BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
B. Pembuatan Larutan Baku
50,0 mL sehingga didapatkan konsentrasi sebesar 400 µg/mL, kemudian dibuat larutan seri dengan 3 konsentrasi berbeda yaitu 20; 60; dan 100 µg/mL dengan mengencerkan 0,5; 1,5; dan 2,5 mL larutan stok tersebut dengan metanol hingga 10,0 mL.
5. Pembuatan larutan baku salbutamol sulfat
a. Pembuatan larutan stok salbutamol sulfat. Sejumlah lebih kurang 10,0 mg salbutamol sulfat ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam labu takar 50,0 mL kemudian dilarutkan dengan metanol hingga tanda batas sehingga didapatkan konsentrasi sebesar 200 μg/mL.
b. Pembuatan larutan intermediate salbutamol sulfat. Larutan stok diambil sejumlah 0,5 mL, dimasukkan ke dalam labu takar 5,0 mL kemudian diencerkan dengan metanol hingga tanda batas sehingga didapatkan
konsentrasi sebesar 20 μg/mL.
6. Pembuatan larutan baku guaifenesin
Sejumlah lebih kurang 22,5 mg guaifenesin ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam labu takar 25,0 mL kemudian diencerkan dengan metanol hingga tanda batas sehingga didapatkan konsentrasi sebesar
900 μg/mL.
7. Pembuatan seri larutan baku campuran salbutamol sulfat dan guaifenesin Larutan intermediate salbutamol sulfat dan larutan baku guaifenesin masing-masing diambil sejumlah 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; dan 0,8 mL, dimasukkan ke dalam labu takar 10,0 mL secara berurutan dari volume kecil hingga besar, kemudian diencerkan dengan metanol hingga tanda batas sehingga didapatkan konsentrasi campuran salbutamol sulfat dan guaifenesin berturut-turut sebesar (0,8 dan 36,0); (1,0 dan 45,0); (1,2 dan 54,0); (1,4 dan 63,0); dan
(1,6 dan 72,0) μg/mL. Larutan disaring dengan millipore dan didegassing dengan ultrasonicator selama 15 menit, kemudian diinjeksikan ke dalam sistem KCKT fase terbalik yang telah dioptimasi (Mulyawan, 2014).
8. Penetapan panjang gelombang (λ) maksimum salbutamol sulfat dan guaifenesin dengan spektrofotometer UV-Vis
Masing-masing konsentrasi larutan seri baku salbutamol sulfat 100,0;
300,0; dan 600,0 μg/mL dan guaifenesin 20,0; 60,0; dan 100,0 μg/mL diukur serapannya pada panjang gelombang 200-400 nm dengan spektrofotometer UV-Vis. Spektrum yang dihasilkan akan menunjukkan panjang gelombang maksimum yang akan digunakan pada sistem KCKT.
9. Preparasi sampel
a. Pembuatan larutan stok sampel. Sediaan sirup merek “X” mengandung 1,20 mg salbutamol sulfat dan 50,0 mg guaifenesin tiap 5,0 mL sediaan, diambil sejumlah 0,25 mL, dimasukkan ke dalam labu takar 5,0 mL kemudian diencerkan dengan metanol hingga tanda batas sehingga didapatkan konsentrasi salbutamol sulfat dan guaifenesin sebesar (12,0 dan 500,0) μg/mL.
b. Pembuatan larutan sampel. Larutan stok sampel diambil sejumlah 0,4; 0,5; dan 0,6 mL, masing-masing dimasukkan ke dalam labu takar 5,0 mL kemudian diencerkan dengan metanol hingga tanda batas sehingga didapatkan konsentrasi salbutamol sulfat dan guaifenesin berturut-turut sebesar (0,96 dan
40,0); (1,20 dan 50,0); dan (1,44 dan 60,0) μg/mL. Larutan disaring dengan millipore dan didegassing dengan ultrasonicator selama 15 menit, kemudian
diinjeksikan ke dalam sistem KCKT fase terbalik yang telah dioptimasi (Mulyawan, 2014).
