BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
D. Tata Cara Penelitian
1. Penetapan Kadar Polifenol dalam Ektrak Kering Teh Hijau
a) Pembuatan Larutan Stok Kuersetin 1 mg/ml
Kuersetin standar ditimbang kurang lebih seksama 0,05 g, kemudian dilarutkan dengan aseton 75% dalam labu ukur 50,0 ml dan diencerkan hingga tanda.
b) Penetapan Operating Time
Larutan stok kuersetin diambil sebanyak 4,00 ml, dimasukkan dalam labu ukur 10ml, lalu diencerkan dengan aseton 75% hingga tanda. Kemudian sebanyak 0,50 ml larutan tersebut diambil dan dimasukkan dalam labu ukur 50,0 ml yang telah ditambahkan pereaksi Folin-Ciocalteu 2N sebanyak 2,50 ml dan dibiarkan selama 2 menit. Setelah itu, ke dalam labu ukur tersebut ditambahkan 7,50 ml larutan Na2CO3 1,9M dan diencerkan dengan akuades hingga tanda. Larutan kemudian divortex dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 726 nm selama 120 menit.
c) Penetapan Panjang Gelombang Maksimum
Larutan stok kuersetin diambil sebanyak 4,00 ml, dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 ml, lalu diencerkan dengan aseton 75% hingga tanda. Kemudian sebanyak 0,50 ml larutan tersebut diambil dan dimasukkan dalam labu ukur 50,0 ml yang telah ditambahkan pereaksi Folin-Ciocalteu 2N sebanyak 2,50 ml dan
larutan dibiarkan selama 2 menit. Setelah itu, ke dalam labu ukur tersebut ditambahkan 7,50 ml larutan Na2CO3 1,9M dan diencerkan dengan akuades hingga tanda. Larutan tersebut kemudian divortex dan diinkubasi selama OT, lalu disentrifuse dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 600-800 nm.
d) Pembuatan dan Penetapan Kurva Baku
Kuersetin standar ditimbang kurang lebih seksama 0,05 g dilarutkan dengan aseton 75% pada labu ukur 50,0 ml, lalu diencerkan hingga tanda. Dari larutan stok terebut, kemudian dibuat seri konsetrasi kuersetin 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; dan 0,6 mg/ml, dengan pengenceran menggunakan aseton 75%. Kemudian dari masing-masing seri konsentrasi diambil 0,50 ml dan dimasukkan dalam labu ukur 50,0 ml yang telah ditambahkan 2,50 ml pereaksi Folin-Ciocalteu 2N, lalu dibiarkan selama 2 menit. Sebanyak 7,50 ml larutan Na2CO3 1,9M kemudian ditambahkan ke dalam labu ukur tersebut dan diencerkan dengan akuades hingga tanda. Larutan divortex dan diinkubasi selama OT, kemudian disentrifuse dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit. Setelah itu, absorbansi diukur pada panjang gelombang maksimum. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.
e) Penetapan Kadar Polifenol dalam Ekstrak Kering Teh Hijau
Sebanyak 500,0 mg ekstrak kering teh hijau dimasukkan dalam labu ukur 25,0 ml dan dilarutkan dengan aseton 75% lalu diencerkan hingga tanda. Sebanyak 1 ml larutan tersebut diambil dan dimasukkan dalam labu ukur 50,0 ml, lalu diencerkan dengan akuades hingga tanda. Ambil 0,50 ml larutan tersebut dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0 ml yang telah ditambahkan pereaksi
Folin-Ciocalteu 2N sebanyak 2,50 ml, lalu dibiarkan selama 2 menit. Kemudian ke dalam labu ukur tersebut ditambahkan 7,50 ml larutan Na2CO3 1,9M dan diencerkan dengan akuades hingga tanda. Larutan kemudian divortex dan diinkubasi selama OT, lalu disentrifuse dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit. Larutan tersebut kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum. Replikasi dilakukan sebanyak 6 kali. Kadar polifenol dalam sampel dihitung dengan menggunakan persaman kurva baku sehingga diperoleh konsentrasi polifenol yang terhitung ekuivalen terhadap kuersetin.
2. Penetapan Kadar SPF secara in vitro
a) Pembuatan larutan stok polifenol teh hijau 30 mg%
Serbuk ekstrak kering teh hijau ditimbang setara dengan 30 mg polifenol teh hijau, kemudian dimasukkan dalam labu ukur 50,0 ml dan diencerkan dengan etanol 90% hingga tanda.
b) Penentuan spektra UV ekstrak kering teh hijau
Larutan stok polifenol diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan dalam labu ukur 10,0 ml, kemudian diencerkan dengan etanol 90% hingga tanda. Spektra UV diperoleh dengan scanning absorbansi larutan pada panjang gelombang antara 250-400 nm.
c) Penentuan nilai SPF
Larutan stok polifenol kemudian diambil masing-masing 2,0; 4,0; dan 6,0 ml, kemudian diencerkan dengan etanol 90% hingga tanda dalam labu ukur 10,0 ml. replikasi dilakukan 3 kali untuk setiap konsentrasi.
