Jarak migrasi pita protein
B. thuringiensis SGT3g
Gambar 14 Hasil amplifikasi plasmid rekombinan. Sumur dari kiri: (M) marker 1kb, (1) B.cereus INT1c, (2) B.thuringiensis SGT3g.
Sekuen Asam Amino dan Filogenetik AHL-Laktonase B.cereus INT1c dan
B.thuringiensis SGT3g
Bakteri B.cereus INT1c dan B.thuringiensis SGT3g mempunyai sekuen penyandi AHL-laktonase yang mirip setelah disejajarkan dengan MEGA5 software. Analisis sekuen dengan program BLAST-X menunjukkan bahwa asam amino dari B.cereus INT1c memiliki homologi 98% dengan B.cereus nomor akses WP.000216573.1, sedangkan B.thuringiensis SGT3g memiliki homologi 99% dengan B.thuringiensis serovar aizawai nomor akses AEY70474.1 (Tabel 1). Tabel 1 Hasil BLAST-X dari sekuen gen aiiA
Analisis jarak evolusioner kedua isolat dengan pohon filogenetik menghasilkan distribusi homologi gen aiiA yang beragam dengan kelompok Bacillus yang lain (Gambar 15). Kedua isolat memiliki kekerabatan dekat dengan B.amyloliquefaciens, B.weihenstephanensis, dan B.thuringiensis serovar kim.
Isolat Deskripsi Query
Cover
E Value Identitas No. Akses B.cereus INT1c AHL-laktonase
[B. cereus] 81% 4e-180 98% WP.00021 6573.1 B.thuringiensis SGT3g AHL-laktonase [B.thuringiensis serovar aizawai] 84% 0.0 99% AEY7047 4.1 M b
17 Bakteri Pseudomonas aeruginosa (nomor akses WP023464371.1) dipilih sebagai outer group yang merupakan bakteri Gram negatif penghasil AHL-asilase.
Gambar 15 Pohon filogenetik dari asam amino AHL-laktonase yang dikonstruksi menggunakan metode neighbor-joining.
Open Reading Frame (ORF) Gen AHL-Laktonase B.cereus INT1c dan
B.thuringiensis SGT3g
Hasil analisis dengan ORF Finder menunjukkan bahwa kedua isolat bakteri mempunyai 1 ORF yang diduga dapat mengekspresikan AHL-laktonase yaitu pada orf2 (Gambar 16). Kedua isolat mempunyai orf2 yang sama yang dimulai dari basa ke-14 dan diakhiri pada basa ke 766. Orf2 terdiri atas 752 bp yang menyadikan 250 asam amino. Sekuen gen aiiA dari kedua isolat telah lengkap karena mempunyai start kodon (ATG) dan stop kodon (TAG) (Gambar 17 dan 18).
Gambar 16 Hasil analisis Open Reading Frame (ORF) dari bakteri B.thuringiensis SGT3g (kiri) dan B.cereus INT1c (kanan).
18 14 atgacagtaaagaagctttatttcgtcccagcaggtcgttgtatg M T V K K L Y F V P A G R C M 59 ttagatcattcttctgttaatagtacactcgcgccggggaattta L D H S S V N S T L A P G N L 104 ttgaacttacctgtatggtgttatcttttggagacagaagagggg L N L P V W C Y L L E T E E G 149 cctattttagtagatacaggtatgccagaaagtgcagttaataat P I L V D T G M P E S A V N N 194 gaagggatttttaacggtacatttgttgaaggacagattttaccg E G I F N G T F V E G Q I L P 239 aaaatgactgaagaagatagaatcgtgaatatattaaagcgtgta K M T E E D R I V N I L K R V 284 gggtatgagccggacgaccttttatatattattagttctcactta G Y E P D D L L Y I I S S H L 329 cattttgatcatgcaggaggaaacggtgcttttacaaatacaccg H F D H A G G N G A F T N T P 374 attattgtgcagcgagcggaatatgaggcagcacttcatagagaa I I V Q R A E Y E A A L H R E 419 gaatatatgaaagaatgtatattaccgcatttgaactacaaaatt E Y M K E C I L P H L N Y K I 464 attgaaggggattatgaagtggtaccaggtgttcaattattgtat I E G D Y E V V P G V Q L L Y 509 acgccaggtcattctccaggccatcagtcgttattcattgagacg T P G H S P G H Q S L F I E T 554 gagcaatccggttcagttttattaacaattgatgcatcgtacacg E Q S G S V L L T I D A S Y T 599 aaagagaattttgaagatgaagtgccgttcgcaggatttgatcca K E N F E D E V P F A G F D P 644 gaattagctttatcttcaatcaaacgcttaaaagaagttgtgaca E L A L S S I K R L K E V V T 689 aaagagaaatcgattgttttctttggtcatgatatagagcaggaa K E K S I V F F G H D I E Q E 734 aagggttgtagagtgttcccggagtatatatag 766 K G C R V F P E Y I *
Gambar 17 Hasil analisis sekuen gen aiiA dan asam amino dari bakteri B.cereus INT1c dengan ORF finder.
