METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan selama 3 bulan, pada bulan April-Juni 2010 dan bertempat di Badan Tenaga Nuklir Nasional, Pasar Jumat, Jakarta dan di Pusat Laboratorium Terpadu UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
3.2. Alat dan Bahan 3.2.1. Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah cawan petri, erlenmeyer, tabung reaksi, rak tabung reaksi, beaker glass, yellow tube, tabung Eppendorf, short plate, spacer plate, spatula, ose, inkubator, timbangan analitik, mikropipet, refrigerator, sentrifus, vortex, pH meter, laminar air flow, spektrofotometer Uv-vis bermerk Ionic Genesys 2, GCMS bermerk Shimadzu dengan tipe QP2010S, mini tank horizontal elektroforesis system, sisir pembentuk sumuran (comb), aluminium foil, plastik tahan panas dan bunsen.
3.2.2. Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tujuh isolat kapang dari pertambangan batubara Sumatera Selatan, tisu, kapas, alkohol 75 %, minyak spiritus, batubara, akuades, NaCl 0,85%, medium Potato Dextrose Agar (PDA), medium Minimal Salt Solution+ (MSS+), larutan Lowry I dan II (Lampiran 3), larutan elektroforesis SDS PAGE (Lampiran 4),
26 3.3.Prosedur Kerja
3.3.1. Persiapan dan Sterilisasi Alat
Alat-alat yang digunakan dibersihkan, lalu disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121oC dan tekanan 2 atm selama 15 menit. Peralatan yang tidak tahan panas dapat disterilkan dengan menggunakan alkohol 70%.
3.3.2. Persiapan Serbuk Batubara
Batubara dihaluskan menggunakan mortar secara aseptik di dalam
Laminar Air Flow Cabinet (LAFC), kemudian disaring menggunakan saringan berukuran 0,2 mm (200 mesh). Serbuk batubara yang telah siap disimpan di dalam cawan petri steril untuk digunakan sebagai sumber isolasi kapang indigenous
batubara lignit Sumatera Selatan dan campuran untuk pembuatan medium isolasi dan seleksi kapang hasil isolasi tersebut (Silva et al., 2007).
3.3.3. Pembuatan Medium Potato Dextrose Agar (PDA)
Sebanyak 7,8 g PDA bubuk dilarutkan dalam aquades 200 ml pada erlenmeyer. Kemudian dipanaskan dengan menggunakan hot plate dan magnetic stirer hingga larut. Medium PDA tersebut dimasukkan kedalam autoklaf 2 atm dengan suhu 121oC selama 15 menit setelah itu didinginkan dan dituang pada cawan petri.
3.3.4. Pembuatan Medium Minimal Salt Solution+ (MSS+)
Pembuatan medium MSS+ dibuat dengan menyiapkan medium MSS sebanyak 250 ml kemudian ditambahkan sukrosa 2,5 g lalu dihomogenkan. Medium MSS+ dalam erlenmeyer dan tabung reaksi disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan 2 atm selama 15 menit. Medium
27 Minimal Salt (MMS) dibuat dengan cara menimbang sebanyak 0,52 g MgSO4.7H2O ; 0,003 Zn SO4.7H2O pH 5,5; 5 g K2HPO4; 0,005 g FeSO4 dan 1 g NH4SO4, lalu ditambahkan 1 liter aquades kemudian dilarutkan sampai homogen (Silva et al, 2007).
3.3.5.Uji Kualitatif Enzim Ekstraselular 3.3.5.1. Fenol Oksidase
Reaksi-warna Bavendamm secara luas digunakan untuk mengidentifikasi kapang. Kapang dikultur pada cawan petri yang mengandung tanin, terlihat difusi cokelat pada permukaan media kultur. Adanya difusi berwarna cokelat mengindikasikan adanya fenol oksidase. Tanin (4 mM / L) ditambahkan pada medium PDA dan pada diameter pertumbuhan miselium dan lingkaran cokelat tercatat setiap hari (Tao et al., 2009).
3.3.5.2. Lignin Peroksidase
Metode memudar digunakan untuk mengidentifikasi adanya peroksidase. Metilen biru (0,1 g / L) ditambahkan ke dalam medium kultur PDA yang ditumbuhi dengan kapang. Warna yang memudar dari medium menunjukkan keberadaan enzim lignin peroksidase (Tao et al., 2009).