10. Preparasi adisi baku dalam sampel
Larutan stok sampel diambil sejumlah 0,4; 0,5; dan 0,6 mL, masing-masing dimasukkan ke dalam labu takar 5,0 mL, kemudian ditambahkan 0,03 mL larutan intermediate salbutamol sulfat dan 0,03 mL larutan baku guaifenesin ke dalam masing-masing labu takar dan diencerkan dengan metanol hingga tanda batas. Larutan disaring dengan millipore dan didegassing dengan ultrasonicator selama 15 menit, kemudian diinjeksikan ke dalam sistem KCKT fase terbalik yang telah dioptimasi (Mulyawan, 2014).
11. Validasi metode analisis
a. Penentuan selektivitas. Sejumlah masing-masing 20,0 μL larutan baku campuran salbutamol sulfat dan guaifenesin serta larutan sampel sediaan merek “X” yang telah disaring dengan millipore dan didegassing selama 15 menit diinjeksikan ke dalam sistem KCKT fase terbalik yang telah dioptimasi (Mulyawan, 2014). Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.
b. Penentuan linieritas. Sejumlah masing-masing 20,0 μL larutan baku campuran salbutamol sulfat dan guaifenesin dengan konsentrasi (0,8 dan 36,0); (1,0 dan 45,0); (1,2 dan 54,0); (1,4 dan 63,0); dan (1,6 dan 72,0) μg/mL yang telah disaring dengan millipore dan didegassing selama 15 menit
diinjeksikan ke dalam sistem KCKT fase terbalik yang telah dioptimasi (Mulyawan, 2014). Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.
c. Penentuan akurasi dan presisi adisi baku dalam sampel. Sejumlah 20,0 μL larutan sampel dan larutan sampel yang ditambah campuran baku salbutamol sulfat dan guaifenesin (sampel adisi) yang telah disaring dengan millipore dan didegassing selama 15 menit diinjeksikan ke dalam sistem KCKT fase terbalik yang telah dioptimasi (Mulyawan, 2014). Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.
d. Penentuan rentang. Rentang merupakan interval antara kadar terendah sampai tertinggi analit yang dapat diukur secara kuantitatif menggunakan metode analisis tertentu dan menghasilkan linieritas, akurasi, dan presisi yang baik (Rohman, 2009).
12. Uji kestabilan larutan baku
Larutan baku salbutamol sulfat dengan konsentrasi 0,8; 1,2; dan 1,6 μg/mL serta larutan baku guaifenesin dengan konsentrasi 36,0; 54,0; dan 72,0 μg/mL yang telah disaring dengan millipore dan didegassing dengan ultrasonicator selama 15 menit, diinjeksikan ke dalam sistem KCKT fase terbalik yang telah dioptimasi (Mulyawan, 2014) dalam hari yang berbeda untuk dilihat seberapa besar perubahan respon yang dihasilkan dari masing-masing larutan baku. Respon pada hari pertama digunakan sebagai acuan untuk dibandingkan dengan respon pada hari berikutnya. Nilai % perubahan yang diperbolehkan yaitu < 2,0% (Ahuja dan Dong, 2005).
G. Analisis Hasil 1. Selektivitas
Selektivitas ditentukan dengan daya resolusi dari puncak kromatogram yang dihasilkan oleh baku campuran salbutamol sulfat dan guaifenesin dan kemampuan metode KCKT fase terbalik yang telah dioptimasi untuk memisahkan salbutamol sulfat dengan guaifenesin dalam sampel sediaan sirup merek “X”. Selektivitas ditentukan dengan parameter resolusi (Rs) dengan rumus perhitungan:
Resolusi (Rs) = (tR2-tR1) 1⁄2 (W1 W2) Keterangan : Rs = resolusi
tR1 = waktu retensi puncak analit pertama tR2 = waktu retensi puncak analit kedua W1 = lebar dasar puncak pertama W2 = lebar dasar puncak kedua
Nilai Rs = 1,0 menunjukkan puncak kromatogram baku tidak terpisah sampai ke baseline, nilai Rs = 1,5 menunjukkan puncak telah terpisah sampai baseline, dan nilai Rs > 1,5 menunjukkan pemisahan puncak telah sempurna satu sama lain (Rohman, 2007).
