BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
D. Tata Cara Penelitian
Determinasi dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta sesuai dengan buku acuan (Backer dan Van den Brink, 1965) hingga ke tingkat spesies.
2. Pengumpulan bahan
Daun M.tanariusyang digunakan dalam penelitian ini adalah daun yang masih segar dan berwarna hijau yang berasal dari tanaman M.tanarius yang diperoleh dari Kebun Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
3. Pembuatan simplisia daun M. tanarius
Daun M.tanarius yang telah terkumpul kemudian dicuci dengan air mengalir, ditiriskan kemudian dikeringkan dengan menggunakan oven pada suhu 45-50°C selama 24 jam dan diserbuk dengan menggunakan mesin penyerbuk. Serbuk simplisia kemudian diayak dengan menggunakan ayakan nomor 40.
4. Pembuatan infusa daun M.tanarius 50,0 % (b/v)
Infusa daun M.tanarius dengan konsentrasi 50,0 % (b/v) dibuat dengan mencampur 50,0 gram serbuk kering daun M.tanarius dengan 100 ml aquadest. Campuran ini kemudian dipanaskan di atas heater pada suhu 90°C selama 15 menit. Waktu 15 menit dihitung ketika suhu pada campuran mencapai 90°C. Campuran kemudian diserkai selagi panas.
5. Perhitungan dosis pemberian M.tanarius
Dosis M.tanarius yang digunakan merupakan dosis efektif yang diperoleh berdasarkan penelitian sebelumnya, yaitu 10 mg/kgBB (Theresia, 2012).
6. Preparasi bahan
a. pembuatan larutan stok glukosa p.a. 15 % (b/v)
Glukosa monohidrat p.a. ditimbang sebanyak 1,5 gram dan dilarutkan dengan aquadestdalam labu takar 10,0 ml sampai tanda.
b. penentuan dosis glibenklamida
Dosis glibenklamida yaitu 5 mg pada manusia dengan berat badan 70 kg, dikonversikan ke tikus 200 gram dengan faktor konversi 0,018.
5 mg glibenklamida x 0,018 = 0,09 mg glibenklamida/ 200 gram = 0,45 mg glibenklamida/kg BB
Berdasarkan perhitungan maka besarnya dosis glibenklamida pada hewan uji tikus yaitu 0,45 mg/ kgBB.
c. pembuatan larutan glibenklamida 0,1125 mg/ml
Timbang serbuk glibenklamida setara dengan 25 mg glibenklamida murni, larutkan dengan aquadest dalam labu takar 10 ml sampai tanda sebagai larutan induk glibenklamida. Buat dengan konsentrasi 0,1125 mg/ml yaitu mengambil 0,45 ml larutan induk tambahkanaquadest dalam labu ukur 10 ml hingga tanda.
Perhitungan volumenya yaitu:
C1 = 25 mg/10 ml = 2,5 mg/ml ; C2 = 0,1125 mg/ml 2,5 mg/ml x V1= 10,0 ml x 0,1125 mg/ml
7. Percobaan pendahuluan
a. Penetapan waktu pemberian glibenklamida
Tujuan dari penetapan pemberian glibenklamida adalah untuk melihat pengaruh waktu pemberian terhadap efek hipoglikemik glibenklamida, agar pada saat Uji Toleransi Glukosa Oral (UTGO), glibenklamida sudah memberikan efek penurunan kadar glukosa darah. Orientasi ini menggunakan enam ekor tikus yang terbagi dalam tiga kelompok dimana masing-masing kelompok diberi perlakuan perlakuan kontrol positif dan kontrol negatif. Perlakuan tersebut dilakukan terhadap masing-masing kelompok yaitu pada menit ke-15 sebelum UTGO untuk kelompok kesatu, menit ke-30 sebelum UTGO untuk kelompok kedua, dan menit ke-45 sebelum UTGO untuk kelompok ketiga. Semua pemberian dilakukan secara peroral, selanjutnya dilakukan UTGO dengan diberikan larutan glukosa monohidrat 15,0% b/v; 1,75 g/kgBB. Pengambilan cuplikan darah dilakukan sesaat sebelum perlakuan sebagai menit ke-0 dan pada menit ke-15, 30, 45, 60, 90, 180, dan 240 setelah UTGO. Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan dengan menggunakan metode GOD-PAP. Selanjutnya, dibuat kurva UTGO dan perhitungan harga LDDK0-240. Penentuan waktu pemberian infusa daun M.tanarius didasarkan pada harga selisih LDDK0-240 kontrol positif dan negatif tertinggi.
