: ASTRID SAFIRA IDHAM

A S T R I D S A F I R A I D H A M

a blog with many benefit

SKIP TO CONTENT



HOME



ABOUT

LAPORAN PRAKTIKUM : ISOLASI DNA

MAY 29, 2014 / ASTRIDSAFIRAIDHAM

LAPORAN PRAKTIKUM

GENETIKA

PERCOBAAN II

ISOLASI DNA

NAMA : ASTRID SAFIRA IDHAM

NIM : H41113341

HARI/TANGGAL : KAMIS, 13 MARET 2014

KELOMPOK : VI (ENAM) B

ASISTEN : ANDRI NINDYA

LABORATORIUM GENETIKA JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2014

BAB I

PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

Deoxyribonucleic acid

atau DNA merupakan senyawa kimia yang

paling penting dalam makhluk hidup.DNA merupakan senyawa yang

mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke

generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan

membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional

maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi

gen danintergen (Suryo, 2004).

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan

berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk

kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria,

dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk

linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan

DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak

berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan

kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang

berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola

pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya,

struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk

sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki

protein histon (Kirsman, 2010).

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu

prinsipisolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi

molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul

besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan

berada pada bagian atas tabung . Hasil sentrifugasi akan

menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan

pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Rachmat, 2012).

I.2 Tujuan Percobaan

Adapun tujuan yang akan dicapai pada percobaan isolasi

DNA ini yaitu untuk mengetahui cara memisahkan (mengisolasi)

DNA dari 2 jenis buah yang dijadikan sebagai sampel, serta untuk

mengetahui keaktifan detergen dalam proses isolasi DNA pada

sampel buah.

I.3 Waktu dan Tempat Percobaan

Percobaan ini dilaksanakan pada hari Kamis, 13 Maret 2014,

pukul 14.00 – 17.30 WITA. Percobaan ini bertempat di Laboratorium

Biologi Dasar, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada

(ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan

penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA

rusak (Yuwono, 2008).

Pada sel eukariotik termasuk tanaman dan hewan bagian terbesar

dari DNA berada pada nukleus yaitu organel yang dipisahkan dari

sitoplasma dengan membran. Nukleus terdiri dari 90 % keseluruhan

DNA seluler. Sisa DNA adalah organel lain seperti mitokondria dan

kloroplas. Karena DNA terdapat pada nukleus, maka perlu adanya

metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Dimana metode

tersebut merupakan bagian dari metode isolasi DNA (Elrod, 2007).

Pemisahan DNA dari materi seluler lainnya merupakan hal yang

signifikan dan mengharuskan penyallinan DNA menjadi RNA dan

translasi RNA menjadi protein berlangsung dalam

kompartemen( ruang ) yang berbeda yaitu secara berturut-turut

dalam nucleus dan sitoplasma ( Elrod, 2007 ).

Terdapat organel-organel bermembran ganda di dalam sitoplasma,

termasuk mitokondria baik pada tumbuhan maupun hewan. Oleh

karena itu perlu dilakukan isolasi DNA pada tanaman dan hewan

untuk mengetahui dan mempelajari DNA dari tanaman dan hewan

tersebut. Sel eukariotik memiliki DNA lebih banyak, lengkap dengan

komponen-komponen lain. DNA tanaman dan hewan tersimpan

dalam nucleusyang terbungkus oleh membran. Isolasi DNA

merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya

ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi.Sentrifugasi merupakan

teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul

komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan

berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada

pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua

macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan

pelet pada bagian bawah. Presipitasi merupakan langkah yang

dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran

(Albert, 1994).

DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana.

Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan

memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik

secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan

suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu

tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pemecahan

dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan

atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara

kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan

sabun cair dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti

untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA (Rachmat, 2012).

Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain:

preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi

DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara,

akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat

memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya

senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang

dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan

dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah

berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin

tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan

semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit

(Kirsman, 2010).

Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan

rusaknya membrane sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi

hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membrane

membentuk senyawa “lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa

tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung

hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga

dapat membentuk suatu ikatan kimia (Kirsman, 2010).

Prinsip – prinsip dalam mengisolasi DNA (Tohib, 2012) :

1. melisis sel secara fisik, dengan cara penggerusan.

3. pemecahan membran sel.

4. pemisahan DNA dari bahan yang lain.

Dalam isolasi DNA, bahan yang kita gunakan biasanya

berupa jaringan tumbuhan atau jaringan hewan, untuk itu langkah

pertama yang harus kita lakukan adalah memecahkan jaringan

menjadi sel-sel yang mandiri. Proses dilakukan secara mekanik atau

fisik dengan menumbuk atau menggerus bahan yang akan kita

gunakan dengan mortar atau blender. Kedua adalah memecahkan

dinding sel dan membran sel lapisan pembungkus DNA. struktur

utama pembentuk membran dan dinding sel adalah lemak, untuk itu

kita gunakan deterjen dan garam dapur. Kedua bahan ini digunakan

untuk melubangi dan merusak sel sehingga isi inti sel (DNA) bisa

keluar (Tohib, 2012).

Tahap selanjutnya adalah pemisahan DNA dari bahan yang lain.

Pemisahan dilakukan dengan menggunakan ethanol/alkohol dingin

berkonsentrasi 90-95%. Ethanol/Alkohol tidak melarutkan DNA dan

berat jenis alkohol yang lebih ringan dari air membuat DNA naik dan

melayang-layang di permukaan (Tohib, 2012).

CTAB atau

Cetyl trimethylammonium bromide

merupakan sejenis

deterjen yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi protein,

memisahkan karbohidrat, merusak membran sel dan melarutkan

DNA. Apabila dinding sel terdegradasi maka semua isi sel dapat

keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke dalam

buffer ekstraksi.Dalam proses isolasi DNA tanaman, penambahan

senyawa pereduksi seperti merchaptoetanol dapat mencegah

proses oksidasi senyawa fenolik sehingga menghambat aktivitas

radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap asam

nukleat. Merchaptoetanol juga berfungsi untuk melindungi RNA dari

senyawa quinon, disulphide, peroksida, poliphenoksidase, dan

protein. Proses pemansan pertama bertujuan untuk melarutkan

CTAB dan mercaptoetanol. Sedangkan pemanasan yang kedua

bertujuan untuk memdegradasi protein dan dinding sel (Tohib,

2012).

