METODE PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Pengumpulan dan pengolahan tempe ↓
Isolasi Isoflavon tempe ↓
Identifikasi kualitatif isoflavon tempe dengan KLT ↓
Uji Antioksidan metode DPPH ↓
Formulasi Krim ↓
Uji Sifat Fisik dan Stabilitas Sediaan
Gambar 6. Alur Penelitian Singkat
1. Pengumpulan Tempe, Pengolahan Tempe, dan Isolasi Isoflavon Tempe
Tempe yang dibungkus dengan daun pisang berbentuk persegi panjang sebanyak 1 kg, diperoleh dari pasar STAN paingan Sleman pada saat pagi hari. Tempe tersebut kemudian dihaluskan dan ditimbang sebanyak enam ratus gram. 600 gram tempe ditambah 400 mL aquadest. Kemudian diblender selama 3x5 menit. Ditambahkan 1.200 mL metanol teknis, dimaserasi selama dua belas jam pada kecepatan 120 rpm. Setelah dimaserasi dua belas jam kemudian disaring. Ektrak yang diperoleh dipekatkan dengan vaccum rotary evaporator pada suhu 600C selama kurang lebih 1 jam untuk setiap 300 mL ekstrak metanol sampai diperoleh ekstrak kental ±100 mL (Ariani, 2003).
Ekstrak kental diekstraksi dengan penggojogan selama satu menit, menggunakan pelarut 5x150 mL petroleum eter, ambil fase bagian bawah kemudian diekstraksi lagi dengan 5x150 mL etil asetat. Fase etil asetat di bagian atas diambil dan dibebaskan dari air dengan MgSO4 anhidrat sebanyak ±15 gram lalu disaring. Ekstrak tersebut dipekatkan sampai 1/10 volume awal ekstrak etil
23
asetat dengan vaccum rotary evaporator pada suhu 400C selama kurang lebih 1 jam untuk setiap 300 mL ekstrak etil asetat sampai diperoleh ekstrak kental etil asetat isoflavon (Ariani, 2003).
2. Identifikasi Isoflavon dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Sedikit isolat hasil isolasi isoflavon dilarutkan dalam metanol p.a dan ditotolkan sebanyak sembilan kali totolan menggunakan pipa kapiler pada fase diam silica gel GF 254. Ditunggu hingga kering kemudian eluen dikembangkan dalam fase gerak kloroform : metanol = 3 : 1. Setelah eluen dikembangkan, reaksikan dengan uap amonia selama sepuluh menit dan diamati dengan lampu UV 254nm (Ariani, 2003).
3. Uji Antioksidan Isoflavon dari Tempe dengan Metode DPPH
a.Pembuatan Larutan Reagen DPPH 0,1 mM. Ditimbang 0, 00788 gram DPPH. Dilarutkan dalam metanol p.a, tambahkan sampai 200 ml.
b.Pembuatan Larutan Stok Antioksidan Pembanding BHT. Ditimbang 0,0027 gram BHT. Dilarutkan dalam metanol p.a, ditambahkan sampai 25 ml. Sehingga akan didapat larutan stok BHT dengan konsentrasi 0,5 mM. c.Pembuatan Seri Konsentrasi Antioksidan Pembanding BHT. Diambil
larutan stok BHT sebanyak 1 ml; 1,5 ml; 2 ml; 5 ml. Kemudian masing-masing konsentrasi dilarutkan dan ditambahkan dengan metanol p.a sampai 10 ml. Sehingga akan diperoleh seri konsentrasi BHT 0,05 mM; 0,075 mM; 0,1 mM; 0,25 mM.
d.Pengukuran Absorbansi BHT dengan Spektrofotometer Visibel. Diambil larutan reagen DPPH sebanyak 7,5 ml, ditambahkan dengan larutan BHT
sebanyak 0,5 ml. Ulangi perlakuan yang sama untuk setiap seri konsentrasi. Didiamkan dalam ruangan gelap dengan suhu kamar selama tiga puluh menit. Setelah tiga puluh menit, diukur absorbansi pada panjang gelombang 517 nm.
e.Pembuatan Larutan Stok Ekstrak Etil Asetat Isoflavon. Ditimbang 12,5 gram ekstrak etil asetat isoflavon. Dilarutkan dalam metanol p.a, ditambahkan sampai 25 ml. Sehingga akan diperoleh larutan stok ekstrak etil asetat isoflavon dengan konsentrasi 50 % b/v.
f. Pembuatan Seri Konsentrasi Ekstrak Etil Asetat Isoflavon. Diambil larutan stok ekstrak etil asetat isoflavon sebanyak 2 ml; 4 ml; 6 ml; 8 ml; 10 ml. Kemudian masing-masing konsentrasi dilarutkan dan ditambahkan dengan metanol p.a sampai 10 ml. Sehingga akan diperoleh seri konsentrasi ekstrak etil asetat isoflavon 10 % b/v; 20 % b/v; 30 % b/v; 40 % b/v; 50 % b/v.
g.Pengukuran Absorbansi Sampel dengan Spektrofotometer Visible. Diambil larutan reagen DPPH sebanyak 7,5 ml ditambahkan dengan larutan sampel (ekstrak etil asetat isoflavon) sebanyak 0,5 ml. Perlakuan diulang untuk setiap seri konsentrasi. Didiamkan dalam ruangan gelap dengan suhu kamar selama tiga puluh menit. Setelah tiga puluh menit, diukur absorbansi pada panjang gelombang 517 nm (Lee, J., Renita, M., Fiorito, R.J., 2004).
