BAB III METODE PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
1. Pemilihan bahan
Beras yang dipilih adalah beras yang diambil dari satu jenis merk beras,
yaitu Raja lele. Bahan ini diperoleh dari pembelian di supermarket Indogrosir.
2. Pembuatan limbah air cucian beras
Beras sebanyak 0,5 kg ditampung di baskom, lalu diberi air 1 liter. Beras
didiamkan selama 1 jam. Lalu terbentuk 2 lapisan, lapisan airnya ini diambil
dan digunakan pada tahap selanjutnya.
3. Pembuatan membran kitosan
Sejumlah 2 g dan 10 g kitosan masing-masing dilarutkan dalam 100
mL asam asetat dengan konsentrasi 2% di atas hot plate sambil diaduk dengan
magnetic stirrer. Larutan kitosan lalu dituang ke atas nampan yang telah
dicuci alkohol 70% dan dikeringkan lalu diletakkan selama beberapa hari di
udara terbuka untuk menjamin penguapan solven secara sempurna. Setelah
beberapa hari maka akan terbentuk produk membran yang transparan dan
fleksibel. Membran kitosanyang terbentuk lalu disimpan di dalam toples yang
sebelumnya telah diberi silika gel.
4. Pembuatan material selulosa bakteri
Sebanyak 200 mL air cucian beras hasil penyaringan dituangkan ke
dalam erlenmeyer yang telah dilengkapi dengan pengaduk magnet (stirer),
kemudian ditambahkan 20 g gula pasir dan 1,0 g urea, dan diaduk hingga
larut. Selanjutnya pH dicek, apabila pH larutan masih berkisar antara 5-6,
maka campuran diasamkan dengan penambahan asam asetat 25% hingga pH
= 4 dan diaduk hingga larut. Selanjutnya campuran didinginkan sebentar dan
ditambahkan gliserol sebanyak 1,0 g lalu dituangkan dalam keadaan hangat ke
dalam nampan yang telah disterilkan dengan alkohol 70% dan telah ditutup
sebagian dengan koran sambil didinginkan hingga tercapai suhu kamar. Lalu
dengan rapat menggunakan koran dan difermentasi selama 7 hari pada suhu
kamar.
Setelah 7 hari, penutup koran dibuka dan lapisan pelikel yang
terbentuk diambil lalu dicuci berturut-turut dengan air PAM, dengan aquades,
dengan air panas kemudian lapisan pelikel ini ditimbang dengan timbangan
digital. Lapisan pelikel lalu direndam dengan larutan Natrium hidroksida 3%
selama 48 jam dimana tiap 24 jam sekali larutan Natrium hidroksida 3% ini
diganti lalu setelah 48 jam, lapisan pelikel ini dicuci kembali dengan aquades
setelah dicuci dengan aquades lalu lapisan pelikel ini direndam dengan larutan
asam klorida 3% selama kurang lebih 24 jam. Setelah 24 jam, lapisan pelikel
ini lalu dicuci kembali dengan aquades dan dicek pH-nya dengan pH stik, jika
pH pada pH stik sudah menunjukkan pH mendekati range pH netral,
pencucian dengan aquades ini dihentikan kemudian air di lapisan pelikel ini
dibuang lalu lapisan pelikel ini ditimbang. Setelah ditimbang, lapisan pelikel
ini lalu dikeringkan dalam oven pada suhu 40oC selama kurang lebih dua
minggu.
Setelah 2 minggu atau setelah air pada nampan ini kering, lapisan
pelikel ini dikeluarkan dari oven dan dijemur dibawah cahaya matahari
selama kurang lebih 1 minggu dengan sebelumnya nampan yang berisi pelikel
ini ditutup dengan kain hitam. Setelah 1 minggu atau setelah lapisan pelikel
dalam plastik dan diletakkan di dalam toples yang sebelumnya telah diberi
silika gel.
5. Pembuatan Material Selulosa Kitosan Bakteri
Sebanyak 200 ml air cucian beras hasil penyaringan dituangkan ke
dalam Erlenmeyer yang telah dilengkapi dengan pengaduk magnet,
ditambahkan 20,0 g gula pasir dan 1,0 g urea, selanjutnya diaduk hingga larut.
Campuran diasamkan dengan penambahan asam asetat glasial hingga pH
berkisar antara 3-4. Selanjutnya campuran didinginkan sebentar dan
ditambahkan gliserol sebanyak 1,0 g lalu dituangkan dalam keadaan hangat ke
dalam nampan yang telah disterilkan dengan alkohol 70% dan ditutup dengan
koran sambil didinginkan hingga sesuai suhu kamar. Lalu campuran
ditambahkan 40 mL Acetobacter xylinum dan wadah ditutup dengan rapat
menggunakan koran dan difermentasi selama 7 hari pada suhu kamar.
Lapisan pelikel yang terbentuk dicuci beberapa kali dengan air kran,
lalu dengan aquades, lalu dengan air panas, lalu lapisan pelikel ini ditimbang
dengan timbangan digital. Lapisan pelikel lalu direndam dengan larutan
natrium hidroksida 3% selama 48 jam dimana tiap 24 jam sekali larutan
natrium hidroksida 3% ini diganti lalu setelah 48 jam, lapisan pelikel ini
dicuci kembali dengan aquades setelah dicuci dengan aquades lalu lapisan
pelikel ini direndam dengan larutan asam klorida 3% selama kurang lebih 15
menit. Setelah 15 menit, lapisan pelikel ini lalu dicuci kembali dengan
menunjukkan pH mendekati range pH netral, pencucian dengan aquades ini
dihentikan kemudian air di lapisan pelikel ini dibuang dan lapisan pelikel
ditimbang.