Absorbansi masing-masing konsentrasi diukur setiap 5 nm pada rentang panjang gelombang 290 hingga panjang gelombang tertentu di atas 290 nm yang mempunyai nilai serapan kurang dari 0,05. Dari hasil tersebut, kemudian dibuat kurva antara nilai absorbansi terhadap panjang gelombang. Luas daerah di bawah kurva (AUC) antara dua panjang gelombang yang berurutan dihitung dengan rumus :
AUC = − + 2 − −
Keterangan :
Ap = absorbansi pada panjang gelombang yang lebih tinggi di antara 2 panjang gelombang yang berurutan
A(p-a) = absorbansi pada panjang gelombang yang lebih rendah di antara dua panjang gelombang yang berurutan
λp = panjang gelombang yang lebih tinggi di antara dua panjang gelombang berurutan
λ(p-a) = panjang gelombang yang lebih rendah di antara dua panjang
gelombang berurutan
Seluruh luas daerah di bawah kurva absorbansi dapat dihitung dengan menjumlahkan semua harga AUC. Nilai SPF dihitung dengan rumus :
Log SPF = λn − λ1AUC Keterangan :
N = panjang gelombang terbesar di antara panjang gelombang 290 nm hingga di atas 290 nm yang mempunyai nilai absorbansi 0,05
l = panjang gelombang terkecil (290 nm)
3. Optimasi Proses Pencampuran Suhu dan Lama Pencampuran
a) Formula Krim Sunscreen
Formula Standar (Michael, 1977) :
Asam stearat 10,0 Mineral oil 6,0 Petrolatum 4,0 Lanolin 2,0 Castor oil 1,0 Setil alkohol 1,0 Arlacel 60 2,0 Tween 60 1,0 Gliserin 1,0 TEA 0,6 Akuades 71,4 Pengawet q.s.
Dari formula tersebut, dilakukan modifikasi : Fase minyak Asam stearat 10 g
VCO 10 g
Setil alkohol 2 g
Span 80 2 g
Tween 80 3 g
Fase air Gliserin 2 g
TEA 0,6 g
Asam sitrat 0,35 g Metil paraben 0,2 g
Akuades 40,0 ml
Polifenol teh hijau 11,2048 mg (terhitung ekivalen terhadap kuersetin)
Perfume q.s
b) Pembuatan Krim Sunscreen
Tabel IV. Percobaan desain faktorial
Suhu pencampuran (oC) Lama pencampuran (menit)
(1) 45 10
a 65 10
b 45 20
Asam stearat dan setil alkohol masing-masing dilelehkan di atas waterbath pada suhu 70oC. Setelah meleleh, kedua bahan tersebut kemudian dicampurkan dan ditambahkan VCO, span 80, dan tween 80, sebagai campuran fase minyak. Campuran tersebut dipanaskan di atas waterbath pada suhu 70oC. Sedangkan fase air, yaitu metil paraben, gliserin, TEA dan 2/3 bagian akuades juga dipanaskan di atas waterbath pada suhu 70oC. Fase air kemudian dituang ke dalam wadah pencampuran, lalu fase minyak segera dituang ke dalam wadah tersebut. Kedua fase tersebut dicampurkan dengan menggunakan mixer pada kecepatan 400 rpm selama (10–20 menit) pada suhu (45oC–65oC). Setelah terbentuk massa krim, wadah pencampuran kemudian dipindahkan dari waterbath dan dimasukkan dalam wadah yang sudah diisi air. Kemudian proses dilanjutkan dengan penambahan asam sitrat yang dilarutkan dalam akuades sedikit demi sedikit sambil terus diaduk. Setelah itu, ditambahkan ekstrak teh hijau yang sebelumnya telah dilarutkan dalam sisa akuades dan terakhir ditambahkan beberapa tetes perfume secukupnya. Formula pada tiap perlakuan dibuat 3 kali replikasi.
4. Pengujian tipe krim sunscreen a) Metode warna
Sebanyak 0,5 g krim sunscreen dimasukkan ke dalam Beaker glass dan diencerkan dengan 2 ml akuades. Campuran diaduk kemudian ditambah 2 tetes
menunjukkan fase air sedangkan bagian yang tidak berwarna merupakan fase minyak.
b) Metode pengenceran
Metode ini dilakukan dengan memberi sedikit air pada sejumlah krim, kemudian digojog. Jika setelah penggojogan diperoleh suatu emulsi homogen, maka terdapat jenis M/A, sedangkan pada emulsi tipe A/M diperoleh hasil kebalikannya.
5. Uji Daya Sebar Krim
Uji daya sebar dilakukan 48 jam setelah pembuatan dengan cara : krim ditimbang seberat 1 gram, diletakkan di tengah kaca bulat berskala. Di atas krim diletakkan kaca bulat lain sebagai pemberat sehingga berat kaca bulat dan pemberat 125 gram, didiamkan selama 1 menit, kemudian dicatat penyebarannya (Garg et al., 2002). Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.
6. Uji Viskositas Krim
Pengukuran viskositas menggunakan alat Viscotester Rion-Japan seri VT 04 dengan cara : krim dimasukkan dalam wadah dan dipasang pada portable viscotester. Viskositas krim diketahui dengan mengamati gerakan jarum penunjuk viskositas (Instruction Manual Viscotester VT-04E). Uji ini dilakukan 2 kali, yaitu 48 jam setelah krim dibuat dan setelah disimpan selama 1 bulan. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.
7. Uji Mikromeritik
Sejumlah krim dioleskan pada gelas objek kemudian diletakkan di atas meja benda pada mikroskop. Ukuran droplet yang terdispersi pada krim kemudian diamati. Perbesaran lemah digunakan untuk menentukan objek yang akan diamati kemudian diganti dengan perbesaran kuat. Lalu dicatat diameter terjauh dari tiap droplet sejumlah 500 droplet (Martin, Swarbick, dan Cammarata, 1993).
8. Uji index creaming
Dilakukan dengan menghitung rasio volume emulsi yang memisah dibanding volume total emulsi (Aulton, 2002).