b. Penetapan waktu pemberian infusa daun M.tanarius
Penetapan waktu pemberian infusa daun M.tanarius digunakan untuk melihat pengaruh waktu pemberian terhadap efek penurunan kadar
glukosa darah, agar pada saat dilakukan UTGO infusa daun M.tanarius sudah memberikan efek dalam menurunkan kadar glukosa darah. Orientasi ini menggunakan 3 ekor tikus yang masing-masing diberi infusa daun M.tanarius pada menit ke-15 sebelum UTGO dan bersamaan dengan UTGO. Semua pemberian dilakukan secara peroral, selanjutnya dilakukan UTGO dengan diberikan larutan glukosa monohidrat 15,0% (b/v); 1,75 g/kgBB. Pengambilan cuplikan darah dilakukan sesaat sebelum perlakuan sebagai menit ke-0 dan pada menit ke-15, 30, 45, 60, 90, 180, dan 240 setelah UTGO. Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan dengan menggunakan metode GOD-PAP. Selanjutnya, dibuat kurva UTGO dan perhitungan harga LDDK0-240. Penentuan waktu pemberian infusa daun M.tanariusdidasarkan pada harga LDDK0-240 terendah.
c. Pengelompokan dan perlakuan hewan uji
Penelitian ini mengikuti rancangan acak lengkap pola searah, yaitu 30 ekor tikus dibagi secara acak menjadi enam kelompok, masing-masing kelompok terdiri dari lima ekor. Tiap hewan uji diadaptasikan dengan kondisi yang sama, jauh dari kebisingan dan dihindarkan dari stres. Sebelum mendapat perlakuan, masing masing kelompok dipuasakan selama 18 jam dengan tetap diberi minum ad libitum, lalu diberi perlakuan sebagai berikut: 1) Kelompok I, yaitu pemberian aquadest5 ml/kg BB (kontrol negatif) 2) Kelompok II, yaitu pemberian larutan glibenklamida 0,45 mg/kgBB
3) Kelompok III, yaitu pemberian kontrol 1 infusa yaitu infusa dengan dosis 10 mg/kgBB
4) Kelompok IV, yaitu pemberian kontrol ½ infusa yaitu infusa dengan dosis 5 mg/kgBB
5) Kelompok V, yaitu pemberian kombinasi glibenklamida dan infusa daun M.tanariusdengan perbandingan dosis 1 : 1
6) Kelompok VI, yaitu pemberian kombinasi glibenklamida dan infusa daun M.tanariusdengan perbandingan dosis 1: ½ .
Semua pemberian dilakukan secara peroral, selanjutnya dilakukan UTGO dengan diberikan larutan glukosa monohidrat 15,0% (b/v); 1,75 g/kgBB.
8. Penetapan kadar glukosa darah
Kadar glukosa darah ditetapkan dengan metode GOD-PAP. Pada tiap kelompok dilakukan pengambilan cuplikan darah sebanyak 0,5 ml melalui vena lateralis ekor dan ditampung dalam microtube. Pengambilan cuplikan darah dilakukan sesaat sebelum perlakuan sebagai menit ke-0 dan pada menit ke-15, 30, 45, 60, 90, 180, dan 240 setelah UTGO. Kemudian darah geoxalated ini dipusingkan 3000 rpm selama 10 menit. Selanjutnya, diambil 0,025 ml plasma darah, kemudian dilakukan pengukuran seperti dalam Tabel II.
Tabel II. Volume pengukuran kadar glukosa darah
Bahan Sampel (ml) Standar (ml) Blangko (ml)
Supernatan 0.025 -
-Larutan baku glukosa - 0,025
-Asam benzoat 1% b/v - - 0,025
Pereaksi GOD-PAP 2,5 2,5 2,5
Bahan-bahan tersebut dicampur dan diinkubasi selama operating time. Kemudian kadar glukosa darah ditetapkan dengan alat microvitalabmenggunakan metode GOD-PAP. Selanjutnya dibuat kurva dengan mem-plot-kan nilai kadar glukosa darah lawan waktu ke-0 sampai menit ke 240 dengan metode trapezoid (LDDK0-240) dan rumus yang digunakan adalah sebagai berikut:
Keterangan:
t = waktu (jam-1/menit-1)
C = konsentrasi zat dalam darah (mg/ml)
LDDKto-tn = luas daerah di bawah kurva dari waktu ke-0 sampai ke-n