Virus Hepatitis B merupakan hepadnavirus berukuran 42 nm yang memiliki selubung luar lipoprotein dengan protein permukaan HBsAg (Gambar 1). Virus ini memiliki inti 27 nm berupa nukleokapsid (HBcAg) dengan genom berupa DNA utas ganda berbentuk sirkular parsial (parsial overlapping). Famili hepadnaviridae juga mencakup genus Orthohepadnavirus yang dapat menginfeksi primata seperti Woodchuck Hepatitis Virus (WHV), Ground Squirrel Hepatitis Virus (GSHV) dan genus avihepadnavirus yang dapat menginfeksi unggas seperti Duck Hepatitis B Virus. Famili Hepadnavirus memiliki lingkup inang yang terbatas, dimana hanya dapat menggunakan inang yang memiliki kedekatan spesies terhadap inang aslinya. (WHO 2002).
Gambar 1 Virus Hepatitis B (Stannard 1995)
Gambar 2 Bagan spektrum penyakit hati akibat infeksi VHB
Definisi kasus hepatitis B, pasien dianggap menderita hepatitis akut apabila secara klinis menunjukkan gejala pusing, anorexia, demam, mual, sakit pada bagian perut, dan adanya gejala penyakit kuning atau peningkatan serum alanine aminotransferase. Secara laboratorium, pada pasien IgM terhadap HBcAg atau HBsAg terdeteksi. Pasien dianggap menderita hepatitis B kronis apabila secara klinis menunjukkan berbagai gejala dari cirrhosis atau kanker hati. Selain itu pasien kronis juga dapat asimptomatis atau tanpa gejala penyakit. Pada tahapan kronis pasien secara laboratorium menunjukkan hasil negatif terhadap IgM anti HBc dan positif terhadap HBsAg, HBeAg, VHB DNA atau kombinasi hasil positif pada HBsAG, HBV DNA / HBeAg dalam jangka waktu 6 bulan. Virus ini tidak menghasilkan efek sitopatik, sehingga diduga patogenesa virus ini merupakan hasil dari pertahanan tubuh bermediasi sel (CDC 2009; WHO 2002).
Infeksi VHB umum terjadi pada masa kanak-kanak dan tidak menunjukkan gejala penyakit sampai ke tahapan karier kronis. Transmisi virus dapat terjadi melalui pertukaran cairan tubuh, tindakan seksual, dan penularan dari ibu yang positif ke anaknya pada saat proses melahirkan (WHO 2002).
Virus Hepatitis B menginfeksi sel dengan mediasi reseptor sel hepatosit, selanjutnya inti virus (DNA open circular) akan dipindah kedalam sel dan membentuk Covalently Closed Circular (cccDNA) dengan bantuan nuclear DNA repair enzymes. Tahapan selanjutnya genom VHB akan melakukan transkripsi 4 bagian secara overlap (P, C, S, dan X) dan kemudian dikeluarkan menuju sitoplasma untuk ditranslasikan menjadi protein virus.
Gen P mengkodekan DNA polymerase/reverse transcriptase, gen C mengkodekan protein inti (core), gen S mengkodekan protein permukaan (surface), dan protein X. Gen C terbagi menjadi pre-C dan C. Gen S terbagi menjadi region pre-S1, pre-S2, dan small S. Gen S memiliki peranan penting dalam proses infeksi VHB. Gen pre-S1 secara khusus berfungsi untuk mediasi pengikatan VHB pada sel hepatosit manusia (Glebe et. al 2003).
Hasil transkripsi gen P sebesar 3,5 kb membentuk enzim polimerase VHB, protein inti (HBc), protein precore, dan juga fragmen sebagai cetakan pRNA (pregenomic RNA, merupakan hasil transkripsi balik pada saat replikasi virus). Protein precore memiliki sekuen target untuk transportasi ke ER untuk proses lebih lanjut menjadi HbeAg. Hasil transkripsi gen S sebesar 2,4 kb dan 2,1 kb menghasilkan selubung luar serta protein permukaan HBs. Sedangkan penelitian pada Woodchuck Hepadna Virus mengindikasikan hasil transkripsi 0,7 kb berupa protein X berguna dalam proses inisiasi infeksi. (Guha 2004; Spandau 1988; Standring 1988; WHO 2002).
