mana x adalah
nilai sebenarnya (actual), y adalah nilai terhitung (calculated), dan n adalah
banyaknya data konsentrasi yang dirandomisasi, yaitu 20.
b. Cross Validation Leave-one-out
1. Data dipindahkan dari kertas kerja perangkat lunak Microsoft Excel ke dalam
kertas kerja Minitab® 16.
2. Dipilih model kalibrasi PLS dengan menekan pilihan stat pada panel kerja,
kemudian dipilih regression partial least square.
3. Proses validasi model kalibrasi dilakukan dengan memasukkan variabel
konsentrasi PCT ke dalam response dan variabel absorbansi ke dalam kolom
model. Kemudian tekan tombol option yang selanjutnya ditentukan tambahan
proses leave-one-one. Perlakuan sama diberlakukan untuk proses validasi GG
dan CTM.
4. Diperoleh nilai sebenarnya dan nilai terhitung, serta nilai PRESS dari tahap
validasi internal dan selanjutnya dipindahkan ke dalam kertas kerja perangkat
5. Akurasi dan presisi model kalibrasi ditinjau dari nilai R2 dan nilai RMSECV
dengan membuat hubungan linier antara nilai sebenarnya dan nilai terhitung.
Diperoleh persamaan regresi linier y = bx+a hubungan antara nilai
sebenarnya dan terhitung yang nantinya akan digunakan untuk memperoleh
nilai RMSECV.
7. Analisis data sampel
a. Akurasi dan presisi model kalibrasi multivariat parasetamol, guaifenesin dan
klorfeniramin maleat dinyatakan secara statistik dengan nilai R2, RMSEC,
RMSECV, RMSEP dan PRESS.
b. Konsentrasi sampel dihitung dengan memasukkan koefisien dari masing-masing
model untuk senyawa parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat sesuai
dengan rumus:
�= 1�1+ 2�2+⋯+ � + �
Keterangan :
X = Konsentrasi terhitung sampel (µg/mL)
ts = Koefisien dari model kalibrasi
� = Absorbansi dari masing-masing pengukuran sampel
� = Koreksi kesalahan yang mungkin terjadi pada model kalibrasi
PLS
c. Kadar sampel dihitung dengan menggunakan rumus : Faktor Pengenceran x
d. Akurasi proses penetapan kadar ditetapkan dengan persen perolehan kembali
dengan rentang yang dapat diterima menurut Wood (1998) adalah sebesar
90-107%.
e. Presisi proses penetapan kadar ditetapkan dengan nilai RSD dengan nilai
maksimal yang masih dapat diterima menurut Gonzales dan Herrador (2007)
adalah sebesar 8%.
Analisis kalibrasi multivariat dilakukan dengan menggunakan perangkat
lunak Minitab® 16. Kertas kerja perangkat lunak Excel 2007 digunakan untuk
menentukan konsentrasi secara random masing–masing zat aktif dan untuk
30 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Analisis PCT, GG, dan CTM secara spektrofotometri UV dengan kombinasi kalibrasi multivariat partial least square (PLS)
Analisis senyawa multikomponen ini diawali dengan mengukur absorbansi
masing-masing larutan baku parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat.
Proses tersebut dilakukan untuk mengetahui overlapping spektra antara komponen
yang satu dengan komponen yang lainnya. Overlapping spektra UV parasetamol,
guaifenesin dan klorfeniramin maleat ditunjukkan pada Gambar 5.
Gambar 5. Overlay spektra UV parasetamol (PCT), guaifenesin (GG), klorfeniramin maleat (CTM) dan spektra UV campuran ketiga senyawa yang diukur pada λ 220-400 nm.
Spektra UV Campuran PCT, GG dan CTM
PCT
Overlapping yang terjadi merupakan salah satu kendala dalam analisis
senyawa multikomponen yang menggunakan metode spektrofotometri UV. Dengan
berkembangnya teknologi kemometrika, permasalahan overlapping yang terjadi
dalam proses analisis sediaan multikomponen yang menggunakan metode
spektrofotometri UV dapat diatasi. Oleh karena itu, metode kemometrika yang
digunakan dalam penelitian ini adalah metode kalibrasi multivariat partial least
square (PLS). Pemilihan metode kalibrasi multivariat partial least square (PLS)
didasarkan pada kelebihan metode ini yang mampu memprediksi dengan cara yang
lebih baik ketika terdapat spektra yang tumpang tindih satu sama lain (Sohrabi et al.,
2009).
