BAB II TINJAUAN PUSTAKA
3.2. Tempat dan Waktu Penelitian
3.2.1. Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan.
3.2.2. Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan mulai bulan Januari sampai November 2013 yang meliputi studi kepustakaan, pengajuan judul, pengumpulan data/sampel, pengolahan data dan laporan hasil penelitian.
Tabel 3.1. Waktu pelaksanaan penelitian
KEGIATAN WAKTU PELAKSANAAN JANUARI- APRIL 2013 MEI 2013 AGUSTUS 2013 SEPTEMBER- OKTOBER 2013 NOVEMBER 2013 Studi Kepustakaan Pengajuan judul Pengumpulan Data Pengolahan Data Laporan Hasil Penelitian
3.3. Subjek Penelitian
3.3.1. Populasi
Populasi dalam penelitian ini adalah semua slaid sitologi KGB yang didiagnosis sebagai metastasis karsinoma nasofaring di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran USU Medan.
3.3.2.Sampel
Sampel dalam penelitian ini adalah sediaan sitologi KGB yang sesuai dengan kriteria inklusi dan sesuai dengan besar sampel penelitian.
3.3.3. Besar Sampel
Besar sampel yang diperlukan adalah berdasarkan perhitungan dengan melihat proporsi yang digunakan pada penelitian ini sebesar 50% karena belum ada penelitian mengenai tampilan LMP1 pada sediaan sitologi biopsi aspirasi jarum halus pada KGB leher dengan metastasis karsinoma nasofaring. Tingkat kemaknaan yang dipergunakan pada penelitian ini adalah 0,05 dengan interval kepercayaan 95%, sehingga dari tabel Z-score diperoleh Zα=1,96.
Perkiraan besarnya sampel penelitian berdasarkan perhitungan dengan menggunakan rumus :
Keterangan : n= besar sampel
Zα = tingkat kepercayaan (95%→ Z-score= 1,96) p= proporsi penelitian (50% atau 0,5)
q= 1-p
d= presisi penelitian, yaitu kesalahanpenelitian yang dapat diterima (20% atau 0,2)
Maka besar sampel pada penelitian ini ditetapkan 34 slaid sitologi metastasis KNF di KGB.
3.3.4. Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan dengan metoda non random sampling dengan teknik consecutive sampling.
3.4. Kriteria Inklusi Dan Eksklusi
3.4.1. Kriteria Inklusi:
Yang termasuk kriteria inklusi adalah semua sediaan sitologi biopsi aspirasi jarum halus pada pembesaran KGB leher yang didiagnosis sebagai metastasis KNF. Pewarnaan sediaan sitologi dengan menggunakan Papanicolaou dan dilihat dengan mikroskop cahaya.
3.4.2. Kriteria Eksklusi:
1. Sediaan sitologi dari pembesaran KGB leher bukan sebagai metastasis KNF. 2. Sediaan sitologi dari pembesaran KGB leher sebagai metastasis KNF dengan
3. Sediaan sitologi dari pembesaran KGB yang rusak (slaid yang patah, tergores) dan tidak dapat dibaca, jumlah sel yang terlalu sedikit (tidak adekuat), sel- sel yang terlalu menggumpal, serta sediaan yang tidak dapat dipoles dengan imunositokimia LMP1.
3.5. Variabel Penelitian
Variabel yang diteliti adalah : a. Variabel bebas adalah LMP1
b. Variabel terikat adalah metastasis KNF pada KGB leher
3.6. Kerangka Operasional
Gambar 3.1. Skema kerangka operasional
SLAID SITOLOGIK DARI KGB LEHER PENDERITA KNF DENGAN PEMBESARAN KGB LEHER YANG DILAKUKAN SIBAJAH
(REKAM MEDIK) METASTASIS KNF IMUNOSITOKIMIA DENGAN LMP1 BASALOID SQUAMOUS CELL CARCINOMA NONKERATINIZING CARCINOMA KERATINIZING SQUAMOUS CELL CARCINOMA LMP1 (+) LMP1 (-)
3.7. Definisi Operasional
1. Karsinoma nasofaring adalah tumor yang berasal dari sel-sel epitel yang menutupi permukaan nasofaring.
2. Penderita karsinoma nasofaring dengan pembesaran kelenjar getah bening (KGB) leher adalah penderita yang didiagnosis sebagai karsinoma nasofaring berdasarkan gambaran klinis, radiologis maupun patologi anatomi, dan pada pemeriksaan dijumpai pembesaran KGB di leher baik dengan cara melihat (inspeksi) maupun dengan perabaan (palpasi).
