DAFTAR PUSTAKA
TINJAUAN PUSTAKA Kambing Perah
Kambing diklasifikasikan kedalam kingdom Animalia, filum Chordata, sub- filum Vertebrata, kelas Mammalia, ordo Artiodactyla, sub-ordo Ruminantia, famili Bovidae, genus Capra dan spesies Capra hircus (Ensminger 2002). Pemeliharaan kambing memberikan pengaruh besar terhadap sistem pertanian pedesaan, karena kambing telah beradaptasi dengan baik di sebagian besar wilayah Indonesia. Produksi susu kambing telah memberikan kontribusi sebesar 35% terhadap total produksi susu dunia, atau mengalami peningkatan cukup berarti dari tahun-tahun sebelumnya yaitu sebesar 9 % (Weinsten 2005).
Kambing Saanen
Kambing Saanen berasal dari lembah Saanen di Swiss Barat. Kambing ini berwarna putih, krem atau coklat muda dengan bulu yang panjang atau pendek, telinga tegak, serta memiliki temperamen yang tenang dan jinak (Blakely & Bade 1992). Kambing Saanen mempunyai produksi susu tertinggi dibandingkan dengan bangsa kambing perah lainnya, oleh karena itu bangsa kambing ini disebarluaskan ke banyak negara. Rata-rata produksi susu kambing Saanen di daerah tropis adalah 1-3 kg per hari, sedangkan di daerah subtropik dapat mencapai 5 kg per hari. Jenis kambing Saanen banyak dipelihara sebagai penghasil susu.
Kambing Saanen terkenal sebagai penghasil susu berkualitas dengan kandungan lemak rendah (Winarno & Fernandez 2007). Produksi susu dengan kandungan lemak antara 3-4% per masa laktasi yang berlangsung selama 250 hari (Davendra & Burn 1994). Kambing jenis Saanen dapat dibedakan dari kambing lainnya yaitu dengan ciri-ciri utama telinga dengan cuping kearah atas. Telinga kecil, pendek, tegak ke arah depan dan samping. Kepala kecil dan berbentuk lancip. Selain itu warna bulu biasanya putih atau krem, ambing serta puting besar dan lunak, induk betina sering melahirkan anak kembar (Mulyono 2008).
Kambing Peranakan Etawah
Peranakan Ettawa (PE) merupakan hasil persilangan antara kambing Ettawa dari India dengan kambing kacang yang penampilannya mirip Ettawa tetapi lebih kecil dengan proporsi genotipe yang tidak jelas (Balitnak 2004). Ciri khas kambing PE yaitu bentuk muka cembung melengkung dan dagu berjanggut, di bawah leher terdapat gelambir yang tumbuh berawal dari sudut janggut, telinga panjang, menggantung dan ujungnya agak melipat, tanduk berdiri tegak mengarah kebelakang dengan ujung tanduk melingkar, tinggi tubuh (gumba) 70-90 cm, tubuh besar, pipih, bentuk garis punggung seolah-olah mengombak kebelakang, bulu tubuh tampak panjang di bagian leher, pundak, punggung, dan paha, bulu paha panjang dan tebal, warna bulu putih, hitam hingga cokelat (Mulyono 2008).
Kambing PE digolongkan sebagai kambing tipe dwiguna yaitu sebagai penghasil daging dan susu (Adiati et al. 2000). Kambing PE memiliki ambing yang besar, putingnya panjang. Produksi susunya berkisar 1.0-1.5 liter/ekor/hari sepanjang masa laktasi antara 5-6 bulan, dengan masa kering 2-3 bulan (Balitnak 2004).
Susu Kambing
Susu menurut SNI01-3141-1998, susu adalah cairan yang berasal dari ambing sehat dan bersih, yang diperoleh dengan cara pemerahan yang benar, yang kandungan alaminya tidak dikurangi atau ditambah sesuatu apapun dan belum mendapat perlakuan apapun kecuali proses pendinginan tanpa mempengaruhi kemurniannya (DSN 1998). Pemerintah untuk melindungi konsumen, menetapkan standar khusus untuk suatu produk. Indonesia saat ini baru mempunyai standar untuk susu sapi segar yang tercantum dalam SNI 01-1341- 1998 (Tabel 1) dan belum mempunyai standar susu kambing segar.