Tupaia sp.
Tupaia sp. merupakan hewan bukan pengerat yang memiliki kekerabatan yang dekat dengan primata. Termasuk dalam ordo Scandentia dan Famili Tupaiidae, hewan ini endemik pada daerah subtropikal dan tropikal seperti asia tenggara. Terdapat pada wilayah India sampai Philipina, Cina selatan hingga Jawa, Kalimantan, Sumatera, dan Bali. Habitat alaminya berapa pada hutan tropis dan area perkebunan (Kock et al 2001).
Pada infeksi in vivo, VHB dapat melakukan replikasi pada hati tupaia. Infeksi secara akut dapat dideteksi viremia dan HbsAg, dan juga keberadaan antibodi terhadap HBeAg dan HBsAg. Kondisi ini menyerupai pada pasien infeksi akut yang diderita oleh manusia. Lebih lanjut imunisasi dengan vaksin VHB dapat mencegah 88% infeksi VHB eksperimental. Pada kasus kronis peneliti menemukan induksi pembentukan HCC (Guha 2004). Selain secara in vivo, kultur primer hepatositnya mudah disiapkan dengan metode perfusi (Kock et al 2001).
Virus Hepatitis B dapat menginfeksi sel primer hepatosit hasil isolasi hati tupaia, sehingga dihasilkan cccDNA dan mRNA dan sekresi HBsAg dan HbeAg pada media kultur. Proses awal infeksi VHB pada sel primer hepatosit tupaia (PTH) sangat menyerupai proses infeksi pada sel hepatosit manusia (Glebe et al
2003; Walter 1996). Oleh karenanya, penggunaan tupaia sebagai hewan model infeksi VHB dapat dilakukan secara in vivo dan in vitro.
Kultur Primer
Kultur primer merupakan kultur sel in vitro yang diisolasi langsung dari suatu organisme. Kultur sel primer dapat diperoleh dengan melakukan agregasi jaringan secara mekanik ataupun secara enzimatis. Proses agregasi menjadi salah satu tahapan vital untuk memperoleh kultur sel primer yang spesifik. Sel dari kultur primer memiliki banyak kesamaan dengan sel in vivo, sehingga kultur primer dapat dijadikan sistem pemodelan untuk mempelajari sistem biologi seperti pemodelan inang untuk agen mikrobiologis, dalam hal ini virus (Freshney 1994).
METODOLOGI
Penelitian isolasi dan deteksi virus hepatitis B asal manusia dan satwa primata pada kultur primer hepatosit T. javanica dilakukan selama 8 bulan dimulai dari Maret 2012 sampai bulan Desember 2012. Tempat penelitian adalah fasilitas Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi, Pusat Studi Satwa Primata LPPM-IPB, Jalan Lodaya II nomor 5, Bogor.
Bahan
Bahan penelitian yang digunakan antara lain sel hepatosit yang diisolasi dari organ hati T. javanica. Sampel virus menggunakan VHB asal manusia serta VHB asal Owa (Hylobates moloch). Sampel virus yang digunakan berasal dari koleksi Pusat Studi Satwa Primata, IPB. Pada reaksi Polymerase Chain Reaction (PCR) dan real time PCR digunakan primer hepB-SF1 dengan sekuen 5’- TGYGGGTCACCWTATTCTTG GG-3’ dan hepB-SRout yang memiliki sekuen 5’-CACTGTTCCTGAACTGGA GC-3’. IQ5 Sybr green master mix, asam askorbat, Ethidium Bromida, gel agarosa 2%, dan larutan penyangga Tris Acetate EDTA (TAE).
