BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
D. Tata Cara Penelitian
Identifikasi tanaman binahong dilakukan oleh Balai Penelitian Tanaman Obat (BPTO) Tawangmangu.
2. Pengumpulan bahan dan pengeringan
Daun binahong yang diperoleh dari kebun Balai Penelitian Tanaman Obat (BPTO) Tawangmangu berupa simplisia kering.
3. Pembuatan serbuk
Pembuatan serbuk dilakukan dengan menggunakan blender kering sampai diperoleh serbuk halus. Kemudian dilakukan pengayakan dengan menggunakan pengayak berukuran 12/50 sampai semua serbuk dapat melewati ayakan.
4. Uji tabung a. Uji pendahuluan
Dua gram serbuk daun binahong dipanaskan dengan 10 ml air selama 30 menit di atas air mendidih. Larutan yang diperoleh disaring melalui kapas. Jika larutan menjadi berwarna kuning sampai merah dan bila pada saat penambahan kalium hidroksida warna larutan menjadi lebih intensif berarti menunjukkan adanya senyawa yang mengandung kromofor dengan gugus hidrofilik.
b. Uji alkaloid
Dua gram serbuk daun binahong dipanaskan dalam tabung reaksi dengan 10 ml asam klorida 1% selama 30 menit. Suspensi disaring dengan kapas ke dalam tabung reaksi A dan B sama banyak, larutan A dibagi dua sama banyak, lalu ke dalam larutan A1 ditambah 3 tetes pereaksi Dragendroff dan larutan A2
27
ditambah 3 tetes pereaksi Mayer. Bila terbentuk endapan dengan kedua pereaksi alkaloid berarti menunjukkan adanya alkaloid. Adanya alkaloid dari basa tertier dan kuartener ditunjukkan dengan penambahan serbuk natrium karbonat sampai pH 8-9, dicampur dengan 4 ml kloroform dan diaduk pelan. Setelah kloroform memisah, diambil dengan pipet Pasteur, ditambahkan asam cuka 5% hingga pH 5. diaduk lalu dipisahkan lapisan atasnya, tambah 5 tetes pereaksi Dragendroff pada lapisan atas, bila terbentuk endapan menunjukkan alkaloid dari basa kuartener. Lapisan bawah ditambah 10 tetes asam klorida 1% diaduk dan dipisahkan lapisan atas serta ditambah 2 tetes pereaksi Dragendroff. Bila didapatkan endapan berarti menunjukkan alkaloid dari basa tertier.
c. Uji antrakinon
Tiga ratus miligram serbuk daun binahong dididihkan 2 menit dengan 10 ml kalium hidroksida 0,5 N dan 1 ml larutan hidrogen peroksida, setelah dingin suspensi disaring melalui kapas. Lima ml filtrat ditambah 10 tetes asam asetat sampai pH 5, ditambahkan 10 ml toluen. Lima ml lapisan atas dipisahkan dengan dipipet dan dimasukkan dalam tabung reaksi. Ditambah kalium hidroksida 0,5 N, bila didapatkan warna merah pada lapisan air berarti menunjukkan adanya senyawa antrakinon.
d. Uji polifenol
Dua gram serbuk daun binahong dipanaskan dengan 10 ml air selama 10 menit dalam pengangas air mendidih. Disaring panas-panas, setelah dingin ditambah 3 tetes pereaksi besi (III) klorida. Bila didapatkan warna hijau-biru
menunjukkan adanya polifenol. Uji diulang dengan filtrat hasil pendidihan 2 g serbuk dengan 9-10 ml etanol 80% selama 10 menit dalam pengangas air.
e. Uji tanin
Dua gram serbuk daun binahong dipanaskan dengan 10 ml air selama 30 menit di atas penangas air. Disaring 5 ml filtrat ditambah 1 ml larutan NaCl 2%, bila terjadi suspensi atau endapan disaring melalui kertas saring. Filtrat ditambah 5 ml larutan gelatin 1%. Bila terbentuk endapan menunjukkan adanya tanin. f. Uji saponin
1) Tambahkan 10 ml air suling ke dalam tabung reaksi yang berisi 100 mg serbuk daun binahong, ditutup dan dikocok kuat-kuat selama 30 detik. Tabung dibiarkan dalam posisi tegak selama 30 menit. Apabila terbentuk buih setinggi kurang lebih 3 cm dari permukaan cairan, menunjukkan adanya saponin.
2) Uji lain dilakukan dengan pipa kapiler (diameter 1 mm, panjang 12,5 cm). Larutan hasil pemanasan 2 g serbuk daun binahong dengan 10 ml air dipanaskan selama 30 menit di atas penangas air. Setelah disaring, filtrat dimasukkan ke dalam pipa kapiler penuh-penuh. Kapiler diletakkan dalam posisi tegak, lalu cairan dibiarkan mengalir bebas. Tinggi air suling yang diperlakukan sama. Bila didapatkan tinggi cairan yang diuji setengah atau kurang dari tinggi air suling maka menunjukkan adanya saponin. 5. Pembuatan ekstrak polar daun binahong
Sebanyak 150 g serbuk daun binahong dimaserasi dengan 1125 ml kloroform selama 24 jam dalam Erlenmeyer ditutup alumunium foil dan dilakukan
29
dengan platform shaker. Hasil penyarian disaring dengan corong dan ampas dari hasil penyarian ini dikeringkan dengan diangin-anginkan agar sisa kloroform menguap. Ampas kemudian dimaserasi dengan 3500 ml etanol 70% selama 3 x 24 jam dalam Erlenmeyer ditutup aluminium foil. Setelah disaring, maserat diuapkan dengan rotaevaporator hingga pekat. Maserat pekat kemudian diuapkan lagi di oven hingga diperoleh ekstrak kental.