Tahap selanjutnya dalam analisis ini adalah melakukan pengecekkan profil
spektra UV sampel dengan spektra UV campuran sintetik baku, yang mana hasil yang
diharapkan dari pembandingan antara kedua spektra UV tersebut adalah adanya profil
spektra UV yang mirip. Tujuan dilakukannya pengecekkan ini adalah untuk melihat
apakah terdapat eksipien atau bahan tambahan yang turut memberikan serapan dalam
kisaran panjang gelombang tersebut. Hasil yang diperoleh ditunjukkan pada Gambar
6, yang mana terlihat bahwa spektrum UV campuran sintetik baku dengan spektrum
UV sampel sediaan farmasi memiliki kemiripan, dimana parameter kemiripan
ditentukan secara visual. Akan tetapi, dari profil spektrum tersebut, mengindikasikan
ketidakstabilan pengukuran. Sebab, dilihat dari absorbansi yang dihasilkan,
khususnya pada CTM dan GG, absorbansi yang dihasilkan rendah, sehingga hasil
itu, dapat simpulkan bahwa hasil yang diperoleh kurang memuaskan karena adanya
pengaruh dari noise mengingat rendahnya absorbansi yang dihasilkan.
Gambar 6. Overlay spektrum UV sampel sediaan farmasi (sirup) dan spektrum UV campuran baku parasetamol (PCT), guaifenesin (GG) dan klorfeniramin maleat (CTM) yang diukur pada λ 220-310 nm.
Setelah konfirmasi spektrum UV campuran dan spektrum UV sampel
dilakukan, tahap selanjutnya adalah dengan membuat pemodelan kalibrasi, yakni
dengan menggunakan 20 set larutan kalibrasi yang dihasilkan dari proses randomisasi
yang dapat dilihat pada Tabel I. Sebanyak 20 set larutan kalibrasi tersebut diukur
menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 220-310 nm dengan
interval 2 nm untuk memperoleh data absorbansi dari 20 campuran sintetik tersebut.
Gambar 7 menunjukkan overlay spektra dari 20 campuran sintetik baku untuk model
kalibrasi.
Spektra sampel sediaan farmasi (sirup)
Gambar 7. Overlay spektra UV campuran baku parasetamol (PCT), guaifenesin (GG) dan klorfeniramin maleat (CTM) yang diukur pada λ 220-310 nm.
Pemilihan panjang gelombang pada PLS bertujuan agar data yang dihasilkan
lebih informatif dan kinerja model yang lebih optimum (El Gindy,2006). Setelah
dilakukan optimasi panjang gelombang, akhirnya dipilih panjang gelombang 220-310
nm untuk dianalisis. Data absorbansi yang diperoleh kemudian diolah dengan
menggunakan perangkat lunak Minitab® 16.0 dan menghasilkan model kalibrasi
Tabel IV. Nilai konsentrasi sebenarnya (Actual Response) vs Konsentrasi terhitung (Calculated Response) dari calibration set yang mengandung parasetamol (PCT), guaifenesin (GG) dan klorfeniramin maleat (CTM) tanpa validasi silang (cross validation) pada λ 220-310 nm.
No Camp.
Konsentrasi (µg/ml)
PCT GG CTM
Sebenarnya Terhitung Sebenarnya Terhitung Sebenarnya Terhitung
1 5,0 4,9004 3,0 2,9609 9,0 9,0121
Nilai sebenarnya merupakan nilai konsentrasi yang dibuat berdasarkan hasil
randomisasi menggunakan Microsoft Excel 2007, sedangkan nilai terhitung
menggunakan model PLS tanpa validasi silang (cross validation). Nilai sebenarnya
dan nilai terhitung kemudian dikorelasikan, untuk menentukan nilai R2 dan nilai
RMSEC. Diperoleh persamaan y = 0,994x + 0,042 untuk PCT, y = 0,999x + 0,004
untuk GG dan y = 0,999x + 0,002 untuk CTM. Nilai R2 yang diperoleh adalah 0,994
untuk PCT, 0,999 untuk GG dan 0,999 untuk CTM. Sedangkan nilai RMSEC (Root
Mean Square Error of Calibration) yang diperoleh adalah 0,289 untuk PCT, 0,099
untuk GG dan 0,078 untuk CTM.
Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa model kalibrasi tersebut
memiliki korelasi antara nilai aktual dengan nilai prediksi yang baik, yang mana
ketiga komponen tersebut memiliki nilai RMSEC yang mendekati 0 dan R2 yang
mendekati 1. Parameter R2 mempunyai nilai antara 0-1, yang mana nilai R2
mendekati 1 menunjukkan bahwa kemampuan memprediksi semakin baik karena
semua variasi variabel respon (absorbansi) dapat diterangkan oleh variabel prediktor
sehingga nilai terprediksi mendekati nilai aktual (Minitab Statistical Glossary, 2010).
RMSEC menunjukkan selisih nilai terhitung dengan nilai sebenarnya sehingga jika
nilai RMSEC-nya semakin kecil maka model kalibrasi tersebut dapat dikatakan
semakin baik karena faktor kesalahannya yang semakin kecil (Pindyck and
Rubinfeld, 1998). Dari data yang diperoleh pada Tabel IV tersebut, kurva hubungan
antara nilai sebenarnya (actual response) dengan nilai terhitung (calculated response)
Actual Response terhitung (calculated response) parasetamol (PCT) dengan metode spektrofotometri UV-PLS pada λ 220-310 nm.
