BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
a. Pemilihan sampel
Sampel yang dipilih adalah daun tanaman binahong yang dikeringkan. Sampel yang digunakan direplikasi sebanyak 3 kali dan dibuat triplo di setiap replikasinya.
b. Determinasi tanaman
Determinasi tanaman binahong dilakukan dengan panduan buku “Flora of Java” sehingga diketahui tanaman binahong termasuk dalam famili Basellaceae.
Kemudian tanaman binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) dibuat herbariumnya dalam bentuk kering meliputi akar, batang, dan daun.
c. Pengeringan sampel
Lebih kurang 100,0 gram daun segar tanaman binahong dicuci sampai bersih dengan air mengalir. Daun segar tersebut kemudian dipotong-potong dan dikeringkan dengan menggunakan oven pada suhu 60⁰C.
d. Ekstraksi sampel
Lima gram daun binahong kering ditimbang kemudian diekstraksi menggunakan digesti selama 30 menit dengan pelarut kloroform sebanyak 30,0 ml (ekstraksi I). Ekstrak kental yang didapatkan kemudian disaring dengan menggunakan kertas saring. Residu ekstraksi pertama kemudian diekstraksi kembali menggunakan refluks dengan campuran pelarut kloroform:metanol
(1:1 v/v) sebanyak 30,0 ml selama 30 menit (ekstraksi II). Ekstrak dari hasil ekstraksi II kemudian disaring menggunakan kertas saring dan dicampur dengan hasil ekstraksi I yang kemudian dilakukan evaporasi hasil ekstraksi sampai pelarut teruapkan sempurna pada suhu 70⁰C. Rendemen hasil evaporasi kemudian dilarutkan dengan metanol sampai 25,0 ml.
2. Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi a. Pembuatan larutan stok asam ursolat
Larutan stok asam ursolat dibuat dengan cara menimbang seksama sebanyak 0,01 g baku asam ursolat, kemudian dilarutkan dalam campuran kloroform-metanol 1:4 (v/v) hingga volume 10,0 ml.
b. Pembuatan larutan intermediet asam ursolat
Larutan intermediet asam ursolat dibuat dengan cara memipet 1,0 ml larutan baku asam ursolat, kemudian ditambah dengan campuran kloroform-metanol 1:4 (v/v) hingga 10,0 ml. Asam ursolat dengan konsentrasi 94,4 µg/ml ini kemudian disaring dengan millipore dan di-degassing dengan menggunakan
ultrasonicator selama 15 menit. c. Pembuatan fase gerak
Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini adalah campuran metanol dan orthophosphoric acid 1% dengan perbandingan 90:10 (v/v). Orthophosphoric acid 1% dibuat dengan melarutkan 0,58 ml orthophosphoric acid dalam 50,0 ml
aquabidest. Campuran metanol:orthophosphoric acid 1% 90:10 (v/v) ini kemudian disaring dengan penyaring Whatman anorganik dengan bantuan pompa vakum lalu di-degassing dengan menggunakan ultrasonicator selama 15 menit.
d. Pembuatan kurva baku
Larutan intermediet asam ursolat yang dibuat dengan konsentrasi 94,4 µg/ml yang sudah disaring dengan millipore dan di-degassing dengan ultrasonicator
selama 15 menit dimasukkan ke dalam tray dan dibuat seri volume injek dengan volume 2,0; 4,0; 6,0; 8,0; dan 10,0 µl, kemudian diinjek dengan kecepatan alir fase gerak yang optimum dan dideteksi pada panjang gelombang maksimum asam ursolat. Dari kromatogram dilihat AUC pada waktu retensi yang sesuai dengan waktu retensi asam ursolat. Dibuat kurva regresi linier yang menyatakan hubungan antara kadar asam ursolat vs harga AUC, kemudian ditentukan nilai koefisien korelasinya.
e. Recovery kurva baku
Satu mililiter larutan intermediet asam ursolat yang dibuat dengan konsentrasi 94,4 µg/ml ditambah dengan sampel ekstrak daun binahong hingga 10,0 ml, kemudian disaring dengan millipore dan di-degassing dengan ultrasonicator
selama 15 menit dimasukkan ke dalam tray dan dibuat seri volume injek dengan volume 2,0; 6,0; dan 10,0 µl, kemudian diinjek dengan 3 kali replikasi dengan kecepatan alir fase gerak yang optimum dan dideteksi pada panjang gelombang maksimum asam ursolat. Replikasi dilakukan sebanyak tiga kali
sehingga diperoleh 9 data. Dari kromatogram dilihat AUC pada waktu retensi sesuai dengan dengan waktu retensi asam ursolat. Kadar asam ursolat dihitung dengan memasukkan harga AUC ke persamaan kurva baku yang diperoleh. f. Analisis validitas metode KCKT
Parameter-parameter yang digunakan sebagai pedoman kesahihan suatu metode analisis antara lain:
(1)Akurasi
Akurasi metode analisis dinyatakan dengan % perolehan kembali (recovery) yang dihitung dengan cara sebagai berikut :
% recovery = x100% sebenarnya ursolat asam kadar didapat yang ursolat asam kadar
metode analisis dikatakan memiliki akurasi yang baik apabila % perolehan kembali baku asam oleanolat berada pada rentang 98-102% (Yuwono dan Indrayanto, 2005).