Media yang digunakan ialah larutan Phosphate Buffer Saline (PBS), Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM) (Invitrogen, USA; cat# 11965- 092), larutan penyangga pra-perfusi berisi Hanks Balanced Salt Solution
(Invitrogen cat#14170-112); 5mM EGTA; 0,25 µg/ml amphotericin B, larutan perfusi berisi DMEM; 100x CaCl2; 1% kolagenase tipe II, Tupaia plating media
berisi 500 ml William E media (invitrogen cat# 12551-032); 5% Fetal Bovine Serum; 5 µg/ml insulin; 5 µg/ml transferrin; 5 µg/ml sodium selenite; 0,25 µg/ml amphotericin B; dan 1% Penicillin streptomicin. Tupaia maintenance media berisi 500 ml William E media (invitrogen cat# 12551-032); 0,1% Bovine Serum Albumin; 5 µg/ml insulin; 5 µg/ml transferrin; 5 µg/ml sodium selenite; 0,25 µg/ml amphotericin B; 1% Penicillin streptomicin; 50 µM hydrocortisone (sigma); dan 0,1 µM dexamethasone (sigma). Tupaia infection media berisi 500 ml William E media (invitrogen cat# 12551-032); 0,1% Bovine Serum Albumin; 2% Dimethyl Sulfoxide; 0,25 µg/ml amphotericin B; dan 1% Penicillin streptomicin.
Alat
Analisa semi kuantitatif real time PCR menggunakan mesin IQ5 Multicolor Real Time PCR Detection System dari Biorad.
Metode Isolasi Kultur Primer Hepatosit T. Javanica
Hewan dieutanasia dengan menggunakan pentobarbital dengan dosis 75 mg/kg berat badan IM. Dalam penelitian ini digunakan 3 ekor T. Javanica. Hewan lalu diletakkan pada papan bedah dengan organ geraknya difiksasi pada papan. Kulit dipotong dari perut hingga rongga dada. Seluruh rongga dada direndam dengan larutan PBS. Selaput rongga perut kemudian dipotong dan dibuang. Semua prosedur hewan sudah mendapatkan persetujuan dari Komisi Pengawasan Kesejahteraan dan Penggunaan Hewan Penelitian (KPKPHP) Pusat Studi Satwa Primata IPB nomor ACUC 11-D001-IR
Metode isolasi mengacu pada Glebe et al. (2003). Daerah diatas situs pemotongan dijepit, lalu secara perlahan dimasukan syringe pada pembuluh portal hati. Pembilasan sel darah merah dari organ hati dilakukan secara perlahan dengan menggunakan larutan DMEM yang telah dihangatkan. Pembilasan berhasil ditandai dengan perubahan warna organ hati menjadi lebih cerah. Organ hati tanpa kantung empedu dapat dipindahkan ke cawan petri.
Organ hati diperfusi menggunakan larutan penyangga pra-perfusi menggunakan syringe dengan kecepatan 10 ml/menit selama 10-15 menit. Selanjutnya digunakan larutan perfusi selama 15 menit. Larutan diresirkulasi sampai hati menjadi semi padat. Organ lalu dicacah dan dipindahkan dalam flask
berisi larutan penyangga perfusi. Sel diinkubasi pada suhu 37°C dan digoyangkan selama 5-10 menit. Larutan kemudian disaring perlahan dengan menggunakan
gauze mesh (pori 75 µm). Larutan dipindahkan kedalam tabung falcon 50 ml. Tabung lalu disentrifugasi pada 300-500 g selama 5 menit untuk mendapatkan pelet sel. Supernatan dibuang secara perlahan dan pelet diresuspensi dengan larutan DMEM. Pencucian dengan larutan DMEM dilakukan kembali.
Sel lalu diresuspensi dengan menggunakan tupaia plating media. Penghitungan viabilitas sel dilakukan dengan menggunakan asam askorbat dan haemocytometer. Sel diinkubasi dengan konsentrasi 2,5x105 sel pada 6-well dish
(yang telah dilapisi dengan kolagen) berisi 2 ml tupaia plating media. Sel kemudian diinkubasi pada 37°C 5% CO2 semalam untuk melekatkan sel pada
dinding 6-well dish. Media diganti dengan tupaia maintenance media untuk membuang sel-sel yang mati yang tidak berikatan dengan dinding petri. Sel dinkubasi pada 37°C 5% CO2.
