Teknik pemisahan bertujuan untuk memisahkan komponen yang akan ditentukan berada dalam keadaan murni, tidak tercampur dengan komponen-komponen lainnya. Ada 2 jenis teknik pemisahan yaitu:
1. Pemisahan kimia adalah suatu teknik pemisahan yang berdasarkan adanya perbedaan yang besar dari sifat-sifat fisika komonen dalam campuran yang dipisahkan.
2. Pemisahan fisika adalah suatu tenik pemisahan yang didasarkan pada perbedaan-perbedaan kecil dari sifat-sifat fisika antara senyawwa-senyawa yang termasuk dalam suatu golongan (Muldja, 1995).
2.5.1 Ekstraksi
Ragam ekstraksi yang tepat sudah tentu bergantung pada tekstur dan kandungan air dalam kandungan air dalam tumbuhan yang diekstraksi dan pada jenis senyawa yang diisolasi. Alkohol adalah pelarut serbaguna yang baik untuk ekstraksi pendahuluan. Ekstraksi dianggap selesai bila tetesan terakhir memberikan reaksi negatif terhadap senyawa yang diekstraksi. Untuk mendapatkan larutan eksrak diuapkan dengan menggunakan alat rototarievaporator (Harborne, 1987).
Beberapa metode ekstraksi dapat digunakan untuk mengekstrak atau konstituen dalam suatu bahan tanaman, yang diantaranya adalah maserasi, perkolasi, ekstaraksi sokletasi, ekstraksi dengan refluks, dan didestilasi uap dalam ekstraksi padat-cair, bahan tanaman ditempatkan dalam sebuah wadah, dan dibiarkan terjadi kntak dengan pelarut. Proses yang terjadi dari seluruh proses dinamis tersebut dapat diuraikan menjadi beberapa tahap, yaitu tahap pertama pelarut akan berdifusi keluar dari sel bersama dengan metabolit (Sarker, 2006).
Tiga metode dasar pada ekstraksi car-cair adalah ekstraksi bertahap (batch), ekstraksi kontinyu, dan ekstraksi counter current. Ekstraksi bertahap adalah cara pelarut pengekstraksi yang tidak bercampur dengan pelarut semula kemudian dilakukan pengocokan sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi zat yang akan diekstraksi pada kedua lapisan, didiamkan dan dipisahkan (Khopkar, 1990).
2.5.2 Partisi
Metode pemisahan yang mungkin paling sederhana adalah partisi, yang banyak digunakan sebagai tahap awal pemurnian ekstrak. Partisi menggunakan dua pelarut tak bercampur yang ditambahkan kedalam ekstrak tersebut, hal ini dapat dilakukan secara terus menerus dengan menggunakan dua pelarut yang tak bercampur yang kepolarannya meningkat. Partisi biasanya dilakukan melalui dua tahap:
1. Air/petroleum eter ringan (heksan) untuk menghasilkan fraksi nonpolar dilaisan organik
2. Air/diklorometan atau air/etil asetat untuk membuat fraksi agak polar dilapisan organik. Ini merupakan metode pemisahan yang mudah dan mengendalikan kelarutan bahan alam dan bukan interaksi fisik dengan medium lan (Heinrich et al, 2009).
2.5.3 Kromatografi
Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli botani Rusia Michael Tswett pada tahun 1903 untuk memisahkan pigmen berwarna dalam tanaman dengan cara perkolasi ekstrak petroleum eter dalam kolom gelas yang berisi kalsium karbonat (CaCO3). Teknik kromatorafi telah berkembang dan telah digunakan untuk memisahkan dan mengkuantifikasi berbagai macam komponen yang kompleks, baik komponen organik maupun komponen anorganik (Gandjar dkk, 2007).
Kromatografi merupakan teknik untuk pemisahan dan pemisahan dari komponen solut dalam sebuah campuran. Teknik ini dilihat berdasarkan pemisahan warna atau noda campuran antara dua fase, yakni fase diam dan fase gerak pada sebuah permukaan material pendukung yang bersifat inert ataupun padatan
Ada 4 tipe kromatografi yakni:
1. Kromatografi Kolom 2. Kromatografi Lapis Tipis 3. Gas Kromatografi
4. Kromatografi Kertas
2.5.3.1 Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis merupakan metode fisikokimia yang didasarkan atas penyerapan, partisi (pembagian), atau gabungannya. Lapisan pemisah tipis yang terdiri atas butir penyerap atau penyangga dilapiskan pada lempeng kaca, logam dan in lain-lain. Untuk mendapatkan kondisi jenuh dalam bejana kromatografi, dinding bejana dilapisi dengan lembaran kertas saring, fase gerak setinggi 5-10 mm. Bejana ditutup dan dibiarkan selama satu jam pada suhu 20-25 oC.