3.3.5.3. Mangan peroksidase (MnP)
MnCl2 · 4H2O (0,1g / L) telah ditambahkan ke dalam medium kultur PDA dan kapang kemudian diinokulasi selama dua minggu. Selama waktu kultur dilihat perkembangan bintik hitam cokelat. MnP mengkatalisis oksidasi MnCl2 menjadi MnO2 sehingga menghasilkan spot berwarna coklat hitam (Tao et al.,
28 3.3.6. Kultur Inokulum Spora
Isolat kapang diremajakan menggunakan medium PDA pada cawan petri dan diinkubasi pada suhu ruang sampai menghasilkan spora. Sebanyak ± 10 ml NaCl 0,85% dimasukkan kedalam cawan petri inokulum spora kemudian miselia kapang dipecahkan menggunakan ose steril lalu dimasukkan ke dalam yellow tube
kemudian divortex sampai kapang larut dalam NaCl. 3.3.7. Biosolubilisasi Batubara
Kultur inokulum spora sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tabung erlenmeyer yang berisi 200 ml medium MSS+ dengan jumlah spora yang diinginkan 108 sel/ml, lalu dihomogenkan. Kemudian dilakukan enam perlakuan, dimana perlakuan I, II, III digunakan sebagai kontrrol (tanpa batubara).
Tabel 2. Jenis Perlakuan yang digunakan
Perlakuan MSS+ (ml) Kultur Inokulum
Spora (1 ml) Batubara (%) I 200 ml B1 - II 200 ml B2 - III 200 ml B3 - IV 200 ml B1 5% V 200 ml B2 5% VI 200 ml B3 5%
Tahap selanjutnya, yaitu diinkubasi dengan menggunakan shaking incubator dengan kecepatan 120 rpm pada suhu ruang selama 28 hari. Pencuplikan sampel kultur dilakukan pada hari ke 0, 7, 14, 21, dan 28 untuk dilakukan pengamatan kolonisasi, pH medium, dan solubilisasi terhdap batubara. 3.3.8. Pengukuran Kadar Protein Ekstraselular
Sebanyak 0,5 ml sampel ditambahkan 2,5 ml larutan Lowry I dan diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit. Kemudian ditambahkan 0,25 ml
29 larutan Lowry II, divortek dan diinkubasi pada suhu ruang selam 30 menit. Setelah itu absorbansi dibaca dengan Spektrofotometer UV/Vis pada panjang gelombang 750 nm dan dibandingkan dengan standar Bouvine Serum Albumin
(BSA).
3.3.9. Analisis Profil Protein dengan Elektroforesis SDS-PAGE
Pada penelitian ini menggunakan metode elektroforesis 1 dimensi SDS-PAGE dengan sistem buffer Laemmli. Konsentrasi gel poliakrilamida yang digunakan adalah 10%.
a. Preparasi sampel
Kultur inokulum spora pada hari ke-21 untuk kapang B1 dan hari ke-7 untuk kapang B2 dan B3 diambil sebanyak 75 µl dengan mikropipet ke dalam tabung effendorf, lalu ditambahkan buffer sampel sebanyak 25 µl dan divortek hingga homogen, kemudian dipanaskankan selama + 5 menit, setelah itu disentrifugasi selama 5 menit.
b. Preparasi gel elektroforesis - Separating gel (10%)
30% Acrylamide solution 6 ml ditambahkan separating gel buffer (1,5 M Tris-HCl, pH 6,8) sebanyak 4,5 ml, kemudian aquabides 7,5 ml, SDS 50 µl dan 10% Ammonium persulfate 0,08 ml serta TEMED 0,01 ml.
- Stacking gel (45%)
30% Acrylamide solution 0,9 ml ditambahkan stacking gel buffer (0,5 M Tris-HCl, pH 8,8) sebanyak 1,5 ml, kemudian aquabides 3,6 ml, SDS 25 µl dan 10% Ammonium persulfate 0,02 ml serta TEMED 0,01 ml.