6. Pembuatan sampel untuk KLT
Pembuatan sampel untuk KLT dengan konsentrasi 10% dilakukan dengan melarutkan 0,5 g serbuk daun binahong dalam 5 ml etanol 70%.
7. Identifikasi kualitatif senyawa ekstrak polar daun binahong dengan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
a. Uji KLT alkaloid
Fase diam yang digunakan adalah silika gel GF 254 dan fase gerak etil asetat: metanol: air (70:20:10). Sebagai pembanding digunakan skopolamin. Sampel dan pembanding ditotolkan bersama-sama pada lempeng KLT, kemudian dielusi dengan jarak 10 cm. Setelah itu dideteksi di bawah sinar UV 254 dan 365 nm, kemudian dideteksi dengan pereaksi semprot Dragendorff.
b. Uji KLT senyawa fenolik
Fase diam yang digunakan yaitu silika gel GF 254 dengan fase gerak toluen: etil asetat: metanol (70:20:10). Pembanding yang digunakan yaitu eugenol. Sampel dan pembanding ditotolkan bersama-sama kemudian dielusi dengan jarak 10 cm. Deteksi dilakukan di bawah sinar UV 254 nm dan pereaksi semprot besi (III) klorida.
c. Uji KLT flavonoid
Fase diam yang digunakan yaitu selulosa dengan fase gerak butanol: asam asetat glasial: air (4:1:5). Pembanding yang digunakan yaitu rutin. Sampel dan pembanding ditotolkan pada lempeng KLT dengan jarak elusi 10 cm. Setelah itu dideteksi dengan sinar UV 254 nm, UV 365 nm dan uap amonia.
e. Uji KLT tanin
Fase diam yang digunakan yaitu silika gel GF 254 dengan fase gerak etil asetat: metanol: air (100: 13,5: 10). Pembanding yang digunakan yaitu asam tanat 1%. Sampel dan pembanding ditotolkan pada lempeng KLT dengan jarak elusi 10 cm. Setelah itu dideteksi dengan sinar UV 254 nm, 365 nm, dan pereaksi semprot besi (III) klorida.
8. Uji potensi ekstrak polar daun binahong terhadap B. subtilis dan P. aeruginosa dengan metode difusi paper disk
a. Pembuatan konsentrasi larutan uji
Ekstrak polar daun binahong dengan konsentrasi 75%, 50%, dan 25% dibuat dengan mengencerkan ekstrak konsentrasi 100%, sampai kadar yang diinginkan dalam volume 5 ml. Pembuatan konsentrasi 100% dilakukan dengan menimbang 10 g ekstrak kental kemudian dilarutkan dalam 10 ml CMC 1%. Tabel I. Pembuatan variasi konsentrasi ekstrak polar daun binahong
Konsentrasi (%)
Volume larutan uji yang diambil dari ekstrak 100% (ml) Volume CMC 1% (ml) Volume pengenceran (ml) 100% 5,00 - 5 75% 3,75 1,25 5 50% 3,33 1,67 5 25% 2,50 2,50 5
31
Sebagai kontrol negatif digunakan larutan CMC 1% dan kontrol positif amoksisilin (0,03 g/1ml).
b. Persiapan stok bakteri uji
Diambil 1 ose bakteri dari biakan murni B. subtilis dan P. aeruginosa, kemudian masing-masing ditanam pada media nutrien agar miring, lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37˚C.
c. Pembuatan suspensi bakteri uji B. subtilis dan P. aeruginosa
Beberapa ose bakteri uji dari stok bakteri, kemudian diinokulasikan pada 2 ml media nutrien broth steril yang telah diinkubasi selama 24 jam suhu 37˚C, homogenkan dengan vortex, kemudian disesuaikan kekeruhannya dengan standar Mc. Farland II (6x 108 CFU/ml). Suspensi bakteri yang diperoleh telah siap diinokulasikan ke dalam media nutrien agar yang steril.
d. Pembiakan suspensi B. subtilis dan P. aeruginosa secara spread plate
Diambil 0,2 ml bakteri dari suspensi bakteri uji yang telah setara dengan larutan standar Mc. Farland II (6 x 108 CFU/ml), kemudian diinokulasikan secara spread plate ke dalam cawan petri yang berisi 20 ml media nutrien agar steril yang telah memadat.
e. Pengujian potensi antibakteri
Pengujian potensi antibakteri ekstrak polar daun binahong dilakukan dengan metode difusi paper disk. Ke dalam media padat yang telah berisi bakteri diberi paper disk. Setelah itu, kedalam paper disk ditetesi dengan seri konsentrasi senyawa uji sebanyak 20µl, sebagai kontrol positif digunakan amoksisilin dan kontrol negatif digunakan CMC 1% masing- masing sebanyak 20 µl, lalu
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37ºC. Diukur diameter zona hambatnya menggunakan penggaris.
f. Pengujian potensi antibakteri dengan metode dilusi padat
Pada Erlenmeyer yang berisi 20 ml media nutrien agar steril dimasukkan 0,2 ml suspensi bakteri uji, kemudian tambahkan pula 1 ml larutan uji, campur dengan vortex. Masukkan campuran tersebut dalam cawan petri steril secara pour plate. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37ºC. Diamati pertumbuhan bakteri yang terjadi dengan melihat kekeruhan yang dibandingkan dengan kontrol pertumbuhan bakteri. Pada hasil inkubasi yang jernih diambil satu ose dan ditanam secara streak plate pada media padat steril dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37º C kemudian diamati pertumbuhan bakteri sampai didapatkan nilai KHM dan KBM.