BAB III METODOLOGI PENELITIAN
E. Tatacara Penelitian
Determinasi tanaman dadap serep dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimian, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Pengumpulan bahan
Tanaman dadap serep diperoleh dari kebun tanaman obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma di Yogyakarta. Pengumpulan pada musim kemarau bulan Agustus tahun 2012. Pemanenan dilakukan pada tanaman saat pagi hari.
3. Preparasi sampel
Daun dadap serep segar dicuci dengan air mengalir, dikering-anginkan, dan ditimbang sebanyak 1 kg, kemudian dihaluskan dengan grinder. Ketika dihaluskan, daun tersebut ditambahkan sedikit cairan penyari (etanol 76%). Simplisia yang telah dihaluskan ditimbang 100 g dan dituang kedalam bejana maserasi, ditambah etanol 76% sampai terendam sempurna, dan dicampur homogen. Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama dua hari. Filtrat diperoleh melalui penyaringan dengan corong Buchner. Ampas penyaringan diremaserasi dengan etanol 76% secukupnya selama dua hari. Kemudian filtratnya dicampurkan dengan filtrat terdahulu. Campuran filtrat kemudian disaring. Lalu hasil penyaringan filtrat diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak etanol daun dadap serep.
Ekstrak etanol daun dadap serep ditambah 300 mL air hangat dan diekstraksi cair-cair menggunakan wasbensin dengan perbandingan larutan ekstrak : wasbensin (1:1 v/v), kemudian didiamkan sampai terpisah sempurna. Fase air akan berada pada bagian bawah, sedangkan fase wasbensin berada pada bagian atas.
Dari hasil partisi diperoleh dua fraksi, yaitu fraksi wasbensin dan fraksi air. Selanjutnya fraksi air diekstraksi cair-cair lagi menggunakan etil asetat dengan perbandingan larutan fraksi air : etil asetat (1:1 v/v) sehingga didapatkan fraksi air dan etil asetat. Setelah dipisahkan fraksi etil asetat diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator. Hasil fraksi tersebut kemudian ditutup dengan plastik serta aluminium foil lalu disimpan dalam desikator. Lalu hasil fraksi tersebut digunakan untuk dianalisis lebih lanjut.
4. Pembuatan larutan pembanding dan uji
a. Pembuatan larutan DPPH
Sejumlah DPPH dilarutkan ke dalam metanol p.a sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.
b. Pembuatan larutan stok kuersetin
Sebanyak 2,5 mg kuersetin dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL.
c. Pembuatan larutan pembanding
Diambil sebanyak 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 mL larutan stok kuersetin, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar kuersetin sebesar 5; 7,5; 10; 12,5; dan 15 g/mL.
d. Pembuatan larutan uji
1. Larutan uji untuk aktivitas antioksidan
Sebanyak 12,5 mg hasil fraksi etil asetat ditimbang, lalu di add metanol p.a sampai 25,0 mL. Diambil sebanyak 1,5; 3; 4,5; 6; 7,5 mL larutan tersebut, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 75; 150; 225; 300; 375 g/mL.
2. Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total
Sebanyak 5,0 mg hasil fraksi etil asetat ditimbang, lalu ditambahkan metanol p.a sampai diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 500,0 µg/mL.
e. Pembuatan larutan asam galat
Dibuat larutan asam galat dengan konsetrasi 500 µg/mL dalam akuades : methanol p.a (1:1). Diambil sebanyak 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; dan 3,0 mL larutan tersebut, kemudian ditambahkan akuades : metanol p.a (1:1) sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50; 75; 100; 125; dan 150 µg/mL.