(2)Presisi
Presisi metode analisis dinilai berdasarkan Koefisien Variasi yang dihitung dengan cara sebagai berikut :
x100% kadar rata rata SD − = KV
metode analisis dikatakan baik jika nilai KV < 2% (Yuwanto dan Indrayanto, 2005).
(3)Linearitas
Linearitas dilihat dari harga r (koefisien korelasi) hasil pengukuran seri baku asam ursolat. Suatu metode dikatakan memiliki linearitas yang baik jika nilai r > 0,99 atau r2 > 0,997 (Chan et al.., 2004). Rentang ditentukan dari kadar asam ursolat yang digunakan dalam analisis, mulai dari kadar terkecil hingga terbesar.
(4)Limit Of Detection (LOD) dan Limit Of Quantitation (LOQ) LOD dan LOQ dapat dihitung menggunakan rumus :
LOD = b x Sy 3 LOQ = b x Sy 10
Dimana Sy merupakan simpangan baku residual yang diperoleh melalui akar dari jumlah (y-y’)2 dibagi (n-2), sedang b merupakan slope dari persamaan kurva baku.
3. Uji Kualitatif
Sebanyak 0,5 ml ekstrak daun binahong ditambah 0,5 ml baku asam ursolat dengan konsentrasi 94,4 µg/ml, kemudian ditambah dengan pelarut kloroform:metanol (1:4) v/v hingga volume 10,0 ml. Campuran ini kemudian disaring dengan menggunakan millipore dan di-degassing dengan menggunakan
ultrasonicator selama 15 menit, lalu diinjeksikan dalam sistem kromatografi cair kinerja tinggi sebanyak 20,0 µl.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A.Penyiapan fase gerak metanol:ortophosphoric acid 1% (90:10)
Fase gerak yang digunakan adalah campuran metanol dan ortophosphoric acid 1% dengan perbandingan 90:10. Pemilihan fase gerak didasarkan pada sistem kromatografi yang dipilih. Senyawa yang akan dianalisis mempunyai bobot molekul kurang dari 2000 dan larut dalam alkohol tetapi tidak larut dalam air. Oleh karena itu, dipilih sistem kromatografi partisi dalam KCKT. Pada sistem kromatografi partisi, fase diam dapat bersifat polar maupun non polar. Jika fase diam yang digunakan bersifat polar dan fase diam yang digunakan bersifat non polar, maka disebut kromatografi fase normal. Demikian sebaliknya, apabila digunakan fase diam bersifat non polar dan fase gerak yang digunakan bersifat polar, maka disebut kromatografi fase terbalik. Pada penelitian ini digunakan sistem kromatografi fase terbalik karena jika dilihat dari struktur senyawa asam ursolat merupakan senyawa yang mempunyai gugus polar, sehingga dapat digunakan kolom oktadesilsilan (ODS) yang bersifat non polar dan fase gerak yang bersifat polar. Pemilihan fase gerak yang akan digunakan ini sangat penting karena akan mempengaruhi waktu retensi dan pemisahan komponen yang akan dianalisis.
Pembuatan fase gerak terlebih dahulu dengan membuat larutan orthophosphoric acid 1%, karena ortophosphoric acid yang tersedia di laboratorium masih mempunyai konsentrasi yang tinggi, yaitu 85%. Metanol kemudian dicampur
dengan ortophosphoric acid 1% tersebut dengan perbandingan yang diinginkan (90:10). Campuran tersebut kemudian disaring dengan menggunakan penyaring Whatman anorganik dengan bantuan pompa vakum. Digunakan penyaring Whatman anorganik karena fase gerak yang digunakan bersifat polar, sehingga penyaring dapat menahan kotoran yang ada. Namun apabila digunakan penyaring yang bersifat organik, maka fase gerak yang digunakan dapat melarutkan atau melewati penyaring sehingga pori-pori penyaring menjadi besar dan akibatnya akan ada kotoran tidak dapat tersaring. Setelah disaring, fase gerak kemudian di-degassing dengan menggunakan ultrasonicator selama 15 menit. Hal ini bertujuan agar gelembung gas yang terjebak di dalam fase gerak dapat terbebas dan tidak mengganggu saat pembacaan dengan membentuk sinyal palsu.
Gugus polar asam ursolat akan berinteraksi dengan fase gerak melalui ikatan hidrogen. Semakin banyak gugus polar yang dimiliki oleh suatu senyawa, maka akan semakin banyak ikatan hidrogen yang terbentuk sehingga afinitas antara fase gerak dengan gugus polar suatu senyawa semakin besar dan akan semakin cepat terelusi karena konsentrasi linarut dalam fase gerak lebih besar.
O CH3 CH3 CH3 C CH3 CH3 O OH H H CH3 H3C H H Gambar 8. Gugus Polar Asam Ursolat
O CH3 CH3 CH3 C CH3 CH3 O OH H H CH3 H3C H H Gambar 9. Gugus Non Polar Asam Ursolat
O CH3 H CH3 C CH3 H H CH3 CH3 CH3 O O H H H OCH3 O H H OCH3 O O H CH3 H CH3 CH3 CH3 Gambar 10. Interaksi Hidrogen Antara Asam Ursolat Dengan Metanol Dalam
Fase Gerak