Dalam pemilihan pelarut yang perlu diperhatikan adalah:
1. Pelarut harus murni jika perlu disuling kembali
2. Campuran pelarut hanya boleh digunakan maksimum dua atau tiga kali 3. Komposisi campuran dapat berubah karena penyerapan atau penguapan 4. Komponen-komponen campuran pelarut dapat bereaksi satu sama lain
5. Eter atau kloroform yang digunakan mengandung 0,5% - 1% etanol sebagai stabilisator
Adsorben umum yang digunakan antara lain silika gel, alumina, tanah diatom, dan serbuk selulosa. Resin penukar ion digunakan untuk penggunaan khusus, silika gel bersifat asam dan dapat digunakan untuk kromatografi partisi dan penyerapan. Alumina bersifat basa dan terutama digunakan kromatografi penyerapan. Tanah atom bersifat netral dan digunakan sebagai penyangga untuk kromatografi partisi (Harmita, 2015).
Faktor retedasi merupakan parameter karakteristik kromatografi kerta dan kromatografi lapis tipis. Harga rf adalah ukuran kecepatan migrasi suatu komponen pada kromatografi, rf didefiniikan sebagai perbandingan jarak yang ditempuh komponen jarak yang ditempuh pelarut atau fase gerak.
e p p e
Faktor-faktor yang mempengaruhi pergerakan noda dalam KLT yang juga mempengaruhi harga Rf:
1. Struktur kimia dari senyawa yang dipisahkan 2. Sifat dari penyerap dan derajat aktivasi 3. Tebal kerataan dan lapisan penyerap 4. Pelarut dan derajat kemurnian fase gerak 5. Derajat kejenuhan dari uap
6. Jumlah cuplikan yang digunakan 7. Suhu
8. Kesetimbangan (Sastrohamidjojo, 1991) 2.5.3.2 Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi terbaik untuk pemisahan dalam jumlah besar (lebih dari 1 gram). Kromatografi kolom biasanya dibuat dengan menuangkan suspense fasa diam dan pelarut yang sesuai kedalam kolom dan dibiarkan memadat. Selanjutnya pelarut diturunkan sampai tepat pada bagian atas peyerap dan cuplikan yang akan dipisahkan diletakkan ada bagian atas
penyerap kemudian fasa gerak dimasukkan dan dibiarkan mengalir melewati kolom dan komponen campuran turun berupa pita dengan laju yang berlainan kemudian hasil pemisahan dari kolom dikumpulkan sebagai fraksi. Kromatografi kolom merupakan bentuk kromatografi cair (Gritter, 1991).
Adapun syarat adsorben yang digunakan iyalah sebagi berikut:
1. Tidak larut dalam pelarut yang digunakan 2. Inert (tidak bereaksi dengan sampel)
3. Cukup aktif sehingga memungkinkan perambatan sampel 4. Tidak berwarna agar pemisahan dapat diamati
5. Memungkinkan fase gerak mengalir dengan baik (Harmita, 2015)
2.5.3.3 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Kromatografi Lapis Tipis Preparatif merupakan metode pemisahan yang sebagian besar pemakaiannya dalam jumlah mg . Cuplikan seanyak 10-10 mg dapat dipisahkan dengan lapisan silika gel atau aluminium oksida 20 x 20 cm yang tebalnya 1 mm. Kebanyakan penyerap KLTP mengandung indikator fluoresensi yang membantu mendeteksi kedudukan pita yang terpisah sepanjang senyawa yang dipisahkan menyerap sinar UV. Pita yang telah diketahui keduduknnya dikerok dari plat dengan menggunakan spatula. Senyawa harus sekitar 5 ml untuk senyawa 1 gram penyerap. Harus diperhatikan bahwa semakin lama senyawa berkontak dengan penyerap makin besar kemungkinan penguraian (Hostettmann et al, 1995).