BAB III METODE PENELITIAN
F. Tata Cara Penelitian
Dua puluh bungkus pewarna rambut oksidatif disiapkan. Serbuk pewarna rambut ditimbang satu per satu untuk pengujian keseragaman bobot. Setelah dilakukan uji keseragaman bobot kemudian serbuk pewarna rambut dihomogenkan dengan menggunakan mortir dan stamper. Serbuk yang sudah dihomogenkan disimpan dalam wadah yang kering, tertutup rapat, dan dimasukkan ke lemari pendingin.
2. Pembuatan larutan sodium metabisulfit 0,01 M
sodium metabisulfit sebanyak 1,9 g ditimbang dan dilarutkan dalam aquadest yang telah disaring dengan kertas Whatman hingga 1 L.
3. Pembuatan larutan sodium metabisulfit 0,01 M pH 8
Larutan sodium metabisulfit 0,01 M ditambah dengan larutan ammonia 10 % sedikit demi sedikit sampai larutan mencapai pH 8.
4. Pembuatan fase gerak untuk KCKT
Aquadest sebanyak 90 mL yang telah ditambah amonia 10% sebanyak 100 µL dicampurkan dengan asetonitril sebanyak 10 mL. Fase gerak disaring menggunakan kertas saring Whatman dengan dibantu pompa vakum kemudian gas dihilangkan dengan ultrasonifikasi selama 20 menit.
5. Validasi metode pengukuran PPD dengan KCKT
a. Pembuatan larutan stok baku PPD 2 mg/mL. Larutan stok baku PPD dibuat dengan konsentrasi 2 mg/mL dengan menggunakan pelarut larutan natrium metabisulfit 0,01 M.
b. Pembuatan larutan intermediet PPD 40 µg/mL. Larutan intermediet PPD dengan konsentrasi 40 g/mL dibuat dengan pengenceran stok baku PPD dengan konsentrasi 2 mg/mL. Pengenceran menggunakan pelarut natrium metabisulfit 0,01 M.
c. Pembuatan larutan seri baku PPD. Seri konsentrasi larutan PPD 1, 2, 3, 4, 6, 8, dan 10 ng/µ L dibuat dengan mengencerkan larutan intermediet PPD dengan fase gerak KCKT. Larutan seri konsentrasi PPD diinjeksikan ke dalam KCKT fase terbalik dengan kolom C18, komposisi fase gerak ACN : aquades/ ammonium hidroksida 10% (10:90), kecepatan alir 0,5 mL/ menit, detektor UV dengan panjang gelombang 254 nm sesuai dengan hasil optimasi Emelia (2015).
6. Identifikasi para-phenylenediamine (PPD) dalam pewarna rambut dan perbandingan ekstrak sampel pewarna rambut sebelum dan sesudah
clean-up dengan SPE C18 dengan KCKT
Pada penelitian ini dilakukan identifikasi dalam sampel pewarna rambut dengan menggunakan KCKT. Cara yang dilakukan yaitu dengan membandingkan waktu retensi dan bentuk puncak antara baku PPD dan sampel pewarna rambut untuk mengetahui apakah dalam sampel pewarna rambut terdapat PPD.
a. Ekstraksi PPD dari pewarna rambut. Sampel pewarna rambut oksidatif yang telah dihomogenkan ditimbang seksama lebih kurang 300 mg, dimasukkan dalam tabung sentrifus, ditambah 10 mL larutan sodium metabisulfit 0,01 M pH 8. Suspensi dikocok dan disentifus selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Cairan supernatan diambil, dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL. Endapan ditambah 10 mL larutan sodium metabisulfit 0,01 M pH 8, sentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Cairan supernatan diambil, dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL. Langkah ini diulang sebanyak dua kali. Supernatan dalam labu takar 50 mL diencerkan dengan larutan sodium metabisulfit 0,01 M hingga batas tanda. Sejumlah 1 mL larutan tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL kemudian diencerkan dengan larutan sodium metabisulfit 0,01 M hingga batas tanda.
b. Clean-up sampel dengan SPEC18. Sebelum digunakan SPE dialiri dengan 6 mL aquadest. Seratus mikroliter ekstrak sampel yang telah diencerkan dimasukkan ke dalam SPE, ditampung dalam tabung mikrosentrifus. Elusi
dilakukan dengan menggunakan 900 µL aquadest ditampung dalam tabung mikrosentrifus yang sama.
c. Identifikasi PPD dalam eluat hasil clean-up dengan SPE. Eluat disaring dengan menggunakan milipore dan diinjeksikan ke dalam sistem KCKT. Kromatogram dibandingkan dengan kromatogram baku PPD konsentrasi 8
g/mL.
d. Perbandingan antara sampel pewarna rambut oksidatif sebelum dan sesudah
clean-up dengan SPE C18. Sejumlah eluat SPE dan larutan dalam labu takar 10 mL diambil dan diinjeksikan dalam KCKT. Kromatogram keduanya dibandingkan.