Klorofrom dan isoamilalkohol

(CIAA) berfungsi untuk mengekstrak

dan dan mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer

ektraksi yang mengkontaminasi larutan DNA. Pemberian isopropanol

dan etanol dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi

presipitasi. Setelah pemberian etanol, pellet yang dipeoleh

dikeringanginkan. Hal ini bertujuan untuk mengeringkan pellet dari

sisa-sisa buffer maupun etanol.Tahapan terakhir dari ektraksi ini

adalah penambahan buffer TE. Buffer TE

tris

electrophoresis

berfungsi untuk melarutkan DNA yangdihasilkan dan

menjagaDNA agar tidak mudah rusak. Dalam buffer TE mengandung

EDTA atau

Ethylene Diamine Tetra Acid

yang berfungsi sebagai

senyawa pengkelat yang mengikat ion Magnesium, yaitu kofaktor

yang diperlukan untuk altivtas berbagai enzim nuclease. Metode

ekstraksi DNA dengan CTAB akan menghasilkan pita DNA yang

berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida

karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (

differensial of

solubility

). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode

CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh

berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan

yang diekstraksi (Asris, 2010).

Metode ini tidak membutuhkan biaya yang lebih mahal

dibandingkan dengan menggunakan kit. Selain itu, kelebihan dari

ektraksi ini adalah pita DNA yangdiproleh lebih tebal bila

dibandinglan dengan ektraksi metode fenol dan tanpa fenol. Akan

tetapi, dari hasil dengan metode ini masih terdapat pita smear dan

DNA yang dihasilkan lebih sedikit daripada ektraksi dengan

menggunakan kit. Kendala yang umum terjadi dalam ekstraksi CTAB

adalah adanya inhibitor pada inang, rendahnya konsentrasi vius dan

pengaruh cara maupun lama waktu penyimpanan (Asris, 2010).

METODE PERCOBAAN

III.1 Alat dan Bahan

III.1.1 Alat

Alat – alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah alat

tulis menulis, tabung reaksi, timbangan, gelas aqua, pisau, batang

pengaduk, spatula, blender, pipet tetes, dan mesin vortex.

III.1.2 Bahan

Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah buah

tomat

Solanum lycopercium

dan pepaya

Carica papaya

, detergen

(Rinso cair, Surf bubuk, dan sabun bukrim), Aquades, garam dapur,

Ethanol 96 % , dan kertas saring.

III.2 Prosedur Kerja

Adapun langkah-langkah kerja yang dilakukan dalam

percobaan ini adalah sebagai berikut:

1. Buah dipotong menjadi ukuran yang lebih kecil.

2. Buah yang telah dipotong kemudian ditimbang sampai

beratnya 100 gr.

3. Diambil 100 gr buah dan 100 ml aquades, kemudian diblender

hingga halus, kira-kira diblender selama 40 detik.

4. Masing-masing buah yang telah diblender dimasukkan

kedalam 3 tabung reaksi yang berbeda sebanyak 4 ml.

5. Dilarutkan detergen (Rinso, Surf, dan Bukrim) kedalam 60 ml

aquades, kemudian diaduk hingga larut.

6. Tiga jenis larutan detergen kemudian dimasukkan kedalam

masing-masing tabung reaksi yang berisi jus buah sebanyak 4

ml.

7. Tambahkan 1 spatula garam dapur kedalam masing-masing

tabung reaksi, kemudian diaduk hingga larut.

8. Campuran kemudian disaring sebanyak 2 kali dengan kertas

saring.

9. Lalu ditambahkan ethanol 96 % sebanyak 5 ml kedalam

masing-masing campuran.

10.

Larutan kemudian dihomogenkan dengan menggunakan

mesin vortex.

11.

Amati dan catat hasil yang tampak dari keseluruhan

proses, meliputi warna, serta sedikit banyaknya DNA yang

terbentuk.

DAFTAR PUSTAKA

Albert, B., 1994.

Biologi Molekuler Sel Edisi Kedua

. PT. Gramedia

Pustaka Utama. JJJJJJJakarta.

Asris., 2010.

Definisi Isolasi DNA dan Manfaat Isolasi

DNA

.

http://asris07

.Student.ipb.ac.id. Diakses pada tanggal 17 Maret

2014, pada pukul 23.00 WITA.

Elrod, S., 2007.

Genetika Edisi Keempat

. Erlangga. Jakarta.

Kirsman, 2010.

Isolasi DNA Buah

.

http://kirsman83.weebl

..com.

Diakses pada tttttttttanggal 17 Maret 2014, pada pukul 23.00 WITA.

Rachmat, 2012.

Isolasi DNA.

http://rachmatyusuf.blogspot.com

.

Diakses pada ssssssstanggal 17 Maret 2014, pada pukul 23.00

WITA.

Suryo, 2004.

Genetika Strata 1.

Universitas Gadjah Mada.

Yogyakarta.

Tohib, 2012.

Macam Metode Isolasi DNA

.

http://www.tohib.web.id

.

Diakses pada tttttttangga17 Maret 2014, pada pukul 23.00 WITA.

Yuwono, T., 2008.

Biologi Molekuler

. Erlangga. Jakarta.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.1 Hasil Percobaan

IV.1.1 Gambar Hasil Percobaan

1.PEPAYA

Carica papaya

(bubuk, cair, krim)

(bubuk, cair, krim)

2.Tomat

Solanu

m lycopercium

(krim, bubuk, cair)

(bubuk, cair, krim)

IV.1.2 Tabel Pengamatan

JENIS

BUAH

PERLAKUAN

HASIL PERCOBAAN

JUMLAH

WARNA

WAKTU

Pepaya

Carica

papaya

Detergen

Bubuk

Putih –

bening

Cepat

+ +

Detergen Cair

Kuning –

bening

Lambat

+ +

Detergen Krim

Kuning –

pucat

Sedang

+ +

Tomat

Solanum

lycoperciu

m

Detergen

Bubuk

Putih –

bening

Cepat

+ +

Detergen Cair

Bening

Lambat

+ + +

IV.2 Pembahasan

Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni

penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan

padat seperti selulosa dan protein, serta

pemurnian DNA. Selain itu ada 2 prinsip lagi dalam melakukan

isolasi DNA, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama

sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis

molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga

substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan

substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi

tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin

sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi.

Dalam percobaan ini, kami melakukan isolasi DNA yang

berasal dari 2 jenis buah yang memiliki kandungan air yang

berbeda. Tujuan dari percobaan ini adalah

untuk mengisolasi atau memisahkan DNA yang berasal dari

tumbuhan. Metode yang

dilakukan dalam percobaan ini adalah penghancuran (lisis) serta

ekstraksi. Perlakuan pertama yang diberikan pada buah yaitu

mengupas serta memotongnya menajadi ukuran yang lebih kecil,

hal ini dilakukan agar pada saat penghancuran buah mudah

dihancurkan menjadi partikel – partikel yang lebih kecil. Tahap

selanjutnya yaitu menambahkan campuran detergen dengan air, hal

ini bertujuan untuk merusak membran sel dari kedua buah tersebut.

