METODOLOGI PENELITIAN
D. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi Akar Ginseng Merah.
Akar ginseng merah yang akan diteliti dideterminasi menurut pustaka acuan (Anonim, 1998; Anonim, 2000; Anonim, 2003; Christman, 2000; Harden, 1990; dan Nuskha, 2004). Determinasi dilakukan di Laboratorium Kebun Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Untuk mempermudah determinasi, digunakan seluruh bagian dari tanaman ginseng merah (akar, batang, daun, bunga dan buah).
2. Pengumpulan Bahan
Bahan berupa akar dari tanaman ginseng merah yang diperoleh dari CV. Indmira Citra Tani Nusantara, Yogyakarta pada bulan Oktober 2007. Tanaman yang diambil adalah tanaman yang sudah berbunga. Bagian tanaman yang digunakan adalah bagian akarnya yaitu dengan cara mengambil tanaman utuh kemudian dipotong pada bagian akarnya.
3. Pengeringan dan Pembuatan Serbuk
Pengeringan akar ginseng merah dilakukan di tempat terbuka yang terlindung dari sinar matahari langsung. Sebelum dikeringkan, akar dibersihkan dari debu dan kotoran terlebih dahulu, kemudian dicuci bersih dengan air mengalir. Selanjutnya dirajang dan diangin-anginkan di tempat terbuka yang terlindung dari sinar matahari langsung, kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 40 – 50 oC. Bagian tanaman yang sudah kering (simplisia kering ditandai dengan mudah dipatahkan), diserbuk dengan blender, kemudian diayak menggunakan pengayak. Kecuali dinyatakan lain, seluruh simplisia harus dihaluskan menjadi serbuk dengan ukuran (4/18)(Anonim, 1995).
4. Penyarian Akar Ginseng Merah Dengan Metode Infundasi
Penyarian dilakukan dengan metode infundasi. Untuk infus kadar 100% sebanyak + 40 gram bahan (akar kering yang sudah diserbuk) dibasahi dengan air 400 ml kemudian dipanaskan di dalam penangas air, selama 15 menit terhitung mulai suhu dalam panci infus 90oC, sambil sesekali diaduk. Infus diserkai sewaktu masih panas dengan menggunakan kain flanel sehingga diperoleh filtrat sebanyak 100 ml. Apabila filtrat yang diperoleh kurang dari 100 ml, maka untuk mencukupi kekurangan air perlu ditambahkan air panas secukupnya melalui ampas sampai diperoleh volume yang dikehendaki. Dari larutan infus 100 % dipipet 20 ml, 15 ml dan 10 ml kemudian diencerkan dengan aquadest sampai 25 ml sehingga diperoleh konsentrasi 80, 60 dan 40 %.
Tabel I. Seri konsentrasi infus akar ginseng merah sebagai larutan uji
Konsentrasi infus
Volume larutan uji infus 100% (ml) Volume aquadest (ml) Volume pengenceran (ml) 80 % 20 5 25 60 % 15 10 25 40 % 10 15 25
5. Uji Potensi Antibakteri Infus Akar Ginseng Merah Terhadap S. aureus
a. Persiapan stok bakteri
Diambil bakteri dari biakan murni S. aureus dengan ose, kemudian di diinokulasi secara streak plate pada media nutrien agar miring, lalu inkubasi
selama 24 jam pada suhu 37oC. Hasil inokulasi sebagai stok untuk tahap penelitian selanjutnya.
b. Pembuatan suspensi bakteri
Diambil dengan ose dari stok bakteri, kemudian diinokulasikan pada aquades steril, kemudian disetarakan dengan larutan standar Mc. Farland II (6 x 108 CFU/ml) dengan cara membandingkan kekeruhan suspensi bakteri uji secara visual dengan larutan standar baku.
c. Uji potensi antibakteri infus akar ginseng merah terhadap S. aureus dengan metode difusi paper disk
Dituang 20 ml nutrien agar ke dalam cawan petri, digoyang agar homogen, biarkan memadat. Diambil 0,1 ml suspensi bakteri uji yang setara dengan larutan standar Mc. Farland II (6 x 108 CFU/ ml), kemudian diinokulasikan secara spread plate ke dalam cawan petri yang berisi media.
Paper disk yang telah diinokulasi dengan 10μl amoksisilin sebagai kontrol positif, aquadest steril sebagai kontrol negatif, dan larutan uji (konsentrasi 100, 80, 60 dan 40%) diletakkan di atas permukaan media yang telah diinokulasi dengan bakteri uji. Diinkubasi terbalik selama 24 jam pada suhu 37o C dan hasilnya dibaca dengan mengukur zona hambatan yang terbentuk di sekitar paper disk dengan menggunakan penggaris.
d. Uji potensi antibakteri infus akar ginseng merah terhadap S. aureus dengan metode dilusi padat
Pada tabung reaksi yang berisi 20 ml media nutrien agar dimasukkan 0,5 ml bakteri S. aureus, kemudian ditambahkan pula 1 ml larutan uji dalam berbagai konsentrasi (100, 80, 60 dan 40%), dihomogenkan dengan vortex.