2. Linieritas
Linieritas dinyatakan dengan koefisien korelasi (r). Konsentrasi larutan baku salbutamol sulfat dan guaifenesin yang diperoleh diplotkan terhadap luas area pada kromatogram sehingga diperoleh nilai koefisien korelasi (r) dari persamaan y = bx + a. Rentang ditentukan dari kadar larutan baku konsentrasi terkecil hingga terbesar. Persyaratan linieritas yang dapat
diterima adalah jika memenuhi nilai koefisien korelasi (r) ≥ 0,998 (Kazakevich dan Lobrutto, 2007).
3. Akurasi
Akurasi metode analisis dinyatakan dengan nilai % Recovery yang dihitung dari konsentrasi terukur dibandingkan dengan konsentrasi teoritis (kadar sebenarnya) dikalikan 100%. Akurasi dikatakan baik bila memiliki nilai % Recovery antara 98,0-102,0% untuk kadar analit 10-100% (Gonzalez dan Herrador, 2007). Nilai % Recovery adisi baku dalam sampel dapat dihitung dengan cara:
% Recovery = jumlah baku dan sampel terukur – jumlah sampel terukur
jumlah baku teoritis x 100%
4. Presisi
Presisi dihitung sebagai standar deviasi relatif (RSD) atau koefisien variasi (KV), dengan rumus perhitungan:
KV = standar deviasi (SD)
rata-rata (X̅) x 100%
Keterangan : KV = koefisien variasi ̅ = rata-rata kadar SD = standar deviasi
Suatu metode dikatakan memiliki keterulangan/presisi yang baik jika memiliki nilai KV ≤ 2,0% untuk kadar analit 100% (Gonzalez dan Herrador, 2007).
5. Rentang
Rentang merupakan interval antara kadar terendah sampai tertinggi analit yang dapat diukur secara kuantitatif menggunakan metode analisis tertentu dan menghasilkan linieritas, akurasi, dan presisi yang baik (Rohman, 2009).
38
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN A. Pembuatan Fase Gerak
Sistem kromatografi yang digunakan pada penelitian ini merupakan sistem kromatografi fase terbalik, karena menggunakan fase gerak yang bersifat lebih polar daripada fase diamnya (ODS/C18). Jenis dan komposisi fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini adalah campuran metanol dan 0,01 M bufer kalium dihidrogen fosfat pH 3 dengan perbandingan (40:60), kecepatan alir fase gerak 1 mL/min, dan dengan indeks polaritas sebesar 8,16 (Mulyawan, 2014). Sistem elusi pada penelitian ini adalah isokratik karena menggunakan campuran lebih dari satu komponen fase gerak dengan perbandingan tetap selama proses elusi berlangsung (komposisi dan polaritas fase gerak tetap).
Metanol dipilih sebagai fase gerak karena dapat melarutkan kedua zat analit (salbutamol sulfat dan guaifenesin) dengan baik. Metanol juga merupakan pelarut organik yang umum dan sering digunakan pada sistem KCKT fase terbalik. Penggunaan bufer fosfat bertujuan untuk memberikan pH yang relatif konstan dan mengakibatkan waktu retensi senyawa menjadi reprodusibel. Tujuan fase gerak dikondisikan pada pH 3 adalah untuk mengubah seluruh salbutamol sulfat ke dalam bentuk ion sehingga interaksinya dengan fase diam dan fase gerak menjadi seragam. Apabila ada sebagian yang terion dan sebagian dalam bentuk molekul dapat menyebabkan interaksi salbutamol dengan fase diam dan fase gerak berbeda-beda, sehingga bentuk puncak kromatogram menjadi tailing. Guaifenesin merupakan senyawa yang bersifat asam lemah dan pada pH 3 seluruh
guaifenesin dalam bentuk molekul, sehingga interaksinya dengan fase diam dan fase gerak menjadi seragam dan waktu retensi yang relatif tetap dari kedua zat analit tersebut.