Perusakan membran sel terjadi akibat adanya ikatan kimia yang

terbentuk antara detergen dengan zat-zat yang ada pada buah.

Setelah penambahan detergen tahap selanjutnya yaitu

penambahana garam dapur sebanyak 1 spatula ke masing-masing

tabung yang berisi campuran buah dan detergen, tujuan dari

penambahan garam adalah untuk memudahkan pemisahan

benang-benang DNA dari campuran sehingga benang-benang-benang-benang tersebut akan

mudah diamati. Hal ini terjadi karena Na

+

dalam garam dapat

membentuk ikatan pada kutub negative dari ikatan fosfat

DNA.Setelah larutan ditambahkan garam larutan kemudian

dihomogenkan pada mesin vortex.

Tahap selanjutnya yaitu penambahan ethanol 96 %,

penambahan ini bertujuan untuk mempermudah terjadinya

presipitasi pada benang-benang DNA.Ethanol tersebut mampu

membawa asam nukleat yang terdapat dalam campuran naik ke

permukaan, untuk kemudian diendapkan.Setelah ditambahkan

ethanol larutan kemudian kembali dihomogenkan pada mesin

vortex.

Dari percobaan isolasi DNA diperoleh hasil yaitu, perbedaan

warna pada masing-masing tabung reaksi yang berisi campuran

buah, detergen, garam, dan ethanol.Perubahan warna yang terjadi

diakibatkan oleh perbedaan susunan DNA yang terdapat pada setiap

buah. Selain itu perbedaan yang mencolok dari keenam larutan

tersebut adalah terdapat banyak atau sedikit endapan asam nukleat

pada

dasar tabung reaksi. Hal ini terjadi akibat adanya perbedaan

kandungan zat serta penggunaan jenis detergen yang berbeda

maupun kandungan air dari masing-masing buah tidak sama. Dari

percobaan tidak diperoleh DNA murni melainkan hanya DNA kasar

atau benang – benang halus (supernatant) dalam jumlah yang

sedikit serta endapan putih yang terlihat. Dari kedua buah DNA

kasar yang paling terlihat ada pada buah pepaya, hal itu terjadi

akibat kandungan air pepaya lebih sedikit dari tomat sehingga

ekstrak dan DNA kasar yang dihasilkan oleh pepaya lebih banyak

daripada buah tomat, selain itu endapan putih pada buah pepaya

lebih banyak daripada buah tomat.

BAB V

PENUTUP

V.1 Kesimpulan

Dari percobaan isolasi DNA yang telah dilakukan dapat

diketahui metode atau cara bagaimana mengisolasi DNA dari buah

yang dijadikan sebagai sampel. Yaitu melalu cara penghancuran

(lisis), ekstraksi, serta pemurnian. Penggunaan detergen yang

berbeda dalam percobaan dilakukan untuk mengetahui detergen

dalam bentuk apa yang paling aktif dalam menghancurkan

membran sel pada setiap sampel buah.Setelah dilakukan percobaan

ternyata detergen bubuk menghasilkan DNA kasar yang lebih

terlihat serta endapan putih yang lebih banyak.

V.2 Saran

V.2.1 Saran Untuk Laboratorium

Sebaiknya laboratorium menyediakan alat yang cukup

memadai serta alat yang cukup banyak, agar praktikum dalam

berjalan dengan efisien.

V.2.2 Saran Untuk Asisten

Diharapkan agar terus memperhatikan dan membimbing

praktikan selama lab berlangsung, agar praktikum berjalan dengan

baik.

Ade puji setyawati Biologi inspirasi

Jumat, 14 November 2014

ISOLASI DNA TANAMAN

ISOLASI DNA TANAMAN

Ade Puji Setyawati 1)

Drh. Bhintarti S. Hastari, M. Biomed2) Festy Auliyaur Rahmah, S. Si2)

Nugroho Adi Maulana3) Indhina Reihannisha3)

1) Mahasiswa Jurusan Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Islam Negeri

Syarif Hidayatullah Jakarta 2) Dosen Praktikum Biologi Molekuler

3) Asisten Praktikum Biologi Molekuler

Jl. Ir. H. Djuanda, Tangerang Selatan 15412, Indonesia Email : Adebio12@gmail.com

Jum’at, 24 Oktober 2014

ABSTRAK

DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. DNA pada sel tanaman dibagi menjadi dua yaitu DNA intrakromosomal dan DNA ekstrakromosomal. Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari dinding sel, membrane sel dan protein, serta pemurnian DNA. Isolasi DNA sawi hijau ini dilakukan dengan mengambil potongan daun muda kemudian daun tersebut diekstraksi hingga didapatkan DNA murni dari tanaman

sawi hijau tersebut. Praktikum ini dilakukan dengan tujuan agar praktikan mampu melakukan isolasi DNA dari tanaman Sawi Hijau (Brassica sp.). Hasil setelah penambahan kloroform dan isoamil alkohol (24:1) 1x volum sampel dan disentrifugasi terbentuk 2 fase yaitu fase aqoueous dan organik. Setelah penambahan isopropanol dingin terlihat benang-benang tipis DNA.

Kata kunci : Tanaman, daun Sawi hijau, pemurnian DNA

Deoxyribo Nucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. DNA eukariot tidak hanya dijumpai pada nukleus, tetapi dapat ditemukan pada mitokondria dan kloroplas. DNA yang diisolasi dari kloroplas menunjukkan sifat berbentuk sirkular, terdiri dari untai ganda, replikasi semikonservatif, dan bebas dari protein histon. DNA kloroplas penting dalam proses fotosintesis. DNA pada sel tanaman dibagi menjadi dua yaitu DNA intrakromosomal dan DNA ekstrakromosomal (Donata, 2007).

DNA intrkromosomal merupakan DNA yang ditemukan di inti sel. Sedangkan DNA ekstrakromosomal merupakan DNA yang ditemukan di sitoplasma sel. Pada sel-sel tanaman DNA ekstrakromosal ini dapat ditemukan di mitokondria dan kloroplas (Farrel, 2004). Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA, salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Muladno, 2002).

Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Donata, 2007). Terdapat berbagai macam metode isolasi DNA tanaman. Metode-metode tersebut menggunakan CTAB dan SDS dalam ekstraksi DNA (Donata, 2007). Beberapa metode isolasi DNA juga menggunakan nitrogen cair pada tahap awal ekstraksi untuk menghasilkan kualitas DNA terbaik. (Pharmawati, 2009). Sering digunakan untuk ekstraksi DNA tanaman(Yuwono, 2008).