7. Optimasi clean-up dengan SPE C18
Sebelum digunakan SPE dialiri dengan 6 mL aquadest. Sejumlah ekstrak sampel yang telah diencerkan dimasukkan ke dalam SPE, ditampung dalam tabung mikrosentrifus. Elusi dilakukan dengan menggunakan aquadest ditampung dalam tabung mikrosentrifus yang sama. Optimasi clean-up dilakukan dengan memvariasi volume loading sampel untuk mengetahui kapasitas SPE mengikat pengotor dalam sampel. Volume loading sampel yang digunakan 100 µL dan 1 mL. Hasil clean-up dianalisis dengan menggunakan KCKT. Kromatogram volume loading sampel dibandingkan jumlah dan besarnya puncak selain puncak PPD.
8. Validasi metode clean-up PPD dengan SPE C18
a. Ekstraksi PPD dari sampel pewarna rambut oksidatif. Sampel pewarna rambut oksidatif yang telah dihomogenkan ditimbang seksama lebih kurang
300 mg, dimasukkan dalam tabung sentrifus, ditambah 10 mL larutan sodium metabisulfit 0,01 M pH 8. Suspensi dikocok dan disentifus selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Cairan supernatan diambil, dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL. Endapan ditambah 10 mL larutan sodium metabisulfit 0,01 M pH 8, sentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Cairan supernatan diambil, dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL. Langkah ini diulang sebanyak dua kali. Supernatan dalam labu takar 50 mL diencerkan dengan larutan sodium metabisulfit 0,01 M hingga batas tanda. Sejumlah 1 mL larutan tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL kemudian diencerkan dengan larutan sodium metabisulfit 0,01 M hingga batas tanda.
b. Validasi metode clean-up PPD dengan SPE C18. Sebelum dilakukan clean-up, ke dalam masing-masing 300 µL ekstrak sampel yang telah diencerkan ditambah 0, 10, 20, 30, 40 dan 50 µL baku PPD di dalam tabung mikrosentrifus. Clean-up dilakukan dengan memasukkan 100, 103, 107, 110, 113 dan 117 µL dari masing-masing tabung mikrosentrifus . Elusi dilakukan dengan 900, 897, 893, 890, 887 dan 883 µL aquadest. Eluat disaring dengan menggunakan milipore dan diinjeksikan ke dalam KCKT. 9. Validasi metode penetapan kadar PPD dengan metode standar adisi
a. Pembuatan kurva baku adisi dalam matriks sampel pewarna rambut. Kurva baku adisi dibuat dengan menambahkan 2, 4, 7, 10, 15 dan 20 mg baku PPD ke dalam masing-masing 300 mg sampel pewarna rambut.
b. Ekstraksi PPD dalam sampel pewarna rambut. Masing-masing sampel dimasukkan dalam tabung sentrifus, ditambah 10 mL larutan sodium metabisulfit 0,01 M pH 8. Suspensi dikocok dan disentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Cairan supernatan diambil, dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL. Endapan ditambah 10 mL larutan sodium metabisulfit 0,01 M pH 8, sentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Cairan supernatan diambil, dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL. Langkah ini diulang sebanyak 2 kali. Supernatan dalam labu takar 50 mL diencerkan dengan larutan sodium metabisulfit 0,01 M hingga batas tanda. Sejumlah 1 mL larutan tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL kemudian diencerkan dengan larutan sodium metabisulfit 0,01 M hingga batas tanda.
c. Clean-up sampel dengan SPEC18. Clean-up dilakukan sesuai dengan hasil optimasi langkah 7.
d. Determinasi PPD dengan KCKT. Eluat disaring dengan menggunakan
milipore dan diinjeksikan ke dalam KCKT.
10. Penetapan kadar para-phenylenediamine (PPD) dalam pewarna rambut dengan metode standar adisi
Sampel pewarna rambut oksidatif yang telah dihomogenkan ditimbang seksama lebih kurang 300 mg, dimasukkan dalam tabung sentrifus, ditambah 10 mL larutan sodium metabisulfit 0,01 M pH 8. Suspensi dikocok dan disentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Cairan supernatan diambil, dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL. Endapan ditambah 10 mL larutan sodium metabisulfit 0,01 M pH 8, sentrifus selama 10 menit dengan kecepatan
3000 rpm. Cairan supernatan diambil, dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL. Langkah ini diulang sebanyak 2 kali. Supernatan dalam labu takar 50 mL diencerkan dengan larutan sodium metabisulfit 0,01 M hingga batas tanda. Sejumlah 1 mL larutan tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL kemudian diencerkan dengan larutan sodium metabisulfit 0,01 M hingga batas tanda. Clean-up dilakukan sesuai dengan hasil optimasi langkah 7. Eluat disaring dengan menggunakan milipore dan diinjeksikan ke dalam KCKT. Penetapan kadar dilakukan dengan metode standar adisi dengan menambahkan 2, 4, 7, 10, 15 dan 20 mg baku PPD ke dalam masing-masing 300 mg sampel pewarna rambut.
G. Analisis Hasil