Sebelum digunakan, komponen fase gerak disaring terlebih dahulu menggunakan penyaring Whatman dengan bantuan pompa vakum untuk menyaring partikel-partikel yang dapat menyumbat kolom, kemudian didegassing dengan ultrasonicator untuk menghilangkan gelembung udara yang dapat mengganggu pembacaan hasil dalam instrumen KCKT.
B. Pembuatan Larutan Baku
Baku salbutamol sulfat yang digunakan pada penelitian ini merupakan working standard dengan kemurnian 98,83% yang didapatkan dari PT. Ifars Pharmaceutical Laboratories. Baku guaifenesin yang digunakan juga merupakan working standard dengan kemurnian 99,88% yang didapatkan dari Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional, sehingga kedua baku tersebut terjamin kemurniannya.
Larutan baku salbutamol sulfat dan guaifenesin dibuat dalam konsentrasi tertentu dengan menggunakan pelarut metanol. Pemilihan pelarut sangat penting karena salah satu syarat utama pelarut yaitu dapat melarutkan analit dengan baik. Syarat lainnya antara lain: inert, murni, dan dapat bercampur dengan fase gerak. Metanol dipilih karena memenuhi syarat-syarat tersebut. Metanol yang digunakan adalah metanol pro analysis (p.a) dengan kemurnian tinggi, sehingga diharapkan mengurangi adanya pengotor yang mengganggu hasil analisis.
Larutan baku yang dibuat pada penelitian ini terdiri dari tiga macam, yaitu: larutan stok, larutan intermediate, dan larutan seri baku. Pada penentuan panjang gelombang, larutan stok salbutamol sulfat dibuat dengan konsentrasi 1000 μg/mL dan larutan seri dengan tiga konsentrasi berbeda yaitu 100, 300, dan 600 μg/mL. Pada guaifenesin dibuat larutan stok dengan konsentrasi 400 μg/mL dan larutan seri dengan tiga konsentrasi berbeda yaitu 20, 60, dan 100 μg/mL, kemudian diukur serapannya pada panjang gelombang UV (200-400 nm).
Validasi sistem KCKT yang telah dioptimasi menggunakan larutan baku dengan konsentrasi yang berbeda dari larutan baku pada penentuan panjang gelombang. Larutan stok salbutamol sulfat dibuat dengan konsentrasi 200 μg/mL, larutan intermediate 20 μg/mL, dan larutan seri baku dibuat dalam lima konsentrasi berbeda yaitu 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; dan 1,6 μg/mL. Larutan stok guaifenesin dibuat dengan konsentrasi 900 μg/mL dan larutan seri baku dengan lima konsentrasi berbeda yaitu 36, 45, 54, 63, dan 72 μg/mL. Untuk selektivitas digunakan baku campuran dengan konsentrasi salbutamol sulfat 1,2 μg/mL dan guaifenesin 80 μg/mL. Untuk akurasi dan presisi adisi baku digunakan kedua baku dengan konsentrasi salbutamol sulfat 0,12 μg/mL dan guaifenesin 5,4 μg/mL.
Larutan baku yang telah dipersiapkan, disaring dengan menggunakan millipore dengan tujuan untuk menghilangkan partikel-partikel yang dapat menyumbat kolom dan mengkontaminasi fase diam. Setelah disaring larutan baku harus didegassing sebelum diinjeksikan ke dalam sistem KCKT dengan tujuan
untuk menghilangkan gelembung udara yang dapat mengganggu pembacaan hasil oleh detektor dalam instrumen KCKT.