19 14 atgacagtaaagaagctttatttcgtcccagcaggtcgttgtatg M T V K K L Y F V P A G R C M 59 ttagatcattcttctgttaatggtacactcgcgccggggaattta L D H S S V N G T L A P G N L 104 ttgaacttacctgtatggtgttatcttttggagacagaagagggg L N L P V W C Y L L E T E E G 149 cctattttagtagatacaggtatgccagaaagtgcagttaataat P I L V D T G M P E S A V N N 194 gaagggctttttaacggtacatttgttgaaggacagattttaccg E G L F N G T F V E G Q I L P 239 aaaatgactgaagaagatagaatcgtgaatatattaaagcgtgta K M T E E D R I V N I L K R V 284 gggtatgagccggacgaccttttatatattattagttctcactta G Y E P D D L L Y I I S S H L 329 cattttgatcatgcaggaggaaacggtgcttttacaaatacaccg H F D H A G G N G A F T N T P 374 attattgtgcagcgaacggaatatgaggcagcacttcatagagaa I I V Q R T E Y E A A L H R E 419 gaatatatgaaagaatgtatattaccgcatttgaactacaaaatt E Y M K E C I L P H L N Y K I 464 attgaaggggattatgaagtggtaccaggtgttcaattattgtat I E G D Y E V V P G V Q L L Y 509 acgccaggtcattctccaggccatcagtcgctattcattgagacg T P G H S P G H Q S L F I E T 554 gagcaatccggctcagttttattaacaattgatgcatcgtacacg E Q S G S V L L T I D A S Y T 599 aaagagaattttgaagatgaagtgccgttcgcaggatttgatcca K E N F E D E V P F A G F D P 644 gaattagctttatcttcaattaaacgtttaaaaggagttgtggcg E L A L S S I K R L K G V V A 689 aaagagaaaccaattgttttctttggtcatgatatagagcaggaa K E K P I V F F G H D I E Q E 734 aagggttgtagagtgttccctgagtatatatag 766 K G C R V F P E Y I *
Gambar 18 Hasil analisis sekuen gen aiiA dan asam amino dari bakteri B.thuringiensis SGT3g dengan ORF finder.
20
Domain dan Struktur Model Protein AHL-Laktonase B.cereus INT1c dan
B.thuringiensis SGT3g
AHL-laktonase dari kedua isolat termasuk dalam domain metallo-β -lactamase superfamily. Perbedaan domain kedua isolat terletak pada situs fosforilasi kasein kinase II. Bakteri B.cereus INT1c tidak mempunyai residu treonin nomor 126. Situs aktif pada domain terletak pada urutan asam amino nomor 149-153. Daerah tersebut merupakan situs forsforilasi tirosin kinase (Gambar 19 dan 20). MTVKKLYFVPAGRCMLDHSSVNGTLAPGNLLNLPVWCYLLETEEGPILVDTGMPE SAVNNEGLFNGTFVEGQILPKMTEEDRIVNILKRVGYEPDDLLYIISSHLHFDHA GGNGAFTNTPIIVQRTEYEAALHREEYMKECILPHLNYKIIEGDYEVVPGVQLLY TPGHSPGHQSLFIETEQSGSVLLTIDASYTKENFEDEVPFAGFDPELALSSIKRL KGVVAKEKPIVFFGHDIEQEKGCRVFPEYI
Gambar 19 Hasil analisis domain dari isolat B.thuringiensis SGT3g. Daerah berwarna biru: situs fosforilasi kasein kinase II, dan daerah berwarna kuning: merupakan situs aktif yaitu situs forsforilasi tirosin kinase.
