PERCOBAAN II ISOLASI DNA
TINJAUAN PUSTAKA
Studi mengenai eksistensi asam nukleat pertama kali dilakukan oleh Friedrich Miescher dari Jerman yang mengisolasi inti dari sel darah putih pada tahun 1869. Miescher menemukan bahwa di dalam inti sel tersebut terdapat senyawa yang mengandung fosfat yang kemudian dinamakan nuklein. Selanjutnya pada akhir abad ke-19 telah berhasil dilakukan pemisahan antara DNA (deoxyribonucleic
acid) dan RNA (ribonucleic acid) dari protein-protein yang melekatkan molekul asam
nukleat tersebut pada sel. Pada awal tahun 1930-an, P. Levene, W. Jacobs, dan kawan-kawan menunjukkan bahwa RNA tersusun atas satu gugus gula ribosa dan empat basa yang mengandung nitrogen, sementara DNA tersusun atas gula yang berbeda yaitu deoksiribosa (Yuwono, 2005).
Struktur molekul DNA pertama kali diungkapkan oleh James Watson dan Francis Crick pada tahun 1953 berdasarkan atas foto difraksi sinar X yang dibuat oleh Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins. Berdasarkan atas data kimia dan fisik, Watson dan Crick membuat model struktur DNA yang disebut untai ganda (double helix) (Yuwono, 2005).
Untai ganda DNA tersusun oleh dua rantai polinukleotida yang berpilin. Kedua rantai mempunyai orientasi yang berlawanan (antiparalel): rantai yang satu mempunyai orientasi 5’ → 3’, sedangkan rantai yang lain berorientasi 3’ → 5’. Kedua rantai tersebut berikatan dengan adanya ikatan hidrogen antara basa adenin (A) dengan thymine (T) dan antara guanine (G) dengan cytosine (C). Ikatan antara A—T berupa dua ikatan hidrogen, sedangkan antara G—C berupa tiga ikatan hidrogen sehingga ikatan G—C lebih kuat. Spesfikasi pasangan basa seperti ini disebut dengan komplementaritas (complementarity) (Yuwono, 2005).
Kerangka gula deoksiribosa dan fosfat yang menyusun DNA terletak di bagian luar molekul, sedangkan basa purin dan pirimidin terletak di sebelah dalam untaian (helix). Basa-basa purin dan pirimidin yang berpasangan terletak pada bidang datar
yang sama dan tegak lurus terhadap aksis untaian DNA. Untaian DNA mempunyai dua lekukan (groove) eksternal yaitu lekukan besar (major groove) dan lekukan kecil (minor groove). Kedua lekukan tersebut mempunyai peranan sebagai tempat melekatnya molekul protein tertentu (Yuwono, 2005).
Ukuran molekul DNA bervariasi antara jasad yang satu dengan lainnya. Pada jasad prokariot variasinya tidak sebesar pada virus dan bakteriofag. Bahan genetik pada prokariot dan virus pada umumnya berupa satu molekul tunggal DNA (kecuali virus tertentu yang bahan genetiknya RNA). Sebaliknya, bahan genetik pada eukariot berupa beberapa molekul kromosom yang masing-masing berupa molekul DNA berukuran besar. Ukuran DNA pada eukariot, terutama eukariot tingkat tinggi belum diketahui secara pasti karena kompleksitasnya (Yuwono, 2005).
Struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akanberada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi (Kimball, 1992).
Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi sektrak sel, pemurnian DNA dari ektrak sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi yang dapat menghambat pemurnian DNA (Agus dan Sjafaraenan, 2014).
Jika isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah, maka kadar air yang pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda pula. Buah dengan kadar air tinggi akan menghasilkan isolat yang berbeda jika dibandingkan
dengan buah berkadar air renda. Semakin tinggi kadar air maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpresipitasi juga akan sedikit (Agus dan Sjafaraenan, 2014).
Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal ini bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Proses ini harus dilakukan dengan hati-hati, sehingga tidak menyebabkan kerusakan pada dinding sel, membran sel membran plasma dan membran inti baik dengan cara mekanik maupun secara kimiawi. Cara mekanik bisa dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dengan pemberian yang dapat merusak membran sel dan membran inti, salah satunya adalah detergen (Agus dan Sjafaraenan, 2014).
Selain itu, secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan
dengan menambahkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin
tetraasetat), dan SDS (sodium
dodesil sulfat). Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel
dengan caramengikat magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integrit as sel
maupunmempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. Ad
apun SDSyang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan
untuk merusak membran sel. Ini
semua menyebabkan sel menjadi lisis. Kotoran sel yang ditimbulkan akibatperus akan oleh EDTA dan SDS dibersihkan dengan cara sentrifugasi, sehinggayang
tertinggal hanya molekul nukleotida (DNA dan RNA). Untuk menghilangkan
protein dari larutan, digunakan
phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) danchloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan). Etanol berfungsi untuk
memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA(Muladno, 200 2).
Penambahan detergen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena detergen dapat menyebabkan ruaknya membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui
sisi hidrofobik detergen dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa “lipid protein-detergen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan detergen sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia. Kemudian penambahan garam (NaCl) berfungsi untuk melarutkan DNA dan setelah itu diberikan ethanol dingin 96% untuk mengumpulkan/menggumpalkan DNA (Agus dan Sjafaraenan, 2014).
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp) (Dwidjoseputro, 1998).
Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet (Dwidjoseputro, 1998).
Jumlah DNA dicerminkan
berat molekul bukan oleh volume. Untuk mengetahui
jumlah DNA, maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UVde ngan panjang gelombang 256 nm (260 nm). Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm (Suharsono dan Widyastuti, 2006).