Setelah homogen dimasukkan dalam petri steril secara pour plate. Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37o C. Diamati pertumbuhan bakteri yang terjadi dan dibandingkan kekeruhan dari masing-masing konsentrasi dengan kontrol negatif dengan memberikan notasi untuk menyatakan banyak sedikitnya pertumbuhan bakteri uji. Setelah inkubasi pada petri yang menunjukkan tidak adanya pertumbuhan (kekeruhan = 0) diambil dengan ose koloni bakteri uji dan ditanam secara streak plate pada media padat steril dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37o C. Kemudian diamati pertumbuhan bakteri untuk mendapatkan nilai KHM dan KBM. KHM dapat ditentukan dari hasil dilusi padat yaitu pada petri yang menunjukkan penghambatan pada pertumbuhan
S. aureus dibandingkan dengan kontrol negatif. Sedangkan KBM ditentukan dari hasil penegasan dengan mengamati pertumbuhan bakteri uji pada media yang menggunakan metode streak plate dari hasil dilusi padat mulai dari petri yang menunjukkan tidak adanya pertumbuhan bakteri (McKane & Kandel, 1996)
6. Identifikasi Kualitatif Kandungan Senyawa dalam Infus Akar Ginseng Merah a. Uji Tabung
1) Uji Alkaloid
Sebanyak 2 gram serbuk akar ginseng merah dipanaskan dalam tabung reaksi besar dengan 10 ml asam klorida 1% selama 30 menit di atas penangas air mendidih. Larutan disaring dengan kapas ke dalam tabung reaksi A dan B sama banyak. Larutan A dibagi dua sama banyak, lalu ke dalam larutan A-1 ditambah dengan pereaksi Dragendorf (3 tetes) dan
larutan A-2 ditambah pereaksi Mayer (3 tetes). Terbentuknya endapan dengan kedua pereaksi tersebut menunjukkan adanya alkaloid.
2) Uji Antrakinon
Infus akar ginseng merah dididihkan selama 2 menit dengan 10 ml KOH 0,5N dan 1 ml hidrogen peroksida. Setelah dingin, suspensi disaring melalui kapas. Filtrat (5 ml) ditambah asam asetat (10 tetes) sampai pH 5, lalu dirambahkan 10 ml toluena. Lapisan atas (5 ml) dipisahkan dengan cara dipipet dan dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian ditambah KOH 0,5N, warna merah yang terjadi pada lapisan air (basa) menunjukkan adanya senyawa antrakinon.
3) Uji Polifenol
Sebanyak 2 gram serbuk akar ginseng merah depanaskan dengan air sebanyak 10 ml selama 30 menit di atas penangas air mendidih. Kemudian disaring panas-panas, setelah dingin ditambah 3 tetes pereaksi besi (III) klorida. Terjadinya warna hijau-biru menunjukkan adanya polifenolat. 4) Uji Tanin (zat samak)
Sebanyak 2 gram serbuk akar ginseng merah dipanaskan dengan air sebanyak 10 ml selama 30 menit di atas penangas air mendidih. Disaring dan filtrat sebanyak 5 ml ditambahkan larutan NaCl 2% sebanyak 1 ml. Bila terjadi suspensi atau endapan disaring melalui kertas saring. Kemudian filtrat ditambah larutan gelatin 1% sebanyak 5 ml. Terbentuknya endapan menunjukkan adanya tanin.
5) Uji Kardenolida
Sebanyak 2 gram serbuk akar ginseng merah dipanaskan dengan air sebanyak 10 ml selama 10 menit di atas penangas air mendidih. Kemudian ditambah asam 3,5-dinitratbenzoat (0,4 ml) dan KOH 1N dalam metanol (0,6 ml). Terjadinya warna biru-ungu menunjukkan adanya kardenolida (glikosida jantung). Untuk penegasan lebih lanjut, filtrat yang lain (2 ml) dicampur dengan kloroform (2 ml). Lapisan atas diambil dengan pipet, lapisan bawah ditambah asam 3,5-dinitrobenzoat (0,5 ml). Terjadinya warna biru-ungu menunjukkan adanya kardenolida.
6) Uji Saponin
Tambahkan air suling (10 ml) ke dalam tabung reaksi yang berisi serbuk akar ginseng merah (100 mg), tutup dan kocok kuat-kuat selama 30 detik. Biarkan tabung dalam posisi tegak selama 30 menit. Apabila buih setinggi kurang lebih 3 cm dari permukaan cairan, maka menunjukkan adanya saponin.
7) Uji Minyak Atsiri
Serbuk akar ginseng merah ditambahkan 20 ml eter, kocok dan disaring. Kemudian filtrat dikeringuapkan. Bila sedikit berbau aromatik, larutan residu dengan sedikit etanol maka uapkan lagi sampai kering. Bila terjadi bau aromatik yang spesifik, menunjukkan adanya minyak atsiri.
b. Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Pemeriksaan senyawa dalam tanaman ginseng merah dilakukan secara KLT dengan fase gerak kloroform-metanol-air (64 : 50 : 10) v/v dan fase
diam silika gel GF 254 dengan standar pembanding saponin. Senyawa dielusikan sampai batas yang ditentukan yaitu 10 cm. Deteksi awal banyak bercak dilakukan di bawah sinar UV 254 nm dan 365 nm. Bercak dideteksi dengan disemprot pereaksi penampak Vanillin asam sulfat. Hasil yang diperoleh adalah warna bercak dan harga Rf yang akan dibandingkan dengan standar pembanding.
Larutan uji yang digunakan adalah larutan infus akar ginseng merah. Sedangkan standar pembanding digunakan larutan daging buah Sapindus rarak yaitu dengan merefluks 2 gram daging buah Sapindus rarak dengan 10 ml etanol 70 % selama 10 menit.