Sampel Virus Hepatitis B
Virus yang digunakan sebagai inokulan merupakan VHB asal manusia serta VHB asal owa (Hylobates moloch). Seluruh virus yang digunakan berasal dari koleksi Pusat Studi Satwa Primata, IPB.
Infeksi Virus Pada Kultur Primer Hepatosit
Prosedur mengacu pada Glebe et al. (2003). Larutan media pada sel dibuang dan ditambahkan larutan inokulan. Sel diinkubasi selama semalam. Setelah infeksi, media dibuang, lalu kultur dibilas dengan tupaia maintenance media,
selanjutnya kembali ditambahkan tupaia maintenance media.
Penggambilan 500 µl supernatan media sebagai sampel dilakukan setiap hari kemudian ditambahkan kembali 500 µl tupaia maintenance media kedalam kultur primer hepatosit. Sampel supernatan media disimpan untuk analisa lebih lanjut. Produk VHB yang terdapat pada supernatan akan tetap stabil selama beberapa bulan dengan penyimpanan pada suhu 4°C. Pengujian VHB pada sampel supernatan dilakukan denganPCR regio pre-S1 dan real time PCR.
Amplifikasi DNA VHB Pada Supernatan Untuk Sekuen Regio Pre-S1
Amplifikasi DNA menggunakan metode PCR dilakukan dengan menggunakan DNA sampel yang diekstraksi dari supernatan. Proses ekstraksi menggunakan kit Dneasy blood and tissue (Qiagen cat. 69504).
Metode amplikasi DNA mengacu pada Warren et al. (1999). Pasangan primer yang digunakan ialah hepB-SF1 Dengan sekuen 5’-
TGYGGGTCACCWTATTCTTGGG-3’ dan hepB-SRout yang memiliki sekuen 5’-CACTGTTCCTGAACTGGAGC-3’. Pasangan primer tersebut memiliki target produk kurang lebih 455 pasang basa. Primer yang digunakan merupakan
degenerate primer, yang diharapkan mampu mengamplifikasi situs pre-S1 VHB asal manusia maupun owa. Reaksi PCR terdiri atas 1 µl primer hepB-SF1 dan hepB-SRout, 12,5 µl go taq mastermix (promega), 5,5 µl nuclease freewater, dan 5 µl DNA sampel.
Pada tahap awal dilakukan pre-PCR pada suhu 94°C selama 5 menit. Tahapan selanjutnya adalah PCR yang terdiri atas denaturasi pada suhu 94°C selama 30 detik, anealing pada suhu 52°C selama 30 detik, dan elongasi pada suhu 72°C selama 30 detik. Siklus PCR dilakukan sebanyak 45 kali. Tahap akhir post-PCR pada suhu 72°C selama 10 menit.
Produk PCR dielektroforesis pada gel agarosa 2% yang mengandung ethidium bromida 0,1 µg/ml dalam larutan penyangga TAE menggunakan elektroforesis horizontal. Penanda DNA 1 kb dan hasil PCR dimasukkan ke dalam sumur gel. Alat dokumentasi Gel Doc digunakan untuk visualisasi hasil elektroforesis.
Real Time PCR
Amplifikasi dilakukan menggunakan reaksi PCR yang terdiri atas 12,5 µl IQ sybergreenmastermix (Biorad), 1 µl primer hepB-SF1 dan hepB-SRout, 5,5 µl
nuclease freewater, dan 5 µl DNA sampel. Tahapan reaksi terdiri atas denaturasi pada suhu 95°C selama 3 menit, anealing pada suhu 95°C selama 15 detik, dan elongasi pada suhu 52°C selama 30 detik. Siklus PCR dilakukan sebanyak 45 kali. Tahap akhir post-PCR pada suhu 72°C selama 30 detik.
HASIL DAN PEMBAHASAN