Metode tersebut pada dasarnya memiliki prinsip yang sama, namun ada beberapa hal tertentu yang biasanya digunakan modifikasi untuk dapat menghancurkan inhibitor yang ada di dalam masing-masing sumber spesimen. Komponen nukleotida DNA adalah gula, fosfat, dan basa nitrogen. Komponen gula pada DNA adalah gula deoksiribosa, yaitu gula ribose yang kehilangan satu atom oksigen. Basa yang ada pada DNA ada dua macam, yaitu purin dan pirimidin. Purin terbagi lagi menjadi dua macam, yaitu adenin dan guanin. Pirimidin terdiri dari dua jenis, yaitu timin dansitosin (Yuwono, 2008). Nukleus terdiri dari 90 % keseluruhan DNA seluler. Sisa DNA adalah organel lain seperti mitokondria dan kloroplas (Heldt, 2005).

Karena DNA terdapat pada nukleus, maka perlu adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Sawi hijau (Brassica sp.) merupakan jenis sayur yang digemari oleh masyarakat Indonesia. Kelebihan-kelebihan sawi antara lain baik bagi kesehatan tubuh, mampu tumbuh baik baik di dataran rendah maupun dataran tinggi, tahan terhadap air hujan, dapat dipanen sepanjang tahun tidak tergantung dengan musim, masa panennya cukup pendek, yaitu sekitar 40 hari setelah tanam dan sawi mempunyai nilai ekonomi cukup tinggi setelah kubis krop, kubis bunga, dan brokoli (Ardiana, 2009).

Dengan mengetahui DNA tanaman sawi maka dapat menghasilkan potensi yang cukup besar untuk menghasilkan varietas-varietas sawi yang unggul yang lebih bernilai ekonomis dan kompetitif. Keragaman varietas yang terus berkembang sejalan dengan sistim perkembangbiakan tanaman. Namun informasi tentang genetik sawi masih sangat kurang. Oleh karena itu pada praktikum kali ini mencoba untuk mengisolasi DNA tanaman sawi hijau. Isolasi DNA sawi hijau ini dilakukan dengan mengambil potongan daun muda kemudian daun tersebut diekstraksi hingga didapatkan DNA murni dari tanaman sawi hijau tersebut. Praktikum ini dilakukan dengan tujuan agar praktikan mampu melakukan isolasi DNA dari tanaman Sawi Hijau (Brassica rapa).

II. Materi

Alat yang digunakan dalam praktikum isolasi DNA tanaman adalah alat tulis, mikropipet, sentrifuga, vortex, waterbath, inkubator, yellow tips, blue tips, freezer,tip steril, tabung mikro 1,5 steril, gunting, timbangan analitik dan kamera.

Bahan yang digunakan adalah daun sawi hijau (Brassica sp.). yang masih muda 0,3 g, 500 µL buffer ekstraksi (25 mM EDTA, 250 mM NaCl, SDS 0,5%, 200 mM Tris-HCl pH 7,5), kloroform dan isoamil alkohol (24:1) sebanyak 1x volum sampel, isopropanol sebanyak 1x volume sampel, dan 100 µL buffer TE.

III. Metode

Cara kerja untuk isolasi DNA tanaman yaitu pertama dengan menimbang daun sawi hijau yang masih segar sebanyak 0,3 gram, tanpa pertulangan daun dan batangnya. Kemudian dimasukan kedalam tabung mikro steril. Setelah itu lunakan daun selama 10 menit pada suhu ruang, gunakan tip steril untuk menumbuk daun, tanpa penambahan buffer dan tambahkan 500 μL bufer ekstraksi (200 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5% SDS) ke dalam tabung.

Kemudian kocok selama 5 detik kemudian Inkubasi tabung dalam waterbath pada suhu 600_{C selama 30 menit dengan tamabahan kloroform:isoamilalkohol} (24:1)sebanyak 1x volume sampel lalu kocok kemudian sentrifuga pada 6.000 x g selama 5 menit dan di ambil supernatan, kemudian pindahkan ke tabung mikro yang baru, lalu tambahkan isopropanol sebanyak 1x volume sampel, Kocok kemudian inkubasi pada suhu -200_{C selama 15 menit. Sentrifugasi pada 6.000 x g} selama 5 menit, setelah itu supernatan, kemudian ditambahkan 100 μL bufer TE dan simpan pada suhu -200_C.

IV. Hasil dan Pembahasan

Hasil yang didapatkan dari praktikum isolasi DNA tanaman sawi hijau(Brassica sp.) dapat dilihat pada tabel berikut ini :

No Gambar Keterangan 1 Daun hasil penumbukan dan ditambahkan buffer ekstraksi dan divortex a. Daun + buffer ekstraksi 2 Terbentuk 2 fase setelah penambahan kloroform dan isoamil alkohol (24:1) 1x volum sampel dan disentrifugasi. a. Fase aqueous (supernatan yang mengandung DNA) a. Fase organik (debris dan protein yang terdenaturasi) 3 Supernatan yang telah dipindahkan ke tabung mikro baru a. supernatant

Supernatan yang telah ditambahkan isopropanol dingin 1 x volum sampel a. Terlihat

benang-benang tipis DNA Pelet yang telah ditambahkan dengan 100 μLbuffer TE a. buffer TE b. Pelet (mengandung DNA)

Berdasarkan hasil praktikum isolasi DNA tanaman Sawi hijau (Brassica sp.), langkah pertama yang dilakukan adalah penghancuran membran dan dinding sel pada daun muda yang digunakan. Isolasi DNA tanaman ini digunakan daun yang masih muda hal ini dikarenakan dipucuk daun dapat menekan senyawa polifenol dan polisakarida sehingga dapat memperbesar kemungkinan keberhasilan untuk melakukan isolasi DNA yang kita inginkan.

Hal ini diperkuat dengan pernyataan Zubaidah (2004), pada bagian tanaman banyak memiliki senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA, senyawa polifenol dan polisakarida juga dapat mempengaruhi enzim-enzim seperti polimerase, ligase, endonuklease restriksi, atau enzim yang mengakibatkan DNA tidak digunakan dalam praktikum Biologi Molekuler.

Penghancuran bertujuan untuk merusak jaringan yang ada pada sel sehingga mempermudah bahan-bahan kimia lain yang akan digunakan untuk masuk ke dalam organel-organel sel, dalam hal untuk mengambil DNA. DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid. Sedangkan DNA dari hewan lebih banyak mengandung protein.

Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali pada beberapa jenis tanaman, kontaminasi

tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Pembukaan sel untuk mengeluarkan asam nukleatnya pada praktikum ini dengan cara mekanik yaitu digerus dengan tip steril pada tabung mikro atau dapat juga menggunakan bahan kimia yaitu nitrogen cair untuk mendegradasi dan melarutkan komponen dinding sel.

