BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
F. Tata Cara Penelitian
Simplisia daun mengkudu yang berbentuk serbuk didapat dari laboratorium Biologi Farmasi UGM. Serbuk daun mengkudu ditimbang dan dilarutkan dalam pelarut etanol 70% dengan perbandingan 1 : 3. Prosedur tersebut mengacu pada penelitian Nayak et al. (2009). Setelah itu, dilakukan maserasi pada campuran tersebut selama 3 hari dan remaserasi selama 3 hari menggunakan orbital shaker dengan penambahan pelarut sama dengan saat maserasi. Maserasi dilakukan pada suhu kamar. Hasil ekstraksi disaring dengan kertas saring Whatman dengan bantuan corong Buchner yang dihubungkan dengan pompa vakum. Filtrat yang didapat dari hasil penyaringan diambil dan diuapkan menggunakan rotary evaporator yang diatur pada suhu 60oC dengan kecepatan pemutaran pada skala 4 sehingga etanol dapat teruapkan. Selanjutnya ekstrak hasil penguapan diuapkan lagi pada penangas air selama sekitar 7 jam pada suhu 65oC. Ekstrak kental yang didapat dilanjutkan pada tahap formulasi dan diuji aktivitasnya dengan mengaplikasikan ekstrak tersebut pada tikus jantan galur Wistar.
2. Karakterisasi, uji kualitatif, dan uji kuantitatif senyawa aktif pada ekstrak daun mengkudu
Karakterisasi ekstrak yang dilakukan pada penelitian ini ialah penetapan kadar air, kadar sari, dan kadar abu total pada ekstrak mengkudu. Ekstrak kental daun mengkudu yang didapat dari proses sebelumnya, diambil secuplik untuk diuji kandungan senyawa aktifnya yaitu senyawa flavonoid, senyawa
triterpenoid, dan senyawa alkaloid. Uji kandungan senyawa tersebut dilakukan secara kualitatif (triterpenoid dan alkaloid) dan kuantitatif (flavonoid dan alkaloid). Pengujian ekstrak dilakukan di LPPT UGM Unit I Yogyakarta.
3. Formulasi sediaan gel a. Formula
Formula yang digunakan dalam percobaan ialah sebagai berikut (Tabel I) :
Tabel I. Formula gel hasil orientasi
Bahan Formula
F I F II F III F IV
Ekstrak daun mengkudu (g) 5 5 5 5
CMC-Na (%) 2,5 3 3,5 4 Propilen glikol (g) Metil paraben (g) 12,5 0,1 12,5 0,1 12,5 0,1 12,5 0,1 Aquadest (mL) 78,4 78,4 78,4 78,4 Keterangan :
F I = Formula gel dengan konsentrasi CMC-Na 2,5 % b/b F II = Formula gel dengan konsentrasi CMC-Na 3 % b/b F III = Formula gel dengan konsentrasi CMC-Na 3,5 % b/b F IV = Formula gel dengan konsentrasi CMC-Na 4 % b/b
Penentuan bahan-bahan pada tabel di atas (tabel I) merupakan bahan umum yang biasa digunakan pada formulasi gel. Penentuan jumlah / konsentrasi berdasarkan hasil orientasi didapatkan dari literatur Rowe et
sebagai humektan (≤ 15%), dan metil paraben sebagai pengawet (0,02 -0,3%). Konsentrasi ekstrak daun mengkudu didapat dari jurnal penelitian Yuslianti et al. (2013) yang menyebutkan bahwa ekstrak daun mengkudu pada konsentrasi 10 mg/mL efektif menyembuhkan luka. Dari penelitian tersebut konsentrasi ekstrak sebesar 10 mg/mL = 1 g/100 mL atau 1 % b/b, ditingkatkan 5 kalinya menjadi 5% b/b untuk formulasi sediaan gel. b. Formulasi sediaan gel
Peralatan gelas / kaca yang digunakan pada formulasi gel disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit, sedangkan peralatan tidak terbuat dari kaca dicuci / disemprot dengan etanol. CMC-Na dan metil paraben disterilisasi menggunakan oven dengan suhu 160oC selama 1 jam. Propilen glikol dan aquadest disterilisasi dengan autoklaf juga. CMC-Na dikembangkan dengan cara ditaburkan di atas aquadest yang sudah disterilkan dengan autoklaf (campuran A), setelah itu didiamkan selama 24 jam. Metil paraben dicampur dalam propilen glikol yang telah steril hingga terbentuk campuran yang homogen (campuran B). Campuran B dimasukkan dalam campuran A lalu dicampurkan hingga homogen menggunakan mixer selama 3 menit (campuran C). Ekstrak daun mengkudu kemudian dimasukkan ke dalam campuran C, campuran tersebut dihomogenkan hingga menit ke-5 (campuran D). Terakhir
aquadest dimasukkan dalam campuran D sedikit demi sedikit sambil
dilakukan pencampuran hingga homogen dengan mixer hingga menit ke-10. Seluruh proses pencampuran pada formulasi dilakukan secara aseptis
di dalam Laminar Air Flow. Sediaan gel dikemas dalam suatu wadah tertutup rapat dan disimpan pada suhu kamar. Prosedur formulasi gel yang dilakukan mengacu pada penelitian Sanjaya (2013) tentang pembuatan gel antiinflamasi dengan ekstrak daun petai cina.