MTVKKLYFVPAGRCMLDHSSVNSTLAPGNLLNLPVWCYLLETEEGPILVDTGMPE SAVNNEGIFNGTFVEGQILPKMTEEDRIVNILKRVGYEPDDLLYIISSHLHFDHA GGNGAFTNTPIIVQRAEYEAALHREEYMKECILPHLNYKIIEGDYEVVPGVQLLY TPGHSPGHQSLFIETEQSGSVLLTIDASYTKENFEDEVPFAGFDPELALSSIKRL KEVVTKEKSIVFFGHDIEQEKGCRVFPEYI
Gambar 20 Hasil analisis domain dari isolat B.cereus INT1c. Daerah berwarna biru: situs fosforilasi kasein kinase II, dan daerah berwarna kuning: merupakan situs aktif yaitu situs forsforilasi tirosin kinase.
Analisis struktur 3 dimensi menunjukkan bahwa protein AHL-laktonase dari kedua isolat mempunyai struktur yang tersusun atas lipatan αβ/βα. Pada salah satu ujung lipatan protein terdapat situs aktif yang ditandai dengan keberadaan ion Zn2+. Ion Zn2+ ini dikoordinasikan oleh beberapa ligan histidin dan aspartat dan mempunyai motif HXHXDH (Gambar 21).
21
Gambar 21 Prediksi struktur 3 dimensi protein AHL-laktonase, kiri: lipatan αβ/βα
dan kanan: motif HXHXDH pada AHL-laktonase.
Titik isoelektrik merupakan pH ketika muatan suatu molekul protein bernilai nol. Bakteri B.thuringiensis SGT3g diprediksi mempunyai titik isoelektrik sebesar 4.81, sedangkan B.cereus INT1c mempunyai titik isoelektrik 4.7. Kedua isolat juga diprediksi mempunyai berat molekul yang sama (Gambar 22 dan 23).
10 20 30 40 50 60
IGSMTVKKLY FVPAGRCMLD HSSVNGTLAP GNLLNLPVWC YLLETEEGPI LVDTGMPESA 70 80 90 100 110 120 VNNEGLFNGT FVEGQILPKM TEEDRIVNIL KRVGYEPDDL LYIISSHLHF DHAGGNGAFT 130 140 150 160 170 180 NTPIIVQRTE YEAALHREEY MKECILPHLN YKIIEGDYEV VPGVQLLYTP GHSPGHQSLF 190 200 210 220 230 240 IETEQSGSVL LTIDASYTKE NFEDEVPFAG FDPELALSSI KRLKGVVAKE KPIVFFGHDI 250
EQEKGCRVFP EYI
pI/Mw: 4.81 / 28.24617
Gambar 22 Prediksi titik isoelektrik (pI) dan berat molekul (Mw) AHL-laktonase dari bakteri B.thuringiensis SGT3g.
10 20 30 40 50 60 MTVKKLYFVP AGRCMLDHSS VNSTLAPGNL LNLPVWCYLL ETEEGPILVD TGMPESAVNN 70 80 90 100 110 120 EGIFNGTFVE GQILPKMTEE DRIVNILKRV GYEPDDLLYI ISSHLHFDHA GGNGAFTNTP 130 140 150 160 170 180 IIVQRAEYEA ALHREEYMKE CILPHLNYKI IEGDYEVVPG VQLLYTPGHS PGHQSLFIET 190 200 210 220 230 240 EQSGSVLLTI DASYTKENFE DEVPFAGFDP ELALSSIKRL KEVVTKEKSI VFFGHDIEQE 250
KGCRVFPEYI
pI/Mw: 4.77 / 28.08093
Gambar 23 Prediksi titik isoelektrik (pI) dan berat molekul (Mw) AHL-laktonase dari bakteri B.cereus INT1c.
Ekspresi Gen aiiA danAkvifitas AHL-laktonase Hasil Kloning
Pemotongan plasmid rekombinan E.coli BL21(DE3) dengan BamHI dan NdeI menghasilkan dua fragmen DNA berukuran 5708 bp dan 800 bp (Gambar 24). Hasil ini membuktikan bahwa plasmid pET15b yang terdapat dalam E.coli
22
BL21(DE3) telah terligasi dengan fragmen gen aiiA dari B.cereus INT1c dan B.thuringiensis SGT3g. Penambahan 1 mM IPTG dapat menginduksi ekspresi gen aiiA dibawah kontrol T7 lac promoter. Penambahan 1 mM IPTG ketika OD600 kultur mencapai 0.6 menghasilkan protein AiiA dengan aktivitas lebih tinggi dibandingkan saat OD600 0.8. Bakteri E.coli rekombinan dengan nilai OD600 0.6 mempunyai aktivitas penghambatan terhadap bakteri C.violaceum. Hal ini ditunjukkan dengan terbentuknya zona berwarna opaque disekitar kertas cakram. Sementara itu bakteri E.coli rekombinan dengan nilai OD600 0.8 tidak menunjukkan aktivitas degradasi terhadap senyawa AHL. Sementara itu pada E.coli BL21(DE3) non rekombinan dan E.coli BL21(DE3) tanpa perlakuan IPTG tidak menunjukkan adanya aktivitas AHL-laktonase (Gambar 25).
Gambar 24 Hasil restriksi plasmid rekombinan dalam E.coli BL21(DE3) dengan enzim restriksi BamHI dan NdeI.
Gambar 25 Bioesai E.coli BL21(DE3) rekombinan dengan bakteri C.violaceum sebagai biokontrol. A. E.coli BL21(DE3) non rekombinan, B dan C. E.coli BL21(DE3) rekombinan tanpa induksi IPTG, D dan E. E.coli rekombinan diinduksi IPTG, B, D, dan F. E.coli rekombinan dengan gen aiiA dari B.cereus INT1c, C, E dan G. E.coli rekombinan dengan gen aiiA dari B.thuringiensis SGT3g.
23 Analisis SDS-PAGE menunjukkan bahwa overexpression gen aiiA dari kedua isolat berhasil dilakukan dalam sel E.coli BL21(DE3) rekombinan dengan induksi IPTG. Hasil ini ditandai dengan terbentuknya pita yang lebih tebal pada sampel protein kedua isolat dibandingkan dengan pita kontrol dan pita E.coli BL21(DE3) rekombinan tanpa perlakuan IPTG. Protein AiiA dari kedua isolat mempunyai berat molekul yang sama dan diprediksi berukuran sekitar 28.77 kDa (Gambar 26).
Gambar 26 Hasil analisis SDS-PAGE protein AiiA rekombinan. Sumur dari kiri ke kanan: (M) Marker, (1) E.coli BL21(DE3) non rekombinan, (2 dan 4) E.coli BL21(DE3) rekombinan yang tidak diinduksi dengan IPTG, (3 dan 5) E.coli BL21(DE3) rekombinan yang diinduksi dengan IPTG, (2 dan 3) E.coli rekombinan dengan gen aiiA dari B.cereus INT1c, (4 dan 5) E.coli rekombinan dengan gen aiiA dari B.thuringiensis SGT3g.