3. Sitologi biopsi aspirasi jarum halus (Sibajah) suatu teknik pengambilan sediaan sitologi pada benjolan yang teraba di leher pada saat melakukan palpasi, dengan menggunakan alat pistolet dan spuit 10cc, kemudian dihapuskan ke kaca slaid, difiksasi dengan alkohol 96% kemudian diwarnai dengan hematoksilin dan eosin.
4. Metastasis KNF adalah perluasan karsinoma nasofaring di luar jaringan nasofaring yang didiagnosis dengan pemeriksaan patologi anatomi, perluasan karsinoma ini dapat secara langsung, melalui pembuluh limfe (limfogen) maupun melalui pembuluh darah (hematogen).
5. Keratinizing squamous cell carcinoma adalah jenis karsinoma nasofaring yang pada pemeriksaan mikroskopik menunjukkan adanya diferensiasi dari sel skuamous dengan intercellular bridge atau keratinisasi, dengan sitoplasma sel yang melimpah mengandung keratin.
6. Nonkeratinizing carcinoma adalah jenis karsinoma nasofaring dengan gambaran mikroskopik tidak menunjukkan keratinisasi.
7. Basaloid squamous cell carcinoma adalah jenis karsinoma nasofaring yang terdiri dari komponen sel-sel basaloid dan sel-sel skuamous.
8. Imunositokimia dengan LMP1 adalah suatu pemeriksaan laboratorium terhadap sediaan Sibajah dengan menggunakan pewarnaan khusus antibodi Latent Membrane Antigen 1 (LMP1) terhadap target protein dalam sel yang berperan sebagai antigen dalam pemeriksaan ini. Hasil pulasan LMP1 adalah tampilan pulasan warna coklat pada membran maupun sitoplasma sel-sel KNF dengan menggunakan mikroskop cahaya pembesaran 400x pada 5 lokasi lapangan pandang yang dinyatakan dengan:
Negatif, bila tidak berhasil menampilkan warna coklat, dimana pada saat proses yang sama kontrol (+) menampilkan warna coklat dengan pewarnaan kromogen DAB.
Positif, bila terlihat tampilan pulasan warna coklat pada membran maupun sitoplasma sel sel-sel KNF dan pada saat yang sama kontrol (+) juga menampilkan warna yang sama.
Yang dinilai pada sediaan ada 2 yaitu : Skor intensitas warna coklat :
0 = negatif +1 = lemah +2 = sedang +3 = kuat
Skor kuantitas atau distribusi : banyaknya sel yang positif terwarnai 0 = tidak ada sel yang terwarnai
1 = jumlah sel yang terwarnai 1-10% 2 = jumlah sel yang terwarnai 11-50% 3 = jumlah sel yang terwarnai 51-100%
Skor imunoreaktivitas diperoleh dengan menjumlahkan skor intensitas dengan skor kuantitas, dari 0-6.
Interpretasi :
0 : negatif
1-3 : ekspresi lemah 4-6 : ekspresi kuat
1-6 : positif (Chen et al, 2010).40
3.8. Prosedur Kerja
Data penderita KNF yang mengalami metastasis pada KGB leher yang dilakukan sibajah diambil dari rekam medik Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan. Berdasarkan data tersebut, diperoleh slaid sitologi, yang kemudian diberi kode untuk diperiksa kembali (review) secara double blind oleh peneliti dibantu oleh dua orang ahli Patologi Anatomi, untuk memisahkan antara keratinizing squamous cell carcinoma, nonkeratinizing carcinoma dan basaloid squamous cell carcinoma (diagnosis berdasarkan pada klasifikasi WHO tahun 2005). Kemudian pada slaid sitologi dilakukan destaining (pelunturan zat warna) dengan merendam slaid ke dalam larutan asid alcohol (HCl 1% dalam alkohol 70% v/v) selama selama 5-10 menit (sampai slaid jernih) sehingga slaid sediaan hapusan siap untuk diwarnai dengan imunositokimia. Selanjutnya dilakukan prosedur pewarnaan
imunositokimia dengan LMP1. Tampilan dari LMP1 dievaluasi, ditabulasi dan dibandingkan berdasarkan klasifikasi diagnosis karsinoma nasofaring dan dibuat dalam bentuk tabel. Data tersebut kemudian diolah dan dianalisis secara statistik.
3.8.1. Prosedur pengambilan sampel sitologi dengan sibajah
Peralatan yang digunakan adalah pistolet Comeco, disposable spuit 10 ml, ukuran jarum 22-23 G, kapas alkohol dan plesterin penutup luka.
a. Kulit didesinfeksi tanpa menggunakan anestesi. Nodul KGB difiksasi dengan jari tangan sambil kulit di atasnya diregangkan.
b. Apabila jarum sudah berada di dalam nodul, piston ditarik ke arah proksimal dan tekanan di dalam tabung menjadi negatif dan aspirat mengandung sejumlah sel masuk ke dalam lumen jarum atau tabung suntik.
c. Apabila aspirat telah terlihat pada muara jarum pegangan piston dilepaskan sehingga tekanan dalam tabung kembali seperti semula d. Jarum dibebaskan dari tabung suntik, piston ditarik ke arah proksimal,
jarum disatukan kembali, sehingga ruangan tabung bertekanan positif. Lalu ujung jarum diletakkan pada kaca objek, piston didorong secara hati-hati dan aspirat diteteskan di atas kaca objek dan dibuat sediaan hapus. Untuk mengosongkan jarum atau tabung, prosedur ini dapat dilakukan berulang-ulang.
e. Sediaan hapusan segera direndam dalam alhohol 95% selama 1 menit kemudian dikeringkan di udara.
3.8.2. Prosedur pewarnaan sampel dengan Papanicolaou
Pewarnaan menurut Papanicolaou pada penelitian ini menggunakan Papanicolaou Staining Kit produksi Merck, yang terdiri atas pewarnaan Papanicolaou standar berupa Gill 2 Hematoxyllin, EA-50 dan Orange G-6. Zat aktif yang terdapat pada cairan pewarna antara lain:
(a) Gill 2 Hematoxillin:
Aluminium sulfate 3,3% Hematoxillin 0,376% (b) Bluing reagent: Sodium bicarbonate 0,18% Lithium carbonate 0,85% (c) Orange-G-6: Orange –G 0,67% Phosphotungstic acid 0,02% (d) EA-50: Eosin-Y 0,45% Phosphotungstic acid 0,2% Light Green SF Yellowish 0,1% (e) Shandon Mounting Medium:
Methacrylate polymer 30,8%
Prosedur pewarnaan Papanicolaou dimulai dengan meletakkan slaid sediaan hapusan pada wadah pertama pada nampan berisi alkohol 95% disebelah tanda panah berkode ”start” yang terletak di pojok kiri bawah nampan. Langkah
selanjutnya dengan mengikuti arah tanda panah sebanyak 18 langkah sebagai berikut:
1. Slaid direndam dalam wadah alkohol 95% selama 1 menit
2. Selanjutnya slaid dicelup dalam wadah alkohol 95% sebanyak 10 kali celupan
3. Selanjutnya slaid dicelup dalam wadah air suling sebanyak 10 kali celupan 4. Selanjutnya slaid direndam dalam larutan Hematoxyllin Gill 2 selama 1
menit
5. Selanjutnya slaid dicelup dalam wadah air suling sebanyak 10 kali celupan 6. Selanjutnya slaid direndam dalam larutan Bluing Reagent selama 1 menit 7. Selanjutnya slaid dicelup dalam wadah air suling sebanyak 10 kali celupan 8. Selanjutnya slaid dicelup dalam wadah alkohol 95% sebanyak 10 kali
celupan
9. Selanjutnya slaid direndam dalam larutan Orange-G-6 selama 1 menit 10. Kemudian slaid dicelup dalam wadah alkohol 95% sebanyak 10 kali
celupan
11. Selanjutnya slaid dicelup dalam wadah alkohol 95% sebanyak 10 kali celupan
12. Selanjutnya slaid direndam dalam larutan EA-50 selama 1 menit
13. Selanjutnya slaid dicelup dalam wadah alkohol 95% sebanyak 10 kali celupan
14. Selanjutnya slaid dicelup dalam wadah alkohol 95% sebanyak 10 kali celupan
15. Selanjutnya slaid dicelup dalam wadah alkohol 100% sebanyak 10 kali celupan
16. Selanjutnya slaid dicelup dalam wadah alkohol 100% sebanyak 10 kali celupan
17. Selanjutnya slaid dicelup dalam wadah Xylene sebanyak 10 kali celupan 18. Terakhir slaid direndam dalam larutan Xylene selama 1 menit
19. Tutup slaid menggunakan Shandon Mounting Medium.
3.8.3. Prosedur pewarnaan sampel dengan imunositokimia LMP1
Slaid yang telah diwarnai sebelumnya dengan pewarnaan rutin direndam dalam larutan asam alkohol selama 5-10 menit untuk melunturkan warna sehingga preparat/sediaan hapusan siap untuk diwarnai dengan imunositokimia.
1. Destaining (Xylol I, Xylol II, Xylol III)………..@ 5 menit 2. Rehidrasi dalam etanol dengan gradasi menurun (Alkohol absolut,
alkohol 96%, alkohol 80%, alcohol 70%)………@ 4 menit 3. Cuci dengan air mengalir……….. 5 menit 4. Blocking Endogen Peroksida 0,5% (Methanol 100 ml+ H2O2 1,6
ml)………..@30 menit 5. Cuci dengan air mengalir……… 5 menit 6. Masukkan slaid dalam larutan target retrieval untuk pretreatment
dengan TRIS-EDTA dan dipanaskan (cook 1-2, microwave… 10 menit. 7. Didinginkan selama ± 30 menit.
8. Cuci dalam PBS ph 7,4………. 3 menit. 9. Tandai populasi sel dengan Pap pen.
10. Blocking dengan Normal Horse Serum 5%... 15 menit 11. Inkubasi dengan antibodi primer (anti-EBV Latent Membrane Protein 1 antibody, ab7502) dalam temperatur kamar……….. 60 menit 12. Cuci dalam PBS ph 7,4……….. 3 menit. 13. Teteskan Universal-link……….. 15 menit. 14. Cuci dalam PBS ph 7,4………. 3 menit. 15. Teteskan Trekavidin-HRP Label……….. 15 menit. 16. Cuci dalam PBS ph 7,4 ………. 3 menit. 17. Teteskan larutan diaminobenzidine (DAB)+Substrat Buffer, 2-5 menit. 18. Cuci dengan air mengalir………... 5 menit. 19. Counterstain dengan hematoxylin………5 menit. 20. Cuci dengan air mengalir……… 5 menit 21. Masukkan ke dalam larutan Litium karbonas jenuh (5% dalam
akuades)……….. 2 menit. 22. Cuci dengan air mengalir……… 5 menit 23. Dehidrasi dalam etanol dengan gradasi bertingkat (80%, 96%, absolut,
absolut)………@ 5 menit. 24. Clearing(Xylol I, Xylol II, Xylol III)………@ 5 menit. 25. Mounting + cover glass
26. Lihat tampilan imunositokimia LMP1 di bawah mikroskop.. .
3.9. Alat dan Bahan Penelitian
3.9.1. Alat-Alat Penelitian
Alat-alat yang diperlukan dalam penelitian ini adalah : pistolet Cameco, disposable spuit 10 ml, ukuran jarum 22-23G panjang 30-50 mm, kapas alkokol,
inkubator, staining jar, rak kaca objek, kaca objek, rak inkubasi, pensil Diamond, pipet mikro, kertas saring, pengukur waktu, gelas Erlenmeyer, gelas beker, tabung sentrifus 15 ml, microwave, spin master, thermolyte stirrer, entelan, deck glass dan mikroskop cahaya.
3.9.2. Bahan Penelitian
a. Slaid sediaan hapusan yang telah didiagnosis dengan pulasan Papanicolaou sebagai metastasis karsinoma nasofaring.
b. Pulasan imunositokimia dengan menggunakan metode The EnVision+ Dual Link System kit, teknik pulasan imunositokimia 2 langkah. Antibodi primer yang digunakan adalah anti-EBV Latent Membrane Protein 1 antibody (ab7502), Mouse monoclonal (cs1,cs2,cs3,cs), prediluted, abcan.
The EnVision+ Dual Link System kit terdiri dari :
1 botol Dual endogenous enzyme block (15 ml)
1 botol Labelled polymer-HRP (15 ml)
1 botol DAB+ Substrat Buffer (18 ml)
1 botol DAB+ Chromogen (1 ml)
Larutan PBS pH 7,4:
NaCl 87,5 gr + KH2PO4 1,92 gr dalam aquadest 800 ml.
Tambahkan dengan Na2HPO42H2O 15,33 gr, aduk sampai larut.
Tambahkan aquades sampai satu liter.
Larutan litium karbonas:
50 gr litium karbonas
Tambahkan aquades sampai satu liter.
Larutan Tris EDTA:
Tris (2,422 gr)
EDTA (0,744 gr)
Tambahkan aquades sampai satu liter. .
3.10. Instrumen Penelitian
Instrumen penelitian yang digunakan adalah hasil pulasan imunositokimia LMP1 terhadap sampel sediaan sitologi dari KGB leher. Untuk penilaian terhadap pulasan imunositokimia LMP1 adalah sebagai berikut :
a. Kontrol positif : slaid sediaan karsinoma nasofaring yang telah diketahui positif terhadap LMP1
b. Kontrol negatif: slaid karsinoma nasofaring dengan antibodi primer yang digantikan dengan serum normal.
c. Positif : warna coklat yang tertampil pada sitoplasma dan membran sel tumor (KNF)
3.11. Analisa Data
Analisa data dilakukan secara komparatif antara tampilan imunositokimia LMP1 pada metastasis KNF leher jenis klasifikasi histologi karsinoma nasofaring yaitu keratizining squamous cell carcinoma dan nonkeratinizing carcinoma dengan menggunakan Fisher’s exact test.