DAFTAR LAMPIRAN
II. TINJAUAN PUSTAKA A PROBIOTIK
Probiotik adalah sediaan sel mikroba hidup yang memiliki pengaruh menguntungkan terhadap kesehatan dan kehidupan inangnya (Salminen et al., 1999). Efek positif dari aktivitas probiotik terbagi dalam tiga aspek, yaitu nutrisi, fisiologi, dan antimikroba. Aspek nutrisi berasal dari penyediaan enzim yang membantu metabolisme penyerapan laktosa (laktase), sintesis beberapa jenis vitamin (vitamin K, asam folat, piridoksin, asam pantotenat, biotin, dan riboflavin), serta dapat menghilangkan racun hasil metabolit komponen makanan di usus. Aspek fisiologis meliputi kemampuan untuk menjaga keseimbangan komposisi mikrobiota usus sehingga menekan resiko infeksi penyakit dan menstimulasi sistem kekebalan tubuh. Aspek kemampuan antimikroba dinyatakan melalui kemampuan memperbaiki ketahanan terhadap patogen (Naidu dan Clemens, 2000). Namun aktivitas terhadap patogen ini juga dapat berasal dari kemampuan adhesi yang dimiliki probiotik (Colladoet al., 2007b).
Probiotik menurut FAO/WHO (2001) adalah mikroorganisme hidup yang masuk dalam jumlah yang cukup sehingga dapat memberikan manfaat kesehatan bagi inang. Jumlah yang cukup yang dimaksud oleh FAO/WHO (2001) ini adalah 106-108 cfu/g dan diharapkan dapat berkembang menjadi 1012cfu/ g di dalam kolon.
International Dairy Federation (IDF) memberikan standar jumlah minimum probiotik hidup sebagai acuan adalah 106 koloni/ml pada produk akhir (Indratingsihet al., 2004). Jumlah probiotik hidup harus mampu untuk melewati kondisi lingkungan yang kurang menguntungkan, seperti terekspos asam lambung dan garam empedu, sehingga masih memiliki aktivitas fisiologis (Charteriset al., 1998).
Probiotik dipasarkan dalam bentuk kapsul, tablet, powder, granula, pasta, makanan, dan suplemen (Ray, 1996). Kneifel et al. (1999) juga menyatakan probiotik sering ditambahkan ke dalam produk pangan non-
fermentasi, seperti makanan formula bayi, jus buah, dan krim biskuit. Aplikasi probiotik ke dalam produk krim terbukti dapat meningkatkan IgA pada balita (Rieuwpassa, 2005). Produk yang mengandung probiotik dikategorikan sebagai pangan fungsional (Kneifel et al., 1999; Hoover, 2000) dan di Indonesia hal ini telah resmi dinyatakan dalam Peraturan Pangan Fungsional dari BPOM tahun 2005, namun belum secara spesifik dinyatakan regulasi dan jumlah minimal kandungannya.
Probiotik juga dapat menghambat bakteri patogen, melakukan metabolisme terhadap laktosa sehingga bermanfaat bagi penderita intoleran laktosa (Rusilanti, 2006). Efek positif dari konsumsi probiotik bagi kesehatan adalah mencegah diare karena dapat melawan rotavirus, menstimulasi sistem imun, mencegah pembengkakan usus (irritable bowel diseases), memberi manfaat bagi penderita intoleran laktosa, membantu mengatasi alergi, menurunkan resiko kanker, mencegah infeksi patogen di saluran pernapasan, mencegah konstipasi, dan menurunkan kadar kolesterol (Schmidet al., 2006).
Probiotik dapat merupakan mikroorganisme yang umum ditemukan dapat tumbuh di saluran pencernaan manusia maupun pada beberapa sumber pangan fermentasi yang umumnya merupakan Bakteri Asam Laktat atau BAL (Hamilton-Miller, 2003 dalam Hayouni et al., 2008). Kelompok bakteri yang umumnya hidup dalam saluran cerna manusia dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel tersebut menunjukkan bahwa pada manusia normal terdapat lima kelompok bakteri utama, dengan kelompok terbesar adalahEnterococcus dan
Bacteroides. Tabel 1 menunjukkan isolasi dari feses telah mewakili mikroorganisme yang ada di dalam saluran pencernaan manusia karena jumlahnya tidak berbeda jauh. Perbedaan jumlah diakibatkan kondisi pH dan juga kemampuan menempel mikroorganisme dalam saluran pencernaan.
Tabel 1 Populasi rata-rata kelompok bakteri utama pada usus manusia
Kelompok Bakteri Jumlah Bakteri (log10CFU/ml) Jejunum Ileum Kolon Feses
Lactobacillus 3 5 6 6
Gram positif, tidak berspora, anaerob 2 2 5 6
Enterococcus 3 5 7 7
Enterobacteriaceae 3 4 6 8
(Sumber: Ray, 1996)
Pemberian klaim probiotik harus terlebih dahulu melalui seleksi pemenuhan syarat probiotik. Syarat yang harus dipenuhi oleh galur probiotik dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1 Kriteria strain probiotik (Saarelaet al.,2000dalamSurono, 2004b)
Shortt (1999) menyatakan bahwa probiotik pada umumnya berasal dari BAL, namun tidak semua BAL merupakan probiotik. Golongan BAL dinamakan demikian karena menghasilkan produk utama asam laktat dalam proses metabolismenya. Sumber karbohidrat difermentasi melalui jalur Embden-Meyerhoff Parnas (EMP) menghasilkan 2 molekul asam piruvat yang kemudian diubah menjadi 2 molekul asam laktat (Surono, 2004b). Proses fermentasi ini menghasilkan 2 molekul ATP sebagai sumber energi bagi BAL. Proses ini terjadi apabila tidak ada oksigen, sehingga proses glikolisis tidak dilanjutkan dengan fosforilasi oksidatif, namun perubahan asam piruvat menjadi asam laktat (Mandelstam dan McQuillen, 1989). Jalur fermentasi asam laktat dapat dilihat pada Gambar 2.
Aman di makanan & klinis Asal manusia Tahan asam & empedu Melekat ke sel usus Bertahan di saluran usus Terbukti memberi efek kesehatan Antagonis terhadap patogen Produksi anti mikroba
Gambar 2 Jalur fermentasi asam laktat (www.rogers.k12.ar.us)
BAL adalah bakteri yang dapat bertahan pada kisaran pH yang luas, sehingga sebagai besar memenuhi klaim probiotik dengan syarat toleransi terhadap asam. Hal ini disebabkan bila probiotik masuk ke dalam saluran pencernaan manusia, maka probiotik harus bertahan dari pH asam lambung sekitar 2 (Almatsier, 2005). Mayes (1996) dalam Evanikastri (2003). menyatakan konsentrasi HCl sebesar 0.2 – 0.5% membuat pH lambung menjadi 1 apabila dalam keadaan benar-benar kosong.
Ketahanan BAL terhadap pH rendah karena kemampuannya mempertahankan pH internal lebih alkali dibanding pH eksternal serta dengan mempunyai membran sel yang lebih tahan terhadap kebocoran sel akibat terpapar pH rendah (Bender et al., 1996). Kepekaan bakteri terhadap asam dapat tergantung pada kerja simultan dari faktor-faktor tambahan lain, seperti aktivitas air, kadar garam, potensi redoks, perlakuan panas, dan lain-lain (Jenie, 1996).
Ducluzeau et al. (1991) melengkapi dengan pernyataan beberapa probiotik yang telah umum dan aman dipakai, yaitu Lactobacillus acidophillus, L.casei, L.plantarum, Streptococcus cremoris, S. lactis, Enterococcus faecium, Leuconostoc mesentroides, Propionibacterium shermanii, Pediococcus acidilactii, P. cerevisiae, Bifidobacterium adolescentis, B. coagulans, Bacteroides amylophilus, Saccharomyces cerevisiae, Torulopsis candida, Aspergillus niger, dan A. oryzae. Probiotik yang umum dipakai juga dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2 Probiotik yang umum dipakai Bakteri Khamir Lactobacillus bulgaricus L. acidophilus L. paracasei Streptococcus thermophillus Enterococcus faecium E. faecalis Bifidobacterium pseudolongum B. thermophilum B.breve B.bifidum Bacillus cereus B.toyoi B. subtilis Saccharomyces cerevisiae S.boulardi
(Sumber: Leeet al., 1999 dalam Metzleret al., 2005) 1. Enterococcus faeciumIS-27526
Enterococcus merupakan kelompok spesies dalam genusStreptococcus, selain Lactococcus, Streptococcus, dan Vagococcus (Surono, 2004b). Klasifikasi ini berdasarkan gen 16S rRNA dalam bidang biologi molekuler. E. faeciumterdiri dariE. faecium, E. durans, E. hirae, E. mundtii, E. villorum, E. canis,danE. azikeevi (Salminenet al., 1999). Golongan enterokoki seringkali masih dikenal rancu antara fungsinya sebagai probiotik karena manfaat dan keberadaannya secara natural di saluran pencernaan manusia, berbanding dengan perannya yang dikenal sebagai patogen dan resisten terhadap antibiotik.
E. faeciumyang dikenal sebagai probiotik banyak ditemui pada saluran pencernaan hewan seperti babi, sapi, domba, dan ayam. JumlahE .faecalis di saluran pencernaan hewan sebesar 105 – 107 cfu / gram mengungguli jumlah
E.faecium yang hanya sejumlah 104 – 105 cfu/ gram. Selain itu E. faecium
banyak ditemukan pada makanan, khususnya produk daging olahan babi dan keju (Salminenet al., 1999).
Netherwood et al. (1999) menggunakan ayam berumur 1 hari hingga 4 minggu untuk diberi probiotik 105 cfu/g. Pemberian probiotik dilakukan selama 28 hari dengan pasca perlakuan selama 7 hari. Setelah 4 minggu terjadi peningkatanE. faeciummenjadi 107 cfu/g di usus. KeberadaanE. faecium ini dapat menghambat keberadaanE. faecalis.
Probiotik E. faecium adalah isolat asal dadih, yaitu produk fermentasi tradisional yang terbuat dari susu kerbau (Akuzawa dan Surono, 2002). Pada dadih terdapat pertumbuhan BAL dan salah satu strain yang diperoleh adalah
E. faecium IS-27526. Strain ini telah terbukti sebagai probiotik karena tahan asam lambung, garam empedu, dapat menempel di mukosa usus, dan dapat melawan bakteri patogen (Collado et al., 2007a; 2007b). Probiotik ini juga telah diidentifikasi secara molekuler dengan teknik Polymerase Chain Reaction.
E. faecium IS-27526 terbukti secara signifikan meningkatkan total serum imunoglobulin A (IgA) pada anak balita (Surono 2004a; Rieuwpassa 2005). Konsumsi susu yang ditambahkan dengan probiotikE. faeciumIS-27526 juga secara signifikan dapat meningkatkan konsentrasi total serum IgA pada kaum lanjut usia dengan selang kepercayaan 95% (Rusilanti, 2006).
2. Lactobacillus plantarumIS-10506
Lactobacillus plantarum termasuk salah satu spesiesLactobacillus yang diperoleh dari isolat beberapa makanan tradisional, misalnya saja dadih dan tempoyak. Bakteri ini juga sering ditemui pada pikel, sawi asin dan sauerkraut. Bakteri ini diketahui dapat menghambat pertumbuhan bakteri perusak makanan sehingga seringkali digunakan dalam pengawetan produk pangan. Efek antimikroba ini berasal dari produksi asam-asam organik dan salah satunya adalah asam laktat (Larsen et al., 1993). Asam laktat yang dihasilkan akan menurunkan pH dan menghasilkan penghambatan luas pada bakteri (Jenie, 1996).L. plantarummemiliki nilai pH minimum pertumbuhan 3.34 (Jay, 1996).
L. plantarum merupakan BAL berbentuk batang lurus dengan kisaran lebar 0.9 – 1.2 µm dan panjang 3 µm, berukuran tunggal atau membentuk rantai pendek, serta merupakan gram positif (Salminen dan Wright, 1998). L. plantarum mampu memfermentasi glukosa membentuk produk DL-asam laktat tanpa gas. L. plantarum dapat memfermentasi amigdalin, selobiosa, laktosa, manitol, sukrosa, galaktosa, maltosa, sorbitol, dan trehalosa.
Kemampuan memfermentasi melibosa dan rafinosa membedakan L. plantarumdanL. casei. (Onoet al., 1992).
Koloninya berwarna putih atau kuning dan beberapa galur bersifat motil. Koloni bakteri ini dalam media agar mempunyai ciri - ciri bulat, licin, padat, putih, kadang-kadang kuning terang atau gelap, berdiameter 3 mm, bersifat anaerobik fakultatif. Bakteri ini dapat tumbuh pada suhu 15oC pada umumnya dan tidak dapat tumbuh pada suhu 45oC, dengan suhu optimalnya berkisar 30- 35oC (Gilliland, 1986).
Strain L. plantarum IS-10506 merupakan hasil isolasi dari dadih yang telah terbukti sebagai probiotik. Penelitian yang telah dilakukan oleh Collado
et al.(2007b) menunjukkan kemampuanL. plantarumIS-10506 yang tertinggi di antara strain probiotik asal dadih lainnya dalam pengujianbacteriological adhesion to hydrocarbon(BATH) untuk melihat hidrofobisitas permukaan sel BAL dan dalam pengujian autoagregasi. Kemampuan autoagregasi ini merupakan faktor penting dalam kolonisasi di saluran pencernaan.
Kemampuan adhesi yang tinggi ini memperkuat klaim probiotik L. plantarumIS-10506 yang berdasarkan penelitian Colladoet al.(2007a) bahwa
L. plantarumIS-10506 memiliki kemampuan terbaik dalam interaksi melawan adesi patogen.
3. Lactobacillus caseistrain Shirota
Lactobacillus acidophillus dan Lactobacillus casei merupakan bakteri yang sering terdapat di usus manusia, mampu mencapai usus dan tetap berada di dalamnya, tahan bakteriosidal, getah lambung, dan cairan empedu (Yakult Honsha, 1990; Winarno, 2003). Speck (1978) menyatakan bahwa L. casei
dapat diisolasi dari saluran usus manusia dan Robinson (1981) menambahkan bahwaL. caseidapat diisolasi dari susu dan produk turunan susu.
L. casei strain Shirota, pertama kali ditemukan oleh Dr. Shirota tahun 1935, memiliki ukuran panjang 1.5 – 5.0 μm dan lebar 0.6 – 0.7 μm (Mutai, 1981). L. casei strain Shirota merupakan bakteri dengan morfologi bentuk batang, koloni tunggal atau berantai, gram positif, katalase negatif, tidak
berspora atau flagel, dan fakultatif anaerob. Bakteri ini hidup baik pada 15 – 41oC dan pH 3.5 atau lebih (Meutia, 2003).
L. casei strain Shirota termasuk homofermentatif yang memecah glukosa menjadi asam laktat 90% dengan sejumlah kecil asam sitrat, malat, asetat, suksinat, asetaldehid, diasetil, dan asetoin yang berperan dalam pembentukan flavor (Selamat, 1992).L. casei tidak memproduksi amonia dari arginin, dapat memfermentasi amigdalin, manitol, solobiosa, dan salisin. L. caseijuga tidak dapat memfermenrasi substrat melobiosa, rafinosa, rhamnosa, gliserol dan jarang memfermentasi inositol atau sorbosa (Robinson, 1981).
Konsumsi susu fermentasi dengan kandunganL. casei strain Shirota pada manusia memiliki potensi menurunkan resiko kanker kandung kemih (Ohashi et al., 2002). Penelitian lain dilakukan oleh Ishikawa et al. (2005) menunjukkan L.casei strain Shirota juga berpotensi mencegah kanker pada saluran kandung kemih pada studiin vivo.
Penelitian terkait peran L.casei strain Shirota pada sistem imun dilakukan oleh Nagao et al. (2000) yang menunjukkan bahwa asupan L. casei strain Shirota dapat meningkatkan aktivitas sel Natural Killer (NK) pada manusia. Penelitian lanjutan membuktikan bahwa aktivitas sel NK dapat ditingkatkan oleh L. casei strain Shirota pada manusia yang memiliki kebiasaan merokok (Morimotoet al., 2005).