Setelah ditimbang lalu larutan kitosan 2% yang telah dibuat
dituangkan ke atas lapisan pelikel. Lapisan pelikel+larutan kitosan ini lalu
dikeringkan dalam oven pada suhu 40o C selama kurang lebih 2 minggu atau
sampai lapisan pelikel berbentuk lembaran tipis. Setelah lapisan pelikel itu
berbentuk lembaran tipis yang kering dikeluarkan dari oven lalu disimpan di
dalam plastik dan diletakkan di dalam toples yang telah diberi silica gel
supaya biomaterial tetap terjaga kekeringannya.
6. Analisa karakteristik biomaterial :
a. Analisis FT – IR
Analisis ini menggunakan seperangkat alat FTIR dan dilakukan di
Laboratorium Analisis Farmasi Fakultas Farmasi UII.
Langkah-langkahnya adalah lapisan tipis atau pelikel yang diperoleh dari hasil
fermentasi dijepit pada tempat sampel kemudian diletakkan pada alat ke
arah sinar inframerah. Hasilnya akan direkam ke dalam kertas berskala
berupa alur kurva bilangan gelombang terhadap intensitas.
b. Analisa SEM
Material selulosa kitosan bakteri dipotong sedemikian rupa,
kemudian ditempatkan di atas tempat sampel yang terbuat dari kuningan
selama kurang lebih 5 menit. Selanjutnya sampel dimasukkan ke unit
elektron gun melalui bilik pergantian sampel. Kemudian sampel diset
dengan bantuan mikrostage sampai mendapatkan fokus yang tepat.
Tombol utama pada posisi ON dan diset detector Acceleratevoltage set, 20
kilo volt.
c. Analisa XRD
Uji XRD ini dilakukan dengan memakai instrumen X-Ray
Diffraction yang dilakukan di Laboratorium XRD, Jurusan Teknik Kimia
UNY. Langkah-langkahnya adalah lembaran film dipotong dengan ukuran
2x2 cm. Sampel tersebut kemudian dipasang di sample holder dan sampel
diusahakan rata di atas sample holder. Selanjutnya pendingin alat XRD
dihidupkan dan instrumen XRD dihidupkan lalu diatur kondisi alat dengan
sudut putar 2θ = 2° sampai 80°, scan step = 0,04 dan scan speed = 4 °/menit serta tegangan dan arus pada instrumen disesuaikan dengan
standard measurenment dari instrumen dan dirotasikan agar benar-benar
terorientasi secara acak. Hasil uji ini berupa difraktrogram hubungan
antara intensitas dan sudut 2θ.
7. Sterilisasi produk
Saat akan digunakan, produk biomaterial yang sudah dikeringkan
disterilkan dengan etanol 96% selama 15 menit, kemudian dibilas dengan
8. Pengujian aktivitas antimikroba
a. Pembuatan suspensi bakteri uji
Isolat murni Staphylococcus aureus ditambahkan ke dalam media BHI
broth yang diinkubasi pada 37oC selama kurang lebih 4 jam sampai
kekeruhan Brain Heart Infusion broth (BHI broth) menyamai
kekeruhannya McFarland no.0,5.
b. Pembuatan media
Media yang digunakan untuk uji aktivitas antimikroba adalah MHA.
Larutan MHA dituangkan ke dalam cawan petri sebanyak 20 mL dan
dibiarkan beberapa saat hingga memadat.
c. Penanaman bakteri uji
Hasil suspensi bakteri uji dimasukkan ke dalam media Mueller-Hinton
Agar (MHA) dengan cara dioleskan secara merata dengan menggunakan
lidi kapas steril Kirby bauer , lalu didiamkan kurang lebih selama 5
menit.
d. Pemberian kontrol positif pada bakteri uji
Sebagai kontrol positif, digunakan paper disk antibiotik amoxicillin.
Bakteri uji yang sudah ditanamkan pada Mueller-Hinton Agar kemudian
diberi paper disk amoxicillin tadi sebanyak 1 disk per plate. Kemudian
inkubasikan pada 37oC selama 24 jam.
Sebagai kontrol negatif, digunakan asam asetat. Sebanyak 20 µl asam
asetat diteteskan pada paper disk. Bakteri uji yang sudah ditanamkan pada
Mueller-Hinton Agar kemudian diberi paper disk berisi asam asetat tadi
sebanyak 4 disk per plate. Kemudian inkubasikan pada 37oC selama 24
jam.
f. Pemberian biomaterial,selulosa dan kitosan pada bakteri uji
Bakteri uji yang sudah ditanamkan pada Mueller-Hinton Agar
kemudian diberi potongan biomaterial. Biomaterial ini dipotong serupa
dengan bentuk dan ukuran paper disk yang bertindak sebagai kontrol
positif dan kontrol negatif tadi dan sudah disterilisasi menggunakan
etanol 96% dan buffer phosphat. Potongan masing-masing biomaterial
kemudian diletakkan sebanyak 4 potongan biomaterial per plate.
Kemudian inkubasikan pada 37oC selama 24 jam. Hal yang sama juga
dilakukan untuk membran kitosan dan selulosa bakteri.
g. Pengukuran zona hambat
Pengukuran zona hambat dilakukan dengan mengukur diameter zona
hambat dalam millimeter, kemudian dihitung dengan menggunakan
program statistik SPSS untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan
