BAB I PENDAHULUAN
2.6 Teori Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik pemisahan, yaitu berdasarkan absorbsi sampel diantara suatu fase gerak dan fase diam. Penemu Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1903 mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom yang berisi kapur (CaSO4). Istilah kromatografi diciptakan oleh Tswett
14
untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak ke bawah kolom.Pada waktu yang hampir bersamaan, Day juga menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett adalah yang pertama diakui sebagai penemu yang pertama kali mengenali dan menafsirkan proses kromatografi (Johnson dan Stevenson, 1978).
2.6.2 Pembagian Kromatografi
Kromatografi dapat dibedakan atas berbagai macam, tergantung pada pengelompokannya. Berdasarkan pada mekanisme pmisahannya, kromatografi dibedakan menjadi: (a) kromatografi adsorbsi; (b) kromatografi partisi; (c) kromatografi pasangan ion; (d) kromatografi penukar ion (e) kromatografi eksklusi ukuran dan (f) kromatografi afinitas (Johnson dan Stevenson, 1978; Rohman, 2007).
Berdasarkan pada alat yang digunakan, kromatografi dapat dibagi atas: (a) kromatografi kertas; (b) kromatografi lapis tipis, yang kedua sering disebut kromatografi planar; (c) kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dan (d) kromatografi gas (KG) (Johnson dan Stevenson, 1978; Rohman, 2007).
2.6.3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan teknik pemisahan yang didukung oleh kemajuan teknologi yang canggih untuk menganalisis berbagai analit secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran, senyawa bahan aktif obat, menganalisis kemurnian suatu senyawa didalam suatu cuplikan (Ditjen POM, 1995).
Kegunaan umum dari KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian
15
(impurities) dan analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap
(nonvolatile). KCKT sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat dan lain-lain (Rohman, 2007).
2.6.4 Jenis Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Berdasarkan pada mekanisme pemisahannya KCKT dapat dikelompokkan menjadi KCKT fase normal dan KCKT fase terbalik.Untuk fase normal (fase gerak lebih polar daripada fase gerak), sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak).Fase terbalik menggunakan fase diam silika yang dimodifikasi secara kimiawi seperti oktadesilsilan (ODS atau C18) dan fase gerak campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan buffer. Untuk solut yang bersifat asam lemah,peranan pH sangat krusial karena bila pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonisasi. Terbentuknya bagian yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk yang tidak terionisasi akan terelusi lebih cepat (Rohman, 2007).
2.6.5 Proses Pemisahan dalam Kolom Kromatografi Cair
Pemisahan analit dalam kolom kromatografi berdasarkan pada aliran fase gerak yang membawa campuran analit melalui fase diam dan perbedaan interaksi analit dengan permukaan fase diam sehingga terjadi perbedaan waktu perpindahan setiap komponen dalam campuran (Meyer, 2010).
Sebagai contoh, campuran dua komponen dimasukkan ke dalam sistem kromatografi (partikel ● dan ▲).Di mana komponen ▲ cenderung menetap di
16
fase diam dan komponen ● lebih cenderung di dalam fase gerak. Ilustrasi proses pemisahan dalam kolom kromatografi dapat dilihat pada Gambar 3 berikut.
Gambar3 .Ilustrasi proses pemisahan yang terjasi di dalam kolom KCKT (Sumber: Meyer, 2010).
Masuknya eluen (fase gerak) yang baru ke dalam kolom akan menimbulkan kesetimbangan baru, molekul sampel dalam fase gerak diadsorpsi sebagian oleh permukaan fase diam berdasarkan pada koefisien distribusinya, sedangkan molekul yang sebelumnya diadsorpsi akan muncul kembali di fase gerak (Gambar 4c). Setelah proses ini terjadi berulang kali, kedua komponen akan terpisah. Komponen ● yang lebih suka dengan fase gerak akan berpindah lebih cepat daripada komponen ▲ yang cenderung menetap di fase diam, sehingga komponen ● akan muncul terlebih dahulu dalam kromatogram, kemudian diikuti oleh komponen ▲ (Meyer, 2010).
2.7 Parameter Penting dalam Kromatografi Cair 2.7.1 Waktu tambat/retention time
Waktu tambat/retention time(tR) merupakan waktu antara penyuntikan sampel dan puncak maksimum yang terekam oleh detektor. Waktu tambat dari suatu komponen yang tidak ditahan/dihambat oleh fase diam disebut sebagai waktu hampa/void time.Waktu tambat merupakan fungsi dari laju alir fase gerak
Fase gerak
17
dan panjang kolom. Jika fase gerak mengalir lebih lambat atau kolom semakin panjang, waktu hampa dan waktu tambat akan semakin besar, dan sebaliknya bila fase gerak mengalir lebih cepat atau kolom semakin pendek, maka waktu hampa dan waktu tambat akan semakin kecil (Meyer, 2010).
2.7.2 Faktor Kapasitas
Faktor kapasitas atau faktor tambat (k) merupakan suatu ukuran derajat tambatan dari suatu analit didalam kolom. K didefinisikan sebagai waktu zat terlarut berada dalam fase diam (tR) dibagi dengan waktu zat terlarut dalam fase gerak (tM) rumusnya ditulis sebagai berikut ini (Dong, 2006).
Retention factor, k=tR −t M tM
Faktor tambat yang baik berada diantara nilai 1 hingga 10.Jika nilai k terlalu kecilmenunjukkan tingkat pemisahan yang tidak bagus karena analit terlalu cepatmelewati kolom sehingga tidak terjadi interaksi dengan fase diam dan tidak muncul kromatogram. Sebaliknya nilai k yang terlalu besar mengindikasikan waktu analisis akan panjang (Meyer, 2010).
Faktor kapasitas dipengaruhi oleh perbandingan komposisi fase gerak yang digunakan sehingga akan menghasilkan resolusi dan waktu retensi dari puncak-puncak kromatogram yang berbeda pada setiap perbandingan komposisi fase gerak (Snyder, dkk., 2010).
2.7.3 Selektivitas
Selektivitas disebut juga sebagai faktor tambahan relatif.Selektivitas (α) merupakan kemampuan sistem kromatografi dalam memisahkan/membedakan analit yang berbeda.Selektivitas ditentukan sebagai rasio perbandingan dua faktor kapasitas dari analit yang berbeda (Meyer, 2010).
18
Selektivitas bergantung pada banyak faktor umumnya tergantung pada sifat analit itu sendiri, interaksinya dengan permukaan fase diam serta jenisdan komposisi fase gerak yang digunakan. Selektivitas yang didapatkan dalam sistem KCKT harus
α
>1 agar pemisahan terjadi dengan baik (Dong, 2006).2.7.4 Efisiensi Kolom
Solusi untuk memperbaiki masalah daya pisah adalah efisiensi kolom. Efisiensi kolom disebut sebagai nilai lempeng/plate number (N). Kolom yang efisien adalah kolom yang mencegah pelebaran pita serta menghasilkan puncak yang sempit dan memisahkan analit dengan baik.Jumlah nilai lempeng berbanding lurus dengan panjang kolom. Nilai lempeng akan semakin tinggi jika ukuran kolom semakin panjang, hal ini berarti proses pemisahan yang terjadi semakin baik. Hubungan proporsionalitas antara nilai lempeng dengan panjang kolom disebut sebagai nilai HETP/High Equivalent of a Theoritical Plate. Praktik HPLC yang baik adalah mendapatkan nilai HETP yang kecil untuk nilai N yang maksimum dan efisiensi kolom yang tertinggi (Johnson dan Stevenson,1978).
� = �
���
�
2=�
4����
�
2=
16�
����
�
2Nilai lempeng sangat dipengaruhi oleh waktu tambat puncak, ukuran partikel kolom, laju alir fase gerak, suhu kolom, viskositas fase gerak dan berat molekul analit (Jhonson dan Stevenson, 1978).FDA merekomendasikan agar tiap analisis KCKT yang valid mempunyai nilai lempeng lebih besar dari 2000 (Meyer, 2010).
2.7.5 Resolusi
19
Resolusi merupakan derajat pemisahan dari dua puncak analit yang saling bersebelahan (Meyer, 2010).
R =tR 2 − tR 1 w 1+ w 2
Harga resolusi yang semakin besar memiliki arti proses pemisahan semakin bagus dan sebaliknya resolusi yang kecil merupakan pertanda proses pemisahan yang buruk. Dua puncak yang tidak terpisah dengan sempurna namun sudah dapat terlihat memiliki resolusi 1. Sedangkan bila kedua puncak yang saling berdekatan terpisah sempurna tepat pada garis alas, resolusi bernilai 1,5. Oleh karena itu pada analisis kuantitatif, resolusi yang ditunjukkan harus lebih besar dari 1,5. Sementara bila kedua puncak memiliki perbedaan yang signifikan, maka diperlukan nilai resolusi yang lebih besar (Meyer, 2010).
Pemisahan yang kurang baik dalam kromatografi fase balik biasanya disebabkan oleh tahanan yang lemah untuk senyawa yang sangat polar, sensitifitas deteksi yang kurang bagus dan ukuran molekul terutama dalam senyawa kompleks. Puncak yang tumpang tindih biasanya ditemukan bila satu puncak lebih besar dari puncak yang lain (Snyder, dkk., 2010).
2.7.6 Faktor Ikutan dan Faktor Asimetri
Kondisi ideal dari puncak kromatogram akan memperlihatkan bentuk Gaussian dengan derajat simetris yang sempurna. Namun kenyataannya dalam praktik kromatografi, puncak yang simetris secara sempurna jarang dijumpai.Jika diperhatikan dengan cermat, maka hampir setiap puncak dalam kromatografi memperlihatkan tailing dalam derajat tertentu (Dolan, 2003).Contoh puncak yang asimetris dapat dilihat pada Gambar 4.
20
Gambar 4.Contoh gambar puncak yang asimetris (Sumber: Dolan, 2003). Pengukuran derajat asimetris puncak ini dapat diukur dengan faktor ikatan dan faktor asimetri.Faktor ikatan atau lebih dikenal tailing factordilambangkan dengan simbol (Tf) yang dapat dihitung dengan menggunakan lebar puncak pada ketinggian 5% (W0,05), rumusnya dituliskan sebagai berikut:
Dengan nilai a dan b merupakan setengah lebar puncak pada ketinggian 5% seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5.
Gambar 5.Pengukuran derajat asimetris puncak (Sumber: Snyder, 2010). Sementara itu, faktor asimetri/asymmetry factor(As) dihitung dengan rumus sebagai berikut:
A
s=
b aTf = a + b 2a