5. Uji pendahuluan
a. Uji fenolik
Sejumlah 0,5 mL larutan uji 500,0 µg/mL dan larutan pembanding asam galat 150,0 µg/mL dimasukan ke dalam 3 tabung reaksi. Lalu ditambahkan 5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v) kedalam tabung reaksi. Diamkan selama 10 menit. Tambahkan 4 mL larutan natrium karbonat 1 M. Kemudian amati warna larutan tersebut.
b. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan
Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukan ke dalam masing-masing tiga tabung reaksi. Ditambahkan masing-masing dengan 1 mL metanol p.a, larutan pembanding kuersetin 37,5 g/mL , dan larutan uji 200,0 g/mL. Selanjutnya, larutan tersebut ditambahkan dengan 3 mL metanol p.a. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Setelah 30 menit, amati warna pada larutan tersebut.
6. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan
a. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
Pada 3 labu ukur 10 mL, dimasukan masing-masing 0,5; 1,0; 1,5 mL larutan DPPH. Ditambahkan larutan tersebut dengan metanol p.a hingga tanda batas sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,020; 0,040; dan 0,080. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Diamkan selama OT. Lalu dilakukan scanning panjang gelombang serapan maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400-600 nm.
b. Penentuan operating time (OT)
Sebanyak 2 mL larutan DPPH dimasukan kedalam masing-masing 3 labu ukur 10 mL, ditambahkan masing-masing dengan 2 mL larutan pembanding kuersetin 5; 10 dan 15 g/mL. Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang serapan maksimum selama 1 jam. Dilakukan demikian juga untuk larutan uji 75; 225; 375 g/mL.
7. Uji aktivitas antioksidan
Uji aktivitas antioksidan ditentukan dengan menggunakan metode spoktrofotometri sesuai dengan penelitian Rollando (2012).
a. Pengukuran absorbansi larutan DPPH (kontrol)
Pada labu ukur 10 mL, dimasukan sebanyak 2 mL larutan DPPH. Ditambahan larutan tersebut dengan metanol p.a hingga tanda batas. Kemudian larutan tersebut dibaca absorbansinya pada saat OT dan panjang gelombang maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak 3 kali. Larutan ini digunakan sebagai kontrol untuk menguji larutan pembanding dan uji.
b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji
Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup kemudian ditambah dengan 1 mL larutan pembanding dan uji pada berbagai seri konsentrasi telah dibuat. Selanjutnya larutan tersebut ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik dan diamkan selama OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi. Pengujian dilakukan dengan 3 kali replikasi.
c. Validasi metode uji aktivitas antioksidan
Hasil dari prosedur 7 a dan b, divalidasi presisi (%CV), spesifisitas (spektra kontrol), dan linearitas (nilai r).
% CV = � � � � �� �
d. Estimasi aktivitas antioksidan
Hasil dari prosedur 7 a dan b, dihitung nilai % IC dan IC50 untuk kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep.
8. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total
Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total ditentukan dengan menggunakan metode spektrofotometri.
a. Penentuan OT
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 g/mL ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Setelah itu, dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 750 nm selama 30 menit.
b. Penentuan panjang gelombang maksimum
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 g/mL ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:1 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Diamkan selama OT, absorbansinya dibaca pada maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 600-800 nm.
9. Penetapan kandungan fenolik total
a. Pembuatan kurva baku asam galat
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 75; 100; 125; dan 150 g/mL ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:1 v/v). Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M.
Setelah OT, absorbansinya dibaca pada maksimum terhadap blanko yang terdiri atas akuades : metanol p.a (1:1), reagen Folin-Ciocalteu dan larutan natrium karbonat 1 M. Pengerjaan dilakukan 3 kali.
b. Validasi metode penetapan kandungan fenolik total
Hasil dari prosedur 9 a , divalidasi presisi (%CV), spesifisitas (spektra kontrol), dan linearitas (nilai r).
% CV = � � � � �� �
− � x 100%
c. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji
Diambil 0,5 mL larutan uji 500 g/mL, lalu masing-masing dimasukan ke dalam labu takar 10,0 mL dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku asam galat . Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai gram ekivalen asam galat (mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat). Lakukan 3 kali replikasi.