A ctual Response terhitung (calculated response) klorfeniramin maleat (CTM) dengan metode spektrofotometri UV-PLS pada λ 220-310 nm.
B. Validasi model kalibrasi multivariat partial least square (PLS)
Proses pemodelan dengan menggunakan kalibrasi multivariat PLS dalam
memprediksi suatu data perlu divalidasi, agar hasil yang diperoleh dapat
dipertanggungjawabkan, dan dapat mengatasi kelemahan dari kalibrasi multivariat
PLS itu sendiri. Salah satu kelemahan dari model kalibrasi multivariat PLS adalah
terjadinya over-fitting. Untuk mengatasi terjadinya over-fitting selama pemodelan,
dengan melakukan proses validasi internal, yang mana validasi internal merupakan
metode validasi silang (cross validation) yang menggunakan teknik leave-one-out.
Dalam teknik ini, salah satu sampel kalibrasi dikeluarkan dari model PLS dan sisa
sampel yang ada digunakan untuk pemodelan dengan PLS untuk menghitung nilai
terprediksi sampel kalibrasi yang dikeluarkan. Sampel yang dihilangkan selanjutnya
berulang kali, menghilangkan satu demi satu sampel kalibrasi hingga didapatkan
harga R2 yang sesuai dengan yang diinginkan (Rohman and Che Man, 2011). Hasil
dari proses validasi silang menggunakan teknik leave-one-out dengan data nilai
sebenarnya dan nilai terhitung dapat dilihat pada Tabel V.
Tabel V. Nilai sebenarnya vs nilai terhitung hasil kalibrasi PLS yang mengandung parasetamol (PCT), guaifenesin (GG) dan klorfeniramin maleat (CTM) validasi silang (cross validation) pada λ 220-310 nm.
No Camp.
Konsentrasi (µg/ml)
PCT GG CTM
Sebenarnya Terhitung Sebenarnya Terhitung Sebenarnya Terhitung 1 4,5508 4,4121 2,8147 2,7861 9,0241 9,0225
mean square error of cross validation). Nilai PRESS (predicted error sum of square)
adalah nilai yang menunjukkan kesalahan prediksi saat proses pemodelan, dan
merupakan bagian dari validasi untuk model kalibrasi multivariat PLS. Nilai R2 dan
RMSECV dapat ditentukan dengan mengkorelasikan nilai sebenarnya dan nilai
terhitung. Selama validasi internal, diperoleh persamaan y = 0,997x + 0,017 untuk
PCT, y = 0,996x + 0,036 untuk GG dan y = 1,006x – 0,044 untuk CTM. Nilai R2
yang diperoleh adalah 0,999 untuk PCT, 0,999 untuk GG dan 0,998 untuk CTM.
Sedangkan nilai RMSECV yang diperoleh untuk PCT, GG dan CTM masing-masing
sebesar 0,116, 0,084 dan 0,219. Nilai PRESS merupakan salah satu indikator
kebaikan model yang menggambarkan kemampuan prediksi. Semakin rendah nilai
PRESS maka kemampuan model untuk memprediksi semakin baik (Rohman and Che
Man, 2011). Hasil korelasi nilai sebenarnya dan nilai terhitung untuk validasi silang
menggunakan teknik leave-one-out dapat dilihat pada Tabel VI.
Tabel VI. Hasil persamaan, R2, RMSECV dan PRESS yang diperoleh dari hubungan antara nilai sebenarnya dan nilai terhitung validasi silang (cross validation) pada λ 220-310 nm.
PCT GG CTM
Persamaan y = 0,997x + 0,017 y = 0,996x + 0,036 y = 1,006x – 0,044
R2 0,999 0,999 0,998
RMSECV 0,116 0,084 0,219
PRESS 4,815 1,764 1,996
Dari hasil yang diperoleh pada Tabel VI, dapat disimpulkan bahwa
kemampuan model kalibrasi multivariat PLS untuk memprediksi semakin baik, sebab
nilai koefisien determinasi (R2) yang dihasilkan mendekati nilai 1, nilai RMSECV
model multivariat PLS, maka model ini nantinya dapat digunakan untuk tahap
selanjutnya yakni pada proses penetapan kadar sampel. Data dan parameter hasil
validasi silang leave one-out PCT, GG dan CTM dapat dilihat pada Gambar 11, 12
dan 13, serta kurva hubungan antara nilai sebenarnya dan nilai terhitung validasi
silang dengan teknik leave-one-out sebagaimana pada Gambar 14, 15 dan 16.
PLS Regression: PCT versus WL220.0, WL222.0, WL224.0, WL226.0, WL228.0, ...
Number of components selected by cross-validation: 3 Number of observations left out per group: 1