30 c. Pembuatan kolom gel
Setelah separating gel dibuat kemudian dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam alat elektroforesis dengan mikropipet, lalu ditambahkan aquabides untuk meratakan separating gel tersebut. Setelah separating gel membeku dimasukkan stacking gel sedikit demi sedikit, lalu pasang sisir pembentuk kolom biarkan hingga stacking gel membeku lalu diangkat sisirnya. Kemudian dipasang hasil gel tersebut pada perangkat elektroforesis.
d. Loading sampel
Larutan buffer dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis. Kemudian sampel sebanyak 15 µl dimasukkan ke dalam kolom gel dengan hati-hati lalu dielektroforesis selama + 100 menit pada 200 Volt, 40 mA.
e. Pewarnaan gel
Gel diangkat lalu diwarnai dengan coomassie brilliant blue staining gel warna biru Coomassie R-250, selama + 1 jam.
f. Pencucian gel
Gel dicuci dengan larutan destain solution coomassie R-250, selama + 1 hari. Selanjutnya hasil pencucian discan dan dianalisis menggunakan LabImage 1D. 3.3.10. Analisis Hidrolisis FDA
Dimasukkan 1 ml supernatan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 4 ml KH2PO4 buffer (pH 7,8) 60 nM. Reaksi dimulai dengan menambahkan 40 µg FDA kemudian divorteks dan diinkubasi selama 20 menit. Setelah penginkubasian segera ditambahkan aseton sebanyak 5 ml untuk menghentikan reaksi lalu ditutup dengan aluminium foil. Suspensi disaring dengan kertas Whatmann No. 1. Filtrat dimasukkan ke dalam tabung reaksi,
31 ditutup dengan parafilm dan disimpan dalam es batu untuk menguapkan aseton. Nilai absorbansi ditera dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm (Breeuwer, 1996).
3.3.11.Pengukuran Absorbansi Produk Biosolubilisasi Batubara
Supernatan dari biosolubilisasi batubara disentrifugasi 5400 rpm selama 30 menit kemudian diukur nilai absorbansinya dengan menggunakan SpektrofotometerUV-Vis Ionic Genesys 2 pada panjang gelombang 250 nm dan 450 nm untuk mengetahui tingkat solubilisasi batubara (Silva, 2007). Nilai absorbansi yang tinggi berbanding lurus dengan tingkat solubilisasi batubara yang tinggi pula, data tersebut digunakan sebagai dasar untuk menyeleksi isolat kapang. 3.3.12.Analisis Hasil Solubilisasi Batubara oleh Kapang Indigenous dengan
Menggunakan GC-MS
Supernatan dari biosolubilisasi batubara dan pelarut dicampurkan dengan perbandingan 1:1, pelarut yang digunakan adalah benzena : heksana : dietil eter dengan perbandingan 3:1:1. Campuran tersebut dimasukkan ke dalam corong Buchner lalu diaduk sampai bercampur kemudian didiamkan beberapa saat sampai terbentuk fase atas dan bawah, fase atas dipakai untuk mengidentifikasi jenis senyawa dan menentukan kadar hasil solubilisasi batubara dengan menggunakan GC-MS (Silva, 2007).
Karakteristik produk biosolubilisasi dilakukan menggunakan alat GCMS merk Shimadzu dengan tipe QP2010S (Gambar 11), suhu injektor 280 oC, injektor
mode split, waktu pengambilan sampel 1 menit, suhu kolom 40 – 270 oC dengan pengaturan suhu awal 40 oC ditahan selama 5 menit, dan waktu 10 menit untuk mencapai suhu 270 oC (23 oC/menit) ditahan selama 60 menit, sehingga total
32 waktu program 88 menit, suhu detektor 280 oC, suhu interval 250 oC, gas pembawa He, tekanan utama 500-900, Flow control mode pressure, tekanan 10,9 Kpa, total flow 58,8 ml/m, aliran kolom 0,55 ml/m, percepatan linier 26,0 cm/dt, aliran pembersihan 3.0 ml/m, split ratio 99,8, jenis kolom Rtx-5MS, panjang kolom 30.00 m, ketebalan 0.25 µm, diameter 0,25 mm, dan jenis pengion EI (Electron Impact) 70 eV (Whetstine et al., 2003).
3.3.13.Analisa Data
Data penelitian ini dianalisis berdasarkan data visual dengan bantuan Microsoft Office Excel 2007.
33 BAB IV