Pada saat proses destruksi jaringan tanaman dapat menyebabkan degradasi pada DNA dengan adanya aktivitas enzim endonuklease, karena itu digunakan buffer ekstraksi yang mengandung senyawa 200 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, dan 0,5 % SDS. DNA akan terpisah menjadi suatu larutan dan dapat dimurnikan (dipurifikasi) melalui dua cara yang umum dilakukan yaitu sentrifugasi dan ekstraksi kimia.

Sampel disentrifugasi dengan kecepatan yang tinggi sehingga komponen yang berukuran lebih besar atau lebih berat akan mengendap membentuk sedimen pada bagian bawah tabung. SDS berfungsi untuk melisis dinding sel tumbuhan yang terdapat dalam larutan sampel. Ini disebabkan karena sifat dari SDS sama dengan sifat dinding sel yang hidrofobik, sehingga terjadi ikatan diantara keduanya dan menyebabkan dinding sel rusak.

Setelah ditunggu beberapa menit, sampel selanjutnya diinkubasi. Muladno (2002), buffer lysis ini mengandung EDTA yang berfungsi merusak dinding sel secara kimiawi dengan cara mengikat ion magnesium berfungsi mempertahankan integritas sel maupun aktifitas enzim nuclease yang merusak asam nukleat. Kotoran (debris) yang dihasilkan dari aktivitas lysis ini dibersihkan dengan cara sentrifugasi agar kotoran mengumpul didasar tabung mikro.

Untuk membersihkan protein dan polisakarida dari larutan digunakan kloroform sedangkan kondisi yang lebih ekstrem, dapat digunakan proteinase.DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan protein agar DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi.

Tahap selanjutnya yaitu sampel yang telah vortex selama 5 detik dankemudian diinkubasikan isolasi pada suhu 60˚C selama 30 menit, hal ini bertujuan agar enzim bekerja secara optimal setelah ditambahkan buffer ekstraksi. Kemudian dilakukan ditambahkan kloroform dan isoamil alkohol (24:1) 1x volum sampel dan disentrifugasi untuk mendapatkan supernatan.

Terbentuk 2 fase setelah penambahan CIA dan disentrifugasi yaitu fase cair ( supernatan ) dan fase organik. Hal tersebut sesuai dengan pernyataan Pharmawati, (2009) menyebutkan bahwa setelah sentrifugasi akan terbentuk 2 fase yang terpisah yakni fase organik pada lapisan bawah dan fase aquoeus (air) pada lapisan atas sedangkan DNA dan RNA akan berada pada fase aquoeus setelah sentrifugasi sedangkan protein yang terdenaturasi akan berada pada interfase dan lipid akan berada pada fase organik.

Asam nukleat adalah molekul hidrofilik dan bersifat larut dalam air. Disamping itu, protein juga mengandung residu hidrofobik yang mengakibatkan protein larut dalam pelarut organik. Berdasarkan sifat ini, terdapat beberapa metode deproteinisasi berdasarkan pemilihan pelarut organik. Biasanya pelarut organik yang digunakan adalah fenol atau kloroform yang mengandung 4% isoamil alkohol. Penggunaan kloroform isoamil alkohol (CIA) berdasarkan perbedaan sifat pelarut organik.

Kloroform tidak dapat bercampur dengan air dan kemampuannya untuk mendeproteinisasi berdasarkan kemampuan rantai polipeptida yang terdenaturasi untuk masuk atau termobilisasi ke dalam fase antara kloroform – air. Konsentrasi protein yang tinggi pada fase antara tersebut dapat menyebabkan protein mengalami presipitasi. Sedangkan lipid dan senyawa organik lain akan terpisah pada lapisan kloroform (Doyle, 1990).

Proses deproteinisasi yang efektif bergantung pada besarnya fase antara kloroform-air. Proses ini dapat dilakukan dengan membentuk emulsi dari air dan kloroform. Hal ini hanya dapat dilakukan dengan penggojogan atau sentrifugasi yang kuat karena kloroform tidak dapat bercampur dengan air. Isoamil alkohol berfungsi sebagai emulsifier dapat ditambahkan ke kloroform untuk membantu pembentukan emulsi dan meningkatkan luas permukaan kloroform-air yang mana protein akan mengalami presipitasi.

Penggunaan kloroform isoamil alkohol ini memungkinkan untuk didapatkan DNA yang sangat murni, namun dengan ukuran yang terbatas (20.000–50.000 bp). DNA kemudian diikat dari fase aquoeus dengan presipitasi isopropanol (Muladno, 2002). Setelah proses ekstraksi, DNA yang didapat dapat dipekatkan melalui presipitasi. Pada umumnya digunakan isopropanol dingin untuk mengendapkan, melekatkan dan memisahkan DNA dari larutan.

Pada saat penambahan isopropanol dingin terlihat benang-benang tipis DNA tanaman berwarna putih yang melayang di larutan tersebut. Kedua senyawa tersebut akan mempresipitasi DNA pada fase aquoeus sehingga DNA menggumpal membentuk struktur fiber dan terbentuk pellet setelah dilakukan sentrifugasi. Menurut Heldt (2005) bahwa presipitasi berfungsi untuk menghilangkan residu-residu kloroform yang berasal dari tahapan ekstraksi.

Menurut Yuwono, (2008) prinsip-prinsip presipitasi antara lain pertama, menurunkan kelarutan asam nukleat dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air yang polar mengelilingi molekul DNA di larutan aquoeus. Muatan dipole positif dari air berinteraksi dengan muatan negatif pada gugus fosfodiester DNA. Interaksi ini meningkatkan kelarutan DNA dalam air. Isopropanol dapat bercampur dengan air, namun kurang polar dibandingkan air.

Molekul isopropanol tidak dapat berinteraksi dengan gugus polar dari asam nukleat sehingga isopropanol adalah pelarut yang lemah bagi asam nukleat; kedua,

penambahan isopropanol akan menghilangkan molekul air dalam larutan DNA sehingga DNA akan terpresipitasi; ketiga, penggunaan isopropanol dingin akan menurunkan aktivitas molekul air sehingga memudahkan presipitasi DNA. Pada tahapan presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari residu-residu RNA dan protein yang masih tersisa.

Residu tersebut juga mengalami koagulasinamun tidak membentuk struktur fiber dan berada dalam bentuk presipitat granular.Pada saat etanol atau isopropanol dibuang dan pellet dikeringanginkan dalam tabung, maka pellet yang tersisa dalam tabung adalah DNA pekat. Proses presipitasi kembali dengan isopropanol sebelum pellet dikeringanginkan dapat meningkatkan derajat kemurnian DNA yang diisolasi (Farrel, 2004).