25
4. Formulasi Sediaan Krim Anti-aging isoflavon dari Tempe
Formula vanishing cream yang digunakan dalam formulasi sediaan krim ini adalah formula standar (Young, 1972) sbb :
a. Stearic acid 20,0
Cetyl alcohol 0,50
Triethanolamine 1,20
b. Sodium hydroxide one microspatula-full
Glycerine 8,0
Distilled water 69,94
Preservative (Nipagin) one microspatulla-full
c. Perfume three or four drops
Modifikasi formula yang digunakan dalam penelitian ini adalah sbb :
Tabel IV. Rancangan Formula Desain Faktorial (= 250 gram krim)
Keterangan 1 a b ab Asam stearat 12,5 12,5 12,5 12,5 Cetyl alcohol 5 10 5 10 VCO 5 5 5 5 A. BHT 0,25 0,25 0,25 0,25 Glycerin 12,5 25 12,5 25 TEA 2,5 2,5 2,5 2,5 Nipagin 0,625 0,625 0,625 0,625 B. Aquadest 200 200 200 200 C. Isoflavon 0,10 0,10 0,10 0,10
D. Perfume 10 tetes 10 tetes 10 tetes 10 tetes Bagian A dipanaskan di hotplate hingga suhu 700C. Setelah semua meleleh dan mencapai suhu 700C, maka masukkan cetyl alcohol ke dalam asam stearat, diaduk hingga homogen. Ditambahkan BHT ke dalam VCO sebagai emollient dan penetration enhancer, diaduk hingga homogen. Ditambahkan VCO tersebut ke dalam campuran cetyl alcohol dengan asam stearat. Fase minyak telah siap.
Bagian B dipanaskan di hotplate hingga suhu 700C. Setelah semua mencapai suhu 700C, maka masukkan TEA ke dalam aquadest dan diaduk hingga
homogen. Ditambahkan nipagin ke dalam gliserin, aduk hingga homogen. Ditambahkan gliserin ke dalam aquadest yang telah ditambahkan TEA. Campuran tersebut kemudian diaduk. Fase air telah siap.
Fase air yang telah siap ditambahkan ke dalam fase minyak dengan suhu pencampuran 700C di atas waterbath, diaduk dengan mixer selama sepuluh menit (Young, 1972). Ditambahkan isoflavon pada saat pencampuran dengan mixer, pada saat pencampuran telah berjalan selama lima menit. Setelah 10 menit, dituangkan krim ke dalam wadah dan tunggu hingga suhu krim 450C, pada saat suhu tersebut ditambahkan parfum kemudian diaduk hingga homogen.
5. Uji Sifat Fisik dan Stabilitas Sediaan Krim
a.Uji daya sebar. Ditimbang krim seberat 1 gram dan diletakkan di tengah kaca bulat berskala. Di atas krim diletakkan kaca bulat lain dan pemberat dengan berat total 125 gram, didiamkan selama 1 menit, dicatat diameter penyebarannya.
b.Uji Viskositas. Pengukuran viskositas menggunakan Viscotester Rion seri VT 04 dengan cara: krim dimasukkan dalam wadah dan dipasang pada portable viscotester. Viskositas krim diketahui dengan mengamati gerakan jarum penunjuk viskositas.
c.Uji Mikromeritik (Ukuran Droplet). Dioleskan sejumlah krim pada gelas objek kemudian diletakkan meja benda pada mikroskop. Diamati ukuran droplet yang terdispersi pada krim. Gunakan perbesaran lemah untuk menentukan objek yang akan diamati kemudian ganti dengan perbesaran kuat. Dicatat diameter terjauh dari tiap droplet sejumlah 500 droplet.
27
Dalam penelitian ini pengamatan mikromeritik dilakukan dengan mengambil beberapa foto preparat krim dan tampak adanya droplet-droplet yang akan ditentukan diameternya. Selanjutnya pengukuran diameter droplet dilakukan dengan menggunakan software Motic image plus 2.0 hingga didapatkan µm diameter dari 500 droplet yang akan diukur.
d.Uji Tipe Emulsi (Metode Warna). Beberapa tetes biru metilen dicampurkan ke dalam suatu formula krim. Jika seluruh krim berwarna seragam, maka terdapat suatu emulsi dari jenis m/a, oleh karena air adalah fase luar (Voigt, 1994).