Pada sediaan gel ekstrak daun mengkudu tidak dilakukan uji sterilitas karena berdasarkan penelitian-penelitian sebelumnya yaitu penelitian Patel el al. (2011), Patil et al (2012), dan Sanjaya (2013), tidak dilakukan uji sterilitas pada sediaan penyembuh luka yang dibuat.
4. Uji sifat fisik dan stabilitas fisik gel a. Uji organoleptis
Sediaan gel yang sudah jadi diamati warna, bau, dan konsistensinya pada hari ke-2 dan 28. Hasil yang didapat dibandingkan dengan hasil sediaan gel pada hari ke-2.
b. Uji pH
Sediaan gel diukur pHnya pada hari ke- 2 dan 28 dengan pH
stick indikator universal. Hasil yang didapat dibandingkan dengan hasil
sebelumnya untuk melihat apakah terjadi perubahan pH selama penyimpanan 28 hari.
c. Uji viskositas dan perubahan viskositas
Uji viskositas dilakukan tiga kali yaitu pada hari ke- 2, 7, 14, 21, dan 28. Masing-masing formula gel ditentukan viskositasnya menggunakan alat Viscotester Rion seri VT 04F dengan ukuran rotor berskala 2. Perubahan viskositas diperoleh dengan mengetahui selisih
nilai viskositas pada hari ke-2 dengan nilai viskositas pada hari-hari selanjutnya (hari ke- 7, 14, 21, dan 28), kemudian dibagi dengan nilai viskositas gel pada hari ke-2 dan dikali 100.
d. Uji daya sebar dan perubahan daya sebar
Sebanyak 1 gram gel ditimbang, diletakkan pada suatu lempeng kaca bulat berskala. Pada pengukuran daya sebar, di atas lempeng tersebut ditangkupkan lempeng kaca lain berukuran sama (horizontal double plate). Kemudian lempeng tersebut ditindihi dengan beban 125 gram selama 1 menit dan diukur rata-rata diameter sebarnya. Diameter yang diperoleh dihitung nilai daya sebarnya dengan perhitungan sebagai berikut :
Keterangan : S = nilai daya sebar (cm2)
d = rata-rata diameter sebar (cm) π = 3,14
Uji ini dilakukan pada hari ke- 2, 7, 14, 21, dan 28. Perubahan daya sebar diperoleh dengan mengetahui selisih nilai daya sebar gel pada hari ke-2 dengan nilai daya sebar pada hari-hari selanjutnya (hari ke- 7, 14, 21, dan 28), kemudian dibagi dengan nilai daya sebar gel pada hari ke-2 dan dikali 100.
5. Uji aktivitas penyembuh luka
Hewan uji (tikus jantan galur Wistar) dibius dengan menggunakan ketamin hidroklorida secara intravena. Selanjutnya, bulu bagian dorsal dibasahi dengan air dan dibuat tanda area lalu bulu dorsal
tikus dicukur dengan pisau cukur steril. Area bulu yang telah dicukur lalu ditandai dengan spidol untuk mengetahui panjang luka yang diinginkan. Luka dibuat secara horizontal dengan cara menyayat bagian yang telah ditandai sepanjang 5 cm dengan kedalaman luka 2 mm.
Hewan uji dibagi menjadi beberapa kelompok yaitu kelompok kontrol tanpa perlakuan, kelompok ekstrak, kelompok kontrol positif (salep Betadine®), kelompok kontrol negatif (sediaan gel tanpa ekstrak daun mengkudu / basis gel), dan kelompok gel ekstrak daun mengkudu. Masing-masing kelompok sebanyak tiga hewan uji. Uji aktivitas kemampuan penyembuhan luka terlebih dahulu dilakukan pada kelompok ekstrak dan kelompok kontrol tanpa perlakuan karena digunakan sebagai uji orientasi untuk mengetahui kemampuan ekstrak daun mengkudu dalam menyembuhkan luka. Pengujian pada kelompok ekstrak dilakukan dengan mengoleskan ekstrak di sepanjang area luka selama 7 hari berturut-turut. Sedangkan pada kelompok tanpa ekstrak, tikus yang sudah dilukai tidak diberikan perlakuan apapun, hanya dilihat pengurangan panjang lukanya dari awal pembuatan luka hingga hari ke-7. Hewan uji pada kelompok kontrol (negatif dan positif) yang sudah dilukai, diolesi dengan sediaan yang sudah ditentukan sebanyak 1 gram, sediaan diaplikasikan secara merata di sepanjang luka yang dibuat. Pada kelompok kontrol negatif diaplikasikan gel tanpa ekstrak daun mengkudu sedangkan pada kelompok kontrol positif diaplikasikan sediaan penyembuh luka semi solid yang ada di pasaran (salep Betadine®). Pengaplikasian sediaan tersebut dilakukan
setiap hari dari awal tikus dilukai (hari ke-0) hingga hari ke-7. Hewan uji pada kelompok perlakuan yang sudah dilukai, diolesi dengan sediaan gel ekstrak daun mengkudu secara merata sebanyak 1 gram di sepanjang luka yang dibuat selama 7 hari. Tingkat penutupan luka diukur dan dicatat setiap hari hingga hari ke- 7. Hasil pengukuran tersebut kemudian dibuat grafik. Data yang didapatkan dari hasil pengujian dianalisis menggunakan uji Anova. Perhitungan terkait % pengurangan panjang luka diacu dari penelitian Patel et al. (2011) terkait dengan perhitungan aktivitas luka eksisi.