BAB III. METODE PENELITIAN
D. Tatacara Penelitian
Ekstrak cair yang diperoleh dari PT Sido Muncul dikentalkan dengan menggunakan Vacuum Rotary Evaporator pada suhu 50 0C dan tekanan 72 mbar dan menggunakan oven pada suhu 40 0C.
2. Identifikasi ekstrak rimpang kunyit
Identifikasi ini dilakukan untuk memastikan bahwa ekstrak yang diteliti benar-benar ekstrak rimpang kunyit dengan membandingkan hasilnya dengan Monografi Ekstrak Tumbuhan Obat Indonesia.
Identitas ekstrak rimpang kunyit diamati melalui : a. Pemerian yang meliputi bentuk, warna, bau , dan rasa. b. Pemeriksaan kandungan kurkuminoid secara KLT
Diambil 0,1 g ekstrak kental dilarutkan dalam 1 ml etanol lalu ditotolkan pada fase diam silika gel GF 254 kemudian dikembangkan dalam fase gerak kloroform : etanol : asam asetat (80 : 19,5 : 0,5 v/v) dan kloroform : etanol : asam asetat (95 : 4 : 1 v/v). Jarak pengembangan 10 cm, dideteksi menggunakan sinar UV 254 & 365 nm, sinar tampak, pereaksi semprot asam borat-metanol. Digunakan larutan kurkuminoid baku sebagai pembanding (Wagner, 1984).
24
3. Uji kemurnian ekstrak rimpang kunyit a. Penetapan kadar abu
Kurang lebih 2-3 g ekstrak yang telah ditimbang seksama dimasukkan dalam krus platina/silikat yang telah dipijarkan dan ditara, kemudian ratakan. Pijarkan perlahan hingga arang habis, didinginkan dan ditimbang hingga bobot tetap. Jika dengan cara ini arang tidak dapat dihilangkan maka ditambah dengan air panas, kemudian disaring dengan kertas saring bebas abu. Kertas saring beserta sisa penyaringan dipijarkan dalam krus yang sama hingga bobot tetap. Kadar abu total dihitung terhadap berat ekstrak, dinyatakan dalam % b/b (Anonim, 2004). b. Penetapan kadar abu tidak larut asam
Abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu, dididihkan dengan 25 ml HCl P selama 5 menit. Bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan dan disaring dengan krus kaca masir atau kertas saring bebas abu kemudian dicuci dengan air panas, dipijarkan hingga bobot tetap. Kadar abu yang tidak larut dalam asam terhadap berat ekstrak, dinyatakan dalam % b/b (Anonim, 2004).
4. Penetapan kadar minyak atsiri
Labu alas bulat 1L dihubungkan dengan pendingin dan buret berskala. Ditimbang 10 g ekstrak kental rimpang kunyit dan dimasukkan ke dalam labu, kemudian ditambahkan 600 ml air suling. Labu dipanaskan dengan penangas udara, sehingga penyulingan berlangsung dengan lambat tetapi teratur selama 6 jam. Setelah penyulingan selesai, dibiarkan selama tidak kurang dari 15 menit, volume minyak atsiri pada buret dicatat. Kadar minyak atsiri dihitung dalam % v/b (Anonim, 2004).
5. Penetapan kadar air
Lebih kurang 10 gram ekstrak dimasukkan dan timbang saksama dalam wadah yang telah ditara. Kemudian dikeringkan pada suhu 105 0C selama 5 jam dan ditimbang. Lanjutkan pengeringan dan ditimbang pada jarak 1 jam sampai perbedaan antara 2 penimbangan berturut-turut tidak lebih dari 0,25 %. Bobot yang hilang setelah pengeringan dikurangi dengan bobot minyak atsiri yang terkandung dalam lebih kurang 10 gram ekstrak. Kadar air dihitung dalam % b/b (Anonim, 1977).