Tahap selanjutnya yaitu tabung dikocok dan diinkubasi pada suhu -200_{C selama} 15 menit. Hal ini dilakukan untuk optimalisasi kerja isopropanol. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 6.000 rpm x g selama 15 menit. Proses sentrifugasi ulangan dilakukan untuk mendapatkan pellet DNA. Tahap selanjutnya yaitu tabung di sentrifugasi kembali pada kecepatan 6.000 rpm selama 15 menit. Hasil yang didapat yaitu berupa supernatan yang bening dan pelet (endapan DNA murni) yang berwarna putih terdapat pada dasar tabung.

Kemudian supernatan tersebut dibuang karena DNA berada pada bagian natan. Menurut Donata (2007) DNA murni yang dihasilkan adalah DNA yang terbebas dari campuran material dan komponen intraceluler yang mengandung larutan kompleks berupa RNA, protein, lemak dan karbohidrat. Setelah ituditambahkan 100 μL buffer TE ke dalam tabung yang berisi pelet dan kemudian disimpan di dalam freezer dengan suhu sekitar -20ºC.

Ardiana, (2009) menyatakan bahwa buffer TE dan penyimpanan suhu pada -20ºC bertujuan agar sampel DNA yang telah diekstraksi dapat disimpan hingga waktu berminggu-minggu. Pharmawati, (2009) juga menjelaskan bahwa pelarutan kembali dengan buffer TE juga dapat memisahkan antara RNA yang mempunyai berat molekul lebih rendah dibandingkan DNA sehingga DNA yang didapatkan tidak terkontaminasi oleh RNA dan DNA sangat stabil ketika disimpan dalam keadaan terpresipitasi pada suhu -20ºC.

V. Kesimpulan

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan bahwa, praktikan mampu melakukan isolasi DNA tanaman Sawi hijau (Brassica sp.)dengan cara penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti dinding sel, membran sel dan protein, serta dapat melakukan pemurnian DNA. Pada isolasi DNA ini digunakan daun muda atau pucuk, hal ini dikarenakan dipucuk daun dapat menekan senyawa polifenol dan polisakarida sehingga dapat memperbesar kemungkinan keberhasilan untuk melakukan isolasi DNA yang kita inginkan.

DAFTAR PUSTAKA

Ardiana, D.W. 2009. Teknik isolasi DNA genom tanaman papaya dan jeruk dengan menggunakan modifikasi buffer CTAB. Buletin Teknik Pertanian 14(1): 12-16.

Donata. 2007. Komunikasi pribadi. Ciri-ciri DNA murni dan penyebab keberhasilan serta kegagalan dalam PCR dan elektroforesis.Erlangga. Jakarta.

Doyle J.J and Doyle J.L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. Moscow. 12(1):13-15.

Farrel, R.E. 2004. RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization. Third Edition. Elsevier Academis Press. London. Hal. 693-705.

Heldt, H. W. 2005. Plant Biochemistry. Third Edition. Elsevier Academic Press. California. Hal. 491Doyle JJ, Doyle JL. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12: 13-15.

Muladno. (2002). Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pusataka Wirausaha Muda. Bogor Pharmawati, M. 2009. Optimalisasi ekstraksi DNA dan PCR-RAPD pada grevillea spp.

(Proteaceae). Jurnal Biologi 13(1): 12-16.

Ribeiro RA, Lovato MB. 2007. Comparative analysis of different DNA extraction protocols in fresh and herbarium specimens of the genus Dalbergia.Genet. Mol. Res. 6: 173-187. Yuwono, Triwibowo. 2008. Biologi Molekuler. Jakarta : Penerbit Erlangga

Lukisan Karya

Kamis, 20 Maret 2014

Laporan Genetika Isolasi DNA

LAPORAN PRAKTIKUM

GENETIKA

PERCOBAAN II

ISOLASI DNA

NAMA : NUR AFIYAH SULAIMAN NIM : H41113504

KELOMPOK : V (LIMA) B

HARI/TGL. PERCOBAAN : KAMIS/ 13 MARET 2014 ASISTEN : RISKY NURHIKMAYANI

LABORATORIUM GENETIKA JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR

2014 BAB I

PENDAHULUAN I.1 Latar Belakang

DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah molekul utama yang mengode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme. DNA tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribusa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. Molekul DNA ini terikat membentuk kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria dan kloroplas (Agus dan Sjafaraenan, 2014).

DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang terususn helix Ganda (double helix), yang basa nitrogen dan kedua “benang” polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan yang tetap melali ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang satu dengan yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. DNA terdapat di dalam setiap sek makhluk hidup dan disebut sebagai “cetak biru kehidupan” karena molekul ini berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme lain (Agus dan Sjafaraenan, 2014).

DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu, DNA juga bisa diisolasi. Isolasi DNA adalah suatu teknik dimana hasil akhirnya strand-strand DNA

dapat terpisah dalam bentuk kumpulan strand berwujud benang-benang putih. Tujuan isolasi DNA adalah mendapatkan ekstrak DNA pada jaringan atau sel yang diinginkan (Agus dan Sjafaraenan, 2014).

Isolasi DNA ini sangat penting dalam bidang bioteknologi maupun bidang biologi molekuler. Pengenalan isolasi DNA sangat penting mengingat bioteknologi pada akhir-akhir ini sangat maju. Terlebih untuk bidang biologi molekuler. Beberapa bakteri telah berhasil diintroduksi ke dalam tanaman seperti padi kapas dan kedelai. Pentingnya bioteknologi untuk perkembangan keanekaragaman hayati di masa mendatang memerlukan keterampilan dan pemikiran. Salah satunya adalah dengan mengetahui cara pengumpulan DNA dan prinsip dasarnya sebagai pijakan untuk mempelajari biologi molekuler pada khususnya (Agus, dan Sjafaraenan, 2014).

1.2 Tujuan Percobaan

Adapun tujuan dari praktikum ini adalah:

1. Untuk mengetahui cara atau metode yang benar untuk memisahkan (mengisolasi)

DNA dari buah-buahan.

2. Mengetahui keefektifan detergen dan buah yang dipakai untuk melakukan

percobaan isolasi.

I.3 Waktu dan Tempat

Percobaan Isolasi DNA ini dilaksanakan pada hari Kamis, 13 Maret 2014 pukul 14.00-17.00 WITA bertempat di Laboratorium Biologi Dasar, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin, Makassar.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Studi mengenai eksistensi asam nukleat pertama kali dilakukan oleh Friedrich Miescher dari Jerman yang mengisolasi inti dari sel darah putih pada tahun 1869. Miescher menemukan bahwa di dalam inti sel tersebut terdapat senyawa yang mengandung fosfat yang kemudian dinamakan nuklein. Selanjutnya pada akhir abad ke-19 telah berhasil dilakukan pemisahan antara DNA (deoxyribonucleic acid) dan RNA (ribonucleic acid) dari protein-protein yang melekatkan molekul asam nukleat tersebut pada sel. Pada awal tahun 1930-an, P. Levene, W. Jacobs, dan kawan-kawan menunjukkan bahwa RNA tersusun atas satu gugus gula ribosa dan empat basa yang mengandung nitrogen, sementara DNA tersusun atas gula yang berbeda yaitu deoksiribosa (Yuwono, 2005).

Struktur molekul DNA pertama kali diungkapkan oleh James Watson dan Francis Crick pada tahun 1953 berdasarkan atas foto difraksi sinar X yang dibuat oleh Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins. Berdasarkan atas data kimia dan fisik, Watson dan Crick membuat model struktur DNA yang disebut untai ganda (double helix) (Yuwono, 2005).

Untai ganda DNA tersusun oleh dua rantai polinukleotida yang berpilin. Kedua rantai mempunyai orientasi yang berlawanan (antiparalel): rantai yang satu mempunyai orientasi 5’ → 3’, sedangkan rantai yang lain berorientasi 3’ → 5’. Kedua rantai tersebut berikatan dengan adanya ikatan hidrogen antara basa adenin (A) dengan thymine (T) dan antara guanine (G) dengan cytosine (C). Ikatan antara A—T berupa dua ikatan hidrogen, sedangkan antara G—C berupa tiga ikatan hidrogen sehingga ikatan G—C lebih kuat. Spesfikasi pasangan basa seperti ini disebut dengan komplementaritas (complementarity) (Yuwono, 2005).

Kerangka gula deoksiribosa dan fosfat yang menyusun DNA terletak di bagian luar molekul, sedangkan basa purin dan pirimidin terletak di sebelah dalam untaian (helix). Basa-basa purin dan pirimidin yang berpasangan terletak pada bidang datar

yang sama dan tegak lurus terhadap aksis untaian DNA. Untaian DNA mempunyai dua lekukan (groove) eksternal yaitu lekukan besar (major groove) dan lekukan kecil (minor groove). Kedua lekukan tersebut mempunyai peranan sebagai tempat melekatnya molekul protein tertentu (Yuwono, 2005).

Ukuran molekul DNA bervariasi antara jasad yang satu dengan lainnya. Pada jasad prokariot variasinya tidak sebesar pada virus dan bakteriofag. Bahan genetik pada prokariot dan virus pada umumnya berupa satu molekul tunggal DNA (kecuali virus tertentu yang bahan genetiknya RNA). Sebaliknya, bahan genetik pada eukariot berupa beberapa molekul kromosom yang masing-masing berupa molekul DNA berukuran besar. Ukuran DNA pada eukariot, terutama eukariot tingkat tinggi belum diketahui secara pasti karena kompleksitasnya (Yuwono, 2005).

Struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akanberada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi (Kimball, 1992).

Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi sektrak sel, pemurnian DNA dari ektrak sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi yang dapat menghambat pemurnian DNA (Agus dan Sjafaraenan, 2014).

Jika isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah, maka kadar air yang pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda pula. Buah dengan kadar air tinggi akan menghasilkan isolat yang berbeda jika dibandingkan

dengan buah berkadar air renda. Semakin tinggi kadar air maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpresipitasi juga akan sedikit (Agus dan Sjafaraenan, 2014).

Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal ini bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Proses ini harus dilakukan dengan hati-hati, sehingga tidak menyebabkan kerusakan pada dinding sel, membran sel membran plasma dan membran inti baik dengan cara mekanik maupun secara kimiawi. Cara mekanik bisa dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dengan pemberian yang dapat merusak membran sel dan membran inti, salah satunya adalah detergen (Agus dan Sjafaraenan, 2014).

Selain itu, secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat). Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan caramengikat magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integrit as sel

maupunmempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. Ad apun SDSyang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak membran sel. Ini

semua menyebabkan sel menjadi lisis. Kotoran sel yang ditimbulkan akibatperus akan oleh EDTA dan SDS dibersihkan dengan cara sentrifugasi, sehinggayang tertinggal hanya molekul nukleotida (DNA dan RNA). Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) danchloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan). Etanol berfungsi untuk

memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA(Muladno, 200 2).

Penambahan detergen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena detergen dapat menyebabkan ruaknya membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui

sisi hidrofobik detergen dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa “lipid protein-detergen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan detergen sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia. Kemudian penambahan garam (NaCl) berfungsi untuk melarutkan DNA dan setelah itu diberikan ethanol dingin 96% untuk mengumpulkan/menggumpalkan DNA (Agus dan Sjafaraenan, 2014).

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp) (Dwidjoseputro, 1998).

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet (Dwidjoseputro, 1998).

Jumlah DNA dicerminkan

berat molekul bukan oleh volume. Untuk mengetahui

jumlah DNA, maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UVde ngan panjang gelombang 256 nm (260 nm). Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm (Suharsono dan Widyastuti, 2006).

METODE PERCOBAAN

III.1 Alat

Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah pisau, mesin blender, timbangan, gelas aqua, pengaduk, penyaring (tissu / kapas / kertas saring), spatula, tabung reaksi, pipet tetes, dan mesin vortex.

III.2 Bahan

Bahan yang digunakan adalah buah tomat Solanum lypersium, buah pepayaCarica papaya, detergen Surf bubuk, detergen Rinso cair, sabun Bucream, aquades, garam dapur, dan etanol 96% dingin.

III.3 Prosedur Kerja

Adapun langkah-langkah kerja yang dilakukan dalam percobaan ini sebagai berikut:

1. Melarutkan detergen (Surf, Rinso dan Bucream) ke dalam 60 mL aquades diaduk

pelan selama 15 menit.

2. Mengambil 100 grm daging buah ditambah 100 mL aquades dimasukkan ke dalam

mesin blender, kemudian diblender selama 40 detik.

3. Mencampurkan 4 mL masing-masing larutan sabun dengan masing-masing 4 mL

jus buah.

4. Menambahkan 1 spatula garam dapur kemudian diaduk selama 10 menit sampai

diperoleh campuran yang homogen serta divortex.

5. Menyaring campuran yang dihasilkan sebelumnya sebanyak dua kali penyaringan.

6. 6 mL hasil penyaringan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi

7. Mengamati proses timbulnya DNA, meliputi waktu yang diperlukan, warna, serta

banyak sedikitnya DNA yang terbentuk.

‘

BAB IV

IV.1 Hasil Percobaan

IV.1.1 Gambar hasil Percobaan

Jenis buah Sebelum Sesudah

Tomat Detergen Bubuk Detergen cair Detergen krim Pepaya Detergen Bubuk Detergen cair

Detergen krim

IV.1.2 Tabel Pengamatan

No. Jenis Buah Perlakuan Hasil Pengamatan Jumlah

Warna Waktu 1 Tomat Solanumlycopersiu m Detergen Bubuk Bening, ada endapan Lambat ++ Detergen Cair Bening Sedang + Detergen Krim

Putih Bening Lebih Cepat +++ 2 Pepaya Carica papaya Detergen Bubuk Putih Kekuning-kuningan Lebih Cepat ++++ Detergen Cair

Putih keruh Lambat +++

Detergen Krim

Putih susu Sedang ++

IV.2 Pembahasan

Praktikum isolasi DNA ini dilakukan bertujuan untuk mengetahui pengaruh macam buah dan jenis deterjen terhadap kualitas DNA yang dihasilkan dalam proses isolasi. Sehingga dalam praktikum ini dibuat variabel kontrol pada jenis

detergen dan jenis buah agar dapat mengetahui buah dan jenis detergen mana yang menghasilkan DNA paling bagus dan baik. Jenis buah yang digunakan adalah tomat Solanum lycopersicum sebagai contoh buah yang mengandung banyak air dan pepaya Carica papaya sebagai buah yang memiliki kandungan air tidak terlalu banyak. Sedangkan untuk detergen yang dipakai adalah detergen bubuk merk Surf, detergen cair merk Rinso, dan detergen krim merk BuCream.

Pada dasarnya prinsip isolasi DNA ada tiga yaitu pelisisan sel, ekstraksi dan pemurnian. Pada praktikum kali ini yang pertama-tama dilakukan ialah menghancurkan sampel buah dengan cara mekanik atau pemblenderan buah untuk melisis/ merusak dinding sel. Sementara itu dibuat pula larutan detergen dengan cara mencampurkan ketiga jenis detergen (Surf, Rinso dan Bucream) ke dalam aquades. Pengadukan dilakukan dengan hati-hati agar tidak terjadi banyak busa yang dapat menghalangi pengamatan.

Kemudian jus buah ditambahkan dengan larutan detergen. Penambahan larutan detergen berfungsi untuk melisis dinding sel tumbuhan yang terdapat dalam larutan sampel. Ini disebabkan karena sifat dari detergen sama dengan sifat dinding sel yang hidrofobik, sehingga terjadi ikatan diantara keduanya dan menyebabkan dinding sel rusak.

Lalu ditambahkan garam dapur dan diaduk. Pengisolasian DNA menggunakan garam dapur dengan tujuan untuk memekatkan DNA. Hal ini dapat terjadi karena ion Na+ _{yang dikandung oleh garam mampu membentuk ikatan dengan kutub}

negative pada ikatan fosfat DNA. Saat ion Na+ _{garam berikatan dengan fosfat, pada}

saat itulah DNA akan berkumpul.

Selanjutnya larutan disaring dengan kertas saring sebanyak dua kali penyaringanuntuk memisahkan serat-serat yang kasar dengan yang halus, sehingga didapatkan sampel berupa cairan yang tidak terlalu kental.

Hasil penyaringan tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambah etanol 96 % dingin yang berfungsi membantu proses pengendapan terhadap organel-organel yang sudah keluar dari sel atau memisahkan bagian-bagian yang

terurai tersebut berdasarkan berat molekul. Ethanol berperan dalam pengumpulan dan penggumpalan DNA karena sifatnya yang dingin.

Kemudian setelah diamati proses timbulnya DNA, meliputi waktu yang diperlukan, warna, serta banyak sedikitnya DNA yang terbentuk. Maka hasil yang didapatkan yaitu larutan yang paling cepat membentuk gumpalan DNA adalah tomat+Bukrim dan tomat+Surf.

Hal ini bertolak belakang dengan teori yang menyatakan bahwa buah pepaya akan lebih banyak menghasilkan gumpalan DNA karena memiliki kandungan air yang lebih sedikit daripada tomat sehingga DNA yang terpresipitasi lebih banyak pada buah pepaya.

Kenyataan ini juga tidak sejalan dengan anggapan detergen yang paling baik digunakan untuk isolasi DNA adalah detergen bubuk, kemudian detergen cair, lalu detergen krim. Dari hasil tersebut maka yang dapat disimpulkan bahwa tomat dan BuCream paling banyak menghasilkan DNA. Dan dari ketiga jenis deterjen yang digunakan, yang paling sedikit menghasilkan DNA adalah deterjen Rinso. Larutan dengan deterjen bubuk Surf dan Bu krim menghasilkan DNA dengan jumlah yang cukup banyak. Namun ketiga jenis deterjen tersebut tidak dapat dibandingkan mana yang lebih baik dalam mengisolasi DNA karena pada setiap perlakuan menunjukkan hasil yang relatif sama.

Kemungkinan terdapat kesalahan pada saat dilakukan pemblenderan buah pepaya yang terlalu lama dan terlalu halus sehingga DNA yang didalamnya tercabik-cabik hancur dan menyebabkan kegagalan pada saat pada isolasi DNA. Selain itu pada saat proses penyaringan dan penambahan ethanol terjadi kehabisan bahan dan karenanya terdapat sebagian percobaan yang belum tuntas dan menggunakan bahan pengganti yang terbatas kapasitasnya dibandingkan bahan yang semestinya digunakan dalam praktikum.

BAB V

PENUTUP V.1 Kesimpulan

Adapun kesimpulan dari praktikum ini adalah:

1. Untuk melakukan isolasi DNA metode atau teknik yang digunakan pada dasarnya

ada tiga yaitu: pelisisan sel, ekstraksi, dan pemurnian. Pelisisan dapat dilakukan dengan cara mekanik maupun kimia, salah satunya dengan cara diblender dan dicampur larutan detergen. Ekstraksi dapat dilakukan dengan penambahan garam dapur (NaCl) dan pemurnian salah satu metodenya adalah dengan memberikan larutan ethanol dingin 96%.

2. Jenis detergen dan buah yang dipakai untuk melakukan isolasi DNA sangat

berpengaruh pada DNA yang dihasilkan.

V.2 Saran

Adapun saran untuk praktikum ini sebaiknya alat dan bahan laboratorium ditambah untuk mencegah terjadinya kekurangan bahan yang dapat mengakibatkan keasalahan dan kurang akuratnya hasil yang didapatkan pada praktikum ini.

DAFTAR PUSTAKA

Agus, Rosana dan Sjafaranain. 2014. Penuntun Praktikum Genetika. Makassar. Dwidjoseputro. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta.

Kimball, J. John. 1992. Biologi. Erlangga. Jakarta.

Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda dan USESE Foundation. Bogor.

Suharsono dan Widyastuti, Utut. 2006. Pelatihan Singkat Teknik Dasar Pengklonan Gen. IPB Press. Bogor.