BAB III METODOLOGI PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Sistematika Tumbuhan,
Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada (UGM). Untuk membuktikan bahwa
tanaman yang digunakan untuk penelitian adalah tanaman senggugu
(Clerodendrum serratum L.).
2. Preparasi Ekstrak Metanol Daun Senggugu
Daun senggugu diperoleh dari Kebun Obat Universitas Sanata Dharma.
Daun senggugu dipanen pada bulan Januari 2014. Daun senggugu yang telah
dikumpulkan, kemudian dibersihkan dengan air mengalir. Setelah itu daun
senggugu dikeringkan dengan cara dijemur di bawah sinar matahari dengan
ditutup kain hitam untuk menghindari sinar matahari secara langsung.
Pengeringan daun senggugu dioptimalkan dengan dikeringkan dalam oven dengan
suhu terkontrol hingga daun sudah benar-benar kering (kadar air < 10%) dengan
ciri bila diremas bergemirisik dan berubah menjadi serpihan. Simplisia yang
kering kemudian digiling hingga menjadi serbuk halus dengan blender, kemudian
dituang dalam bejana maserasi. Kemudian ditambah metanol p.a. sebanyak 200
mL dan dicampur homogen. Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama 1
hari. Kemudian disaring dengan kertas Whatman filter dengan corong Buchner.
Hasil penyarian diuapkan pelarutnya menggunakan vaccum rotary evaporator
pada suhu 400C-500C. Hasil penyaringan filtrat diuapkan lagi dengan waterbath
hingga diperoleh ekstrak kental.
3. Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dilakukan di Laboratorium
Penelitian dan Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada (LPPT UGM).
Ekstrak kental ditimbang sebanyak 50 mg, kemudian dimasukkan ke dalam labu
dan ditambahkan 10 mL asam klorida 4 N. Larutan kemudian dihidrolisis atau
refluk dengan pendingin balik selama 30 menit, lalu didinginkan dan ekstraksi
dengan 5 mL dietileter. Fase dietileter diambil, lalu diuapkan dengan gas nitrogen.
Sampel dan pembanding rutin ditotolkan sebanyak 10 µL pada plat KLT silika gel
60 F 254 sebagai fase diam. Plat KLT kemudian dimasukkan ke dalam bejana
jenuh fase gerak butanol : asam asetat : air (3:1:1), dan dieluasikan hingga batas.
Setelah terelusi hingga batas plat dikeringkan. Hasil plat KLT yang diperoleh
diidentifikasi di bawah lampu UV (254 nm dan 366 nm) dan dideteksi dengan
4. Orientasi Kelarutan Ekstrak MetanolDaun Senggugu
Orientasi kelarutan ekstrak metanol daun senggugu dilakukan dengan
menggunakan pelarut DMSO. DMSO ditambahkan pada beberapa mg ekstrak
sampai ekstrak larut, kemudian diencerkan dengan aquabidest steril. Konsentrasi
DMSO yang digunakan adalah 0,2%.
5. Sterilisasi Alat
Alat-alat yang digunakan untuk uji antiangiogenesis dicuci bersih dan
dikeringkan kemudian dibungkus dengan kertas payung dan disterilkan dengan
pemanasan basah dalam autoklaf, suhu 121oC selama 15-30 menit.
6. Pembuatan Larutan Uji dan Larutan bFGF
a. Preparasi bFGF Sebagai Induktor Angiogenesis. bFGF yang digunakan
sebanyak 25 ng/µ L menggunakan larutan PBS pH 7,4 kemudian diencerkan
sehingga didapat kadar 1 ng/µ L. Preparasi bFGF ini dilakukan secara aseptis
di dalam Laminar Air Flow (LAF). Kadar bFGF yang diberikan untuk
setiap telur perlakuan terinduksi adalah 10 ng.
b. Preparasi Sediaan Larutan Uji. Ekstrak metanol daun senggugu dilarutkan
dengan DMSO – aquabidest steril kemudian dibuat seri konsentrasi (0,175, 0,35 dan 0,7 mg/mL). Konsentrasi pelarut (DMSO– aquabidest steril) disesuaikan dengan hasil orientasi kelarutan ekstrak metanol daun
7. Uji Antiangiogenesis
Satu atau beberapa hari sebelum diberi perlakuan, telur diinkubasi dalam
inkubator laboratorium pada suhu 37oC agar dapat menyesuaikan diri dengan
lingkungan barunya. Telur ayam usia 9 hari diberikan diperlakuan. Tahap awal
perlakuan yaitu dengan membersihkan telur dari kotoran yang menempel di
cangkang telur menggunakan alkohol 70%. Telur diberi tanda pada kerabang telur
yang meliputi batas ruang udara, lokasi embrio dan daerah yang akan dibuat segi
empat (jendela) berukuran 1x1 cm di atas embrio menggunakan pensil. Lokasi
embrio diketahui melalui candling menggunakan cahaya lampu pada telur.
Kerabang telur pada bagian kutub yang mengandung ruang udara dan kerabang di
atas embrio dibersihkan dengan iodin povidon. Selanjutnya pada ruang udara
tersebut dibuat lubang kecil dan pada daerah yang dibuat segiempat (jendela)
dibuat luka dengan menggunakan mini drill dan scalpel.
Udara dari ruang udara disedot dengan penyedot udara sampai berpindah
dari kutub kerabang bagian atas telur. Perlakuan ini dilakukan dengan posisi telur
horizontal, di ruang gelap, dan melalui candling, sehingga ruang udara buatan
yang terbentuk di atas embrio dapat terlihat.
Kerabang telur di atas embrio dipotong dengan mini drill untuk
membuat lubang segiempat dengan luas 1x1 cm. Melalui lubang ini, paper disc
untuk setiap perlakuan diimplantasikan ke dalam telur. Subyek uji berupa telur
dibagi secara acak dalam 6 kelompok (masing-masing perlakuan terdiri dari 3
telur), sebagai berikut :
b. Kelompok II adalah kelompok pelarut dengan implantasi paper disc + pelarut
(DMSO – aquabidest steril).
c. Kelompok III kelompok kontrol bFGF + pelarut adalah kelompok telur dengan
implantasi paper disc termuati bFGF 10 ng + pelarut (DMSO – aquabidest steril) sebanyak 10µ L.
d. Kelompok IV, V dan VI merupakan kelompok perlakuan yang digunakan
untuk melihat efek penghambatan ekstrak metanol daun senggugu dengan 3
variasi konsentrasi (0,175 ; 0,35 dan 0,7 mg/mL). Kelompok ini adalah
kelompok telur implantasi paper disc termuati bFGF 10 ng + larutan ekstrak
metanol daun senggugu dengan masing-masing konsentrasi sebanyak 10 µL.
Setelah diberi perlakuan implantasi paper disc sesuai kelompok
perlakuan, lubang kecil pada daerah kutub dan lubang segiempat ditutup dengan
parafin solidum yang dicairkan. Telur kemudian diinkubasi pada suhu 37oC
dengan kelembaban relatif 60% selama 3 hari atau 72 jam dengan inkubator,
kemudian telur dimasukkan ke dalam kulkas selama 24 jam. Telur dibuka (umur
13 hari) dengan cara menggunting cangkang telur menjadi dua bagian dimulai dari
cangkang yang dekat dengan rongga udara menggunakan gunting bedah secara
hati-hati agar tidak merusak chorioallantoic membrane telur, setelah itu
chorioallantoic membrane dibersihkan secara hati-hati dengan aquabidest steril.
Chorioallantoic membrane yang melekat pada bagian cangkang yang terdapat
paper disc diamati secara makroskopis. Pengamatan makroskopis dilakukan
secara langsung dan tidak langsung. Pengamatan makroskopis secara langsung
jumlah pembuluh darah baru yang terbentuk pada paper disc dan di sekitar paper
disc dan secara tidak langsung dengan foto kamera hasil CAM. Pembuluh darah
baru yang dihitung yaitu pembuluh darah tipis yang keluar dari pembuluh darah
utama. Pembuluh darah utama adalah pembuluh darah besar yang berada disekitar
paper disk. Pengamatan makroskopis ini dilakukan oleh empat orang pengamat.