6. Penetapan kadar kurkuminoid a. Pembuatan larutan stok
Kurang lebih 10,0 mg kurkuminoid baku yang ditimbang seksama dilarutkan dalam aseton sampai 50 ml.
b. Pembuatan larutan intermediet
Larutan baku dengan kadar 20 mg % diambil sebanyak 5 ml dan dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml, kemudian diencerkan dengan aseton sampai tanda sehingga diperoleh larutan intermediet kurkuminoid dengan kadar 4 mg %.
c. Penetapan operating time (OT)
Larutan intermediet dengan kadar 4 mg % diambil 0,8 ml dan dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml, kemudian diencerkan dengan aseton sampai tanda dan ditambahkan dengan 50 mg asam borat dan 50 mg asam oksalat. Larutan kurkuminoid dengan konsentrasi 0,128 mg % ini kemudian dibaca serapannya pada panjang gelombang maksimum teoritis yaitu 430 nm.
26
d. Penetapan panjang gelombang maksimum
Larutan intermediet dengan kadar 4 mg % diambil 0,2 ml; 0,8 ml; dan 3,2 ml dan dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml, kemudian diencerkan dengan aseton sampai tanda dan ditambahkan dengan 50 mg asam borat dan 50 mg asam oksalat. Ketiga larutan kurkuminoid dengan konsentrasi 0,032 mg %; 0,128 mg %; 0,512 mg % ini kemudian dibaca serapannya pada operating time dan pada panjang gelombang 400 nm sampai 450 nm.
e. Pembuatan kurva baku
Larutan intermediet dengan kadar 4 mg % diambil 0,2 ml; 0,4 ml; 0,8 ml; 1,6 ml; dan 3,2 ml dan dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml, kemudian diencerkan dengan aseton sampai tanda sehingga diperoleh konsentrasi seri larutan kurva baku sebesar 0,032 mg %; 0,064 mg %; 0,128 mg %; 0,256 mg %; 0,512 mg %. Lalu ditambahkan dengan 50 mg asam borat dan 50 mg asam oksalat. Seri kadar larutan ini kemudian dibaca serapannya pada operating time dan pada panjang gelombang maksimum. Kemudian digambar kurva hubungan antara konsentrasi larutan dengan serapan.
f. Penetapan recovery, kesalahan sistemik dan kesalahan acak
Larutan intermediet dengan kadar 4 mg % diambil 0,2 ml; 0,4 ml; 0,8 ml; 1,6 ml; dan 3,2 ml dan dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml, kemudian diencerkan dengan aseton sampai tanda dan ditambahkan dengan 50 mg asam borat dan 50 mg asam oksalat. Kelima larutan kurkuminoid ini kemudian dibaca serapannya pada operating time dan pada panjang gelombang maksimum, kemudian dihitung kadarnya menggunakan persamaan kurva baku.
1) Penentuan recovery (perolehan kembali). Recovery dihitung dari kadar yang terukur pada kurva baku dibandingkan dengan kadar yang diketahui dikalikan 100 %.
2) Penghitungan kesalahan sistemik. Rumus kesalahan sistemik = 100 – P%
3) Penghitungan kesalahan acak. Kesalahan acak diukur dengan cv (coeficient variancy)
g. Penetapan kadar kurkuminoid dalam sampel
Kadar kurkuminoid total ditetapkan sebagai kompleks kurkumin-asam borat dengan cara spektrofotometri sinar tampak pada panjang gelombang maksimum. Ekstrak yang mengandung lebih kurang 50 mg kurkuminoid total dimasukkan ke dalam beaker glass, ditambahkan aseton, diaduk hingga rata lalu disaring. Filtrat dimasukkan ke dalam labu ukur 250 mL ditambah aseton melalui kertas saring hingga tanda batas. Diambil 2 mL dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL ditambah aseton. Diambil 1 mL dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL, kemudian ditambah aseton dan ditambah 50 mg asam borat dan 50 mg asam oksalat, dibiarkan selama operating time (OT). Kadar kurkuminoid dihitung dalam % b/b dengan perbandingan kurva baku. (tidak kurang dari 33,9 %) (Anonim, 2004).
28