Pembahasan
Enzim pendegradasi AHL dilaporkan banyak terdapat pada kelompok proteobakteria dan disandikan oleh berbagai macam gen seperti aiiA, aiiB, attM, ah1D, dan aiiD (Carlier et al. 2003; Dong et al. 2000; Lin et al. 2003; Park et al. 2003). Isolat B.cereus INT1c dan B.thuringiensis SGT3g terdeteksi mempunyai aktivitas degradasi AHL yang tinggi dari hasil uji kualitatif dengan C.violaceum sebagai biokontrol. Beberapa hasil penelitian juga melaporkan bahwa AHL-laktonase dengan spektrum degradasi substrat yang luas telah banyak ditemukan pada bakteri B.cereus dan B.thuringiensis (Dong et al. 2002; Lee et al. 2002; Flores et al. 2014). Aktivitas degradasi substrat dengan kisaran luas berkaitan dengan mekanisme hidrolisis AHL-laktonase yang tidak dipengaruhi oleh panjang rantai asil dari AHL (Cao et al. 2012; Chen et al. 2013; Lade et al. 2014).
Isolat B.cereus INT1c dan B.thuringiensis SGT3g terdeteksi mempunyai AHL-laktonase yang disandikan oleh gen aiiA, dibuktikan dengan adanya fragmen DNA berukuran 800 bp. AHL-laktonase yang dihasilkan oleh bakteri dari genus Bacillus telah banyak dilaporkan disandikan oleh gen aiiA (Chan et al.
24
2007; Anzhou et al. 2013; Dong et al. 2002; Lee et al. 2002). Fragmen berukuran 800 bp tersebut setelah dianalisis dengan ORF Finder hanya 752 bp yang diprediksi dapat mengekspresikan protein AiiA. Penelitian sebelumnya juga melaporkan bahwa sekuen gen aiiA dari genus Bacillus berukuran sekitar 750 bp yaitu Bacillus sp. 240B1 (750 bp), B.subtilis BS-1 dan Bacillus sp. B546 (753 bp) serta B. thuringiensis 147-11516 (754 bp) (Dong et al. 2002; Pan et al. 2008; Chen et al. 2010; Flores et al. 2014). Eksplorasi gen aiiA dari bakteri kelompok Bacillus akan sangat membantu untuk pengembangan agen biokontrol terhadap bakteri fipatogen penghasil senyawa AHL. Sementara itu beberapa mikroba dilaporkan tidak hanya menghasilkan enzim pendegradasi AHL sebagai mekanisme pertahanan melainkan juga menggunakan molekul hasil degradasinya digunakan untuk pertumbuhan sel (Tinh et al. 2007).
Homologi AiiA telah banyak dikarakterisasi pada bakteri Gram positif dan Gram negatif. Sekuen penyandi aiiA yang beragam membuat gen ini sulit diamplifikasi menggunakan primer spesifik (Anzhou et al. 2013). Primer aiiA yang digunakan untuk deteksi gen penyandi AHL-laktonase dari kedua isolat merupakan primer yang spesifik mengamplifikasi daerah kromosom. Dong et al. (2000) melaporkan bahwa lokasi gen aiiA bukan terletak pada plasmid melainkan pada DNA kromosom. Hal ini dibuktikan dengan kemampuan B.thuringiensis subsp. kurstaki B2 dan B.thuringiensis subsp. israelensis strain B23 untuk menghasilkan AHL-laktonase meskipun telah kehilangan plasmidnya.
Konfirmasi DNA sisipan di dalam plasmid rekombinan dengan primer T7 dan SP6 menghasilkan fragmen DNA berukuran 1000 bp. Perubahan ukuran fragmen DNA terjadi karena adanya penambahan nukleotida. Amplifikasi plasmid rekombinan dengan primer SP6 dan T7 meningkatkan ukuran amplikon sebesar 182 bp. Hal ini sesuai dengan jumlah nukleotida tambahan di daerah MCS yang terletak antara ujung 5' primer T7 dan SP6 (Mukhopadhyaya et al. 2006).
Bakteri B.cereus INT1c dan B.thuringiensis SGT3g mempunyai kesamaan sekuen gen penyandi AHL-laktonase setelah disejajarkan dengan MEGA 5.0 software serta mempunyai karakteristik morfologi yang mirip. Analisis dengan BLAST-X dan pohon filogenetik menunjukkan bahwa keduanya memiliki hubungan kekerabatan yang dekat. Taksonomi dari bakteri B.cereus dan B.thuringiensis sampai saat ini masih menjadi perdebatan. Studi berdasarkan analisis kromosom belum bisa membedakan genetik dari kedua bakteri. Kedua bakteri belum bisa dibedakan termasuk kedalam spesies yang berbeda atau varietas dari spesies yang sama (Ivanova et al. 2003). Hal ini disebabkan B.cereus and B.thuringiensis mempunyai kesamaan pada fenotip dan genotipnya (Oh et al. 2011). Bakteri B.thuringiensis dibedakan dari B.cereus karena mempunyai gen cry di dalam plasmidnya (Helgason et al. 2000).
AHL-laktonase dari kedua isolat diklasifikasikan termasuk dalam domain metallo-β-lactamase superfamily. Analisis struktur 3 dimensi protein juga menunjukkan AHL-laktonase mempunyai motif HXHXDH dan ion Zn2+ pada situs aktifnya. Dong et al. (2000) melaporkan bahwa motif HXHXDH bersifat lestari pada protein AiiA. Namun motif tersebut tidak dimiliki oleh AHL-laktonase golongan AidH (Ang et al. 2013). Ion Zn2+ mempunyai peranan penting pada aktivitas katalitik AHL-laktonase yang dikoordinasikan oleh sejumlah ligan histidin dan aspartat. Zn1 dikoordinasikan oleh His104, His106, His169 dan ion hidroksida (OH-), sedangkan Zn2 dikoordinasikan oleh His109, His235, Asp108,
25 Asp191 dan ion hidroksida (OH-) (Liu et al. 2005; Momb et al. 2008). Analisis struktur kristal dari B.cereus menunjukkan bahwa residu histidin pada motif HXHXDH terlibat dalam pengikatan ion Zn2+, sedangkan residu aspartat terlibat dalam reaksi katalisis (Carfi et al. 1995). Dong et al. (2000) juga melaporkan bahwa penggantian residu histidin pada motif HXHXDH dengan residu serin dan leusin menyebabkan akifitas AHL-laktonase menurun. AHL-laktonase merupakan enzim yang sangat spesifik dengan motif katalitik 106HXDH109~H169. Aktivitas enzim tidak bergantung pada ion Zn atau ion logam meskipun AHL-laktonase mempunyai ion Zn2+ pada pusat katalitiknya,. Hal ini yang menyebabkan AHL-laktonase dibedakan dengan kelompok metallo-β-lactamase superfamily yang lain walaupun mempunyai struktur dan motif yang identik (Wang et al. 2004; Chen et al. 2013).
Hasil prediksi titik isoelektrik mengindikasikan bahwa AHL-laktonase yang dihasilkan oleh B.thuringiensis SGT3g dan B.cereus INT1c merupakan protein yang bersifat asam dengan titik isoelektrik sebesar 4.7 dan 4.8. Wang et al. (2004) juga melaporkan bahwa protein AiiA merupakan protein yang bersifat asam dengan titik isoelektrik 4.17. Pada titik isoelektriknya struktur protein menjadi lebih hidrofobik dan lebih kompak, namun menjadi kurang stabil karena tidak adanya gaya tolak antar partikel (Salgin et al. 2006; Patil et al. 2007). Hal ini membuat protein lebih mudah membentuk agregat dan mengendap pada titik isoelektriknya (Salgin et al. 2012). Interaksi elektrostatik diantara muatan residu asam amino berperan penting dalam mempertahankan konformasi protein AHL-laktonase. Struktur konformasi asimetris AHL-laktonase tidak berubah pada pH 7-9, sedangkan perubahan pH menjadi 5 membuat AHL-laktonase menjadi kehilangan struktur asimetrisnya (Wang et al. 2004).
Bioesai aktivitas AHL-laktonase menunjukkan bahwa E.coli BL21(DE3) rekombinan dapat menghambat produksi pigmen violacein pada bakteri C.violaceum. Bakteri C.violaceum merupakan bakteri Gram negatif yang menggunakan mekanisme quorum sensing untuk membentuk pigmen violacein. Bakteri tersebut menghasilkan senyawa AHL sebagai molekul sinyal yang disintesis oleh CviI (McClean et al. 1997; Duran dan Menck 2001; Stauff dan Blasser 2011). Gen penyandi AHL-laktonase dari kedua isolat diekspresikan setelah kultur diinduksi dengan IPTG pada fase eksponensial. Induksi dengan IPTG ketika OD600 kultur mencapai 0.6 dapat menghasilkan protein AiiA rekombinan dengan aktivitas yang tinggi, sedangkan induksi IPTG ketika OD600 kultur mencapai 0.8 tidak dapak menginduksi ekspresi gen aiiA. Induksi E.coli rekombinan dengan IPTG pada awal fase eksponensial dapat meningkatkan aktivitas protein rekombinan yang dihasilkan, sedangkan induksi pada akhir fase lag dapat menghambat pertumbuhan sel (Kwon et al. 2002; Olaofea et al. 2012).
Bakteri E.coli rekombinan umumnya menghasilkan protein tidak larut dalam bentuk agregat yang disebut sebagai inclusion bodies yang memiliki aktivitas rendah. Protein tersebut tidak disekresikan ke lingkungan. Namun pada bioesai AHL-laktonase menggunakan kultur E.coli rekombinan menunjukkan adanya aktivitas degradasi senyawal AHL yang dihasilkan oleh bakteri C.violaceum. Lee et al. (2002) juga melaporkan bahwa bioesai AHL-laktonase dari kultur E.coli rekombinan dapat mengurangi sifat virulen bakteri Erwinia carotovora IBN98 pada tanaman kentang. Yang et al. (2011) melaporkan bahwa bakteri E.coli dapat mengekspresikan protein terlarut sebesar 30%, sedangkan
26
sisanya terdapat dalam bentuk inclusion bodies. Kondisi lingkungan akan sangat mempengaruhi aktivitas protein serta jumlah protein terlarut dan tidak larut yang dihasilkan oleh E.coli rekombinan. Ekspresi protein rekombinan dilaporkan dipengaruhi oleh berbagai faktor seperti waktu induksi, lama inkubasi setelah induksi, suhu inkubasi, jenis vektor serta inang yang digunakan (Picaud et al. 2007; Dang et al. 2012; Fang et al. 2014; Piubelli et al. 2013). Molina et al. (2003) melaporkan bahwa mekanisme degradasi AHL oleh protein AiiA yang tidak disekresikan keluar sel dapat terjadi di dalam sitoplasma. AHL merupakan molekul sinyal yang dapat keluar masuk melalui membran sel secara difusi maupun melalui transport aktif. AHL yang telah terakumulasi di lingkungan akan berdifusi kembali ke dalam sel dan didegradasi oleh protein AiiA di dalam sitoplasma. Dengan demikian jumlah molekul AHL dilingkungan dapat berkurang tanpa perlu mensekresikan protein AiiA keluar sel.
Ekspresi gen aiiA dari kedua isolat dalam sel E.coli BL21(DE3) menghasilkan protein AiiA dengan berat molekul berukuran 28.77 kDa. Berat molekul tersebut hampir sama dengan berat molekul hasil prediksi di situs EXPASY berdasarkan sekuen asam amino dari kedua isolat (http://web.expasy.org/compute_pi/). Lee et al. (2002) melaporkan bahwa gen aiiA dari isolat B.thuringiensis subsp. morrisoni dan B.thuringiensis subsp. kyushuensis berhasil dieskspresikan dalam sel E.coli BL21(DE3) dan menghasilkan protein AiiA dengan berat molekul sekitar 28 kDa. Bakteri B.thuringiensis 47-11516 dan Bacillus sp. 240B1 juga dilaporkan menghasilkan protein AiiA dengan berat molekul sekitar 28 kDa (Flores et al. 2012; Dong et al. 2000).