Susu kambing memiliki nilai gizi yang serupa dengan susu sapi. Susu kambing terkenal karena kandungan atau nilai nutrisi dan dipercaya mempunyai nilai medis sejak zaman dahulu. Karakteristik susu kambing dibandingkan dengan susu sapi adalah (1) warna susu lebih putih (2) globula lemak susu lebih kecil dengan diameter 0.73-0.58 µm (3) mengandung mineral kalsium, fosfor, vitamin A, E dan B kompleks yang tinggi (4) dapat diminum oleh orang-orang yang alergi susu sapi dan orang-orang yang mengalami gangguan pencernaan (5) dari segi
produktivitas, produksi susu kambing lebih cepat diperoleh karena kambing telah dapat berproduksi pada umur 1.5 tahun, sedangkan sapi baru dapat berproduksi pada umur 3-4 tahun, tergantung ras (Saleh 2004).
Tabel 1. Syarat mutu susu sapi segar berdasarkan SNI 01-3141-1998
No Parameter Syarat
1.
2.
SUSUNAN SUSU
Berat Jenis (BJ) pada suhu 27,5oC Kadar lemak
Kadar Bahan Kering Tanpa Lemak (BKTL) atau Solid Non Fat (SNF)
Kadar protein
Cemaran logam berbahaya - Timbal (Pb)
- Seng (Zn) - Merkuri (Hg) - Arsen (As)
KEADAAN SUSU
Organoleptik : warna, bau, rasa dan kekentalan
Kotoran dan benda asing Cemaran mikroba - Total mikroba - Salmonella
- Escherichia coli (patogen)
- Coliform
- Streptococcus group B - Staphylococcus aureus
Jumlah sel radang Uji Katalase Uji Reduktase
Residu antibiotic, pestisida dan insektisida Uji Alkohol (70%) Derajat Asam Uji Pemalsuan Titik Beku Uji Peroksidase Minimal 1,0280 Minimal 3,0% Minimal 8,0% Minimal 2,7% Maksimum 0,3 ppm Maksimum 0,5 ppm Maksimum 0,5 ppm Maksimum 0,5 ppm
Tidak ada perubahan Negatif Maksimum 1.000.000 CFU/ml Negatif Negatif 20 CFU/ml Negatif 100 CFU/ml Maksimum 40.000/ml Maksimum 3 cc 2-5 jam
Sesuai dengan peraturan yang berlaku Negatif 6-7oSH Negatif -0,520 s/d -0,560 oC Positif Sumber: DSN 1998
Ketersediaan magnesium di dalam susu kambing, menurut Aliaga (2003) lebih besar dibandingkan susu sapi dan mengandung jumlah vitamin D yang lebih banyak. Magnesium memiliki arti penting, karena berhubungan dengan metabolisme. Mineral magnesium dikenali sebagai kofaktor di dalam lebih dari 300 reaksi enzimatik yang mempengaruhi kegiatan metabolisme dan sintesa
protein dan asam nukleat. Susu kambing adalah sumber Ca dan asam amino triptofan dan zat gizi lain yang sangat baik. Susu kambing tidak mengandung protein yang menyebabkan alergi seperti yang terdapat pada susu sapi serta mengandung olisakarida yang berperan sebagai anti-inflamasi (Mateljan 2008).
Menurut Thai Agricultural Standard (2008) susu kambing segar adalah susu segar yang diperoleh dari induk kambing (Capra spp.) tidak kurang dari 3 hari setelah kelahiran. Susu harus tidak dikurangi dan tidak ditambahkan komponen lain. Tidak boleh mengalami suatu perlakuan kecuali pendinginan. Susu harus tidak mengandung kolostrum. Klasifikasi susu kambing berdasarkan mutu digolongkan berdasarkan total mikroba, jumlah sel somatik ambing, kandungan lemak dan bahan kering, dengan ketentuan parameter tersebut digunakan sebagai kriteria untuk pemasaran susu kambing segar. Penggolongan mutu tersebut dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Klasifikasi mutu susu kambing segar berdasarkan karakteristiknya
Karakteristik Kelas
Premium Baik Standar
1. Total Mikroba (cfu/ml) < 5 x 104 5 x 104 - 105 > 105 - 2 x 105 2. Sel Somatik (sel/ml) < 7 x 105 7 x 105 - 106 > 106 - 1,5 x 106
3. Protein (%) > 3.7 > 3.4 – 3.7 3.1 – 3.4
4. Lemak(%) > 4 > 3.5 – 4 3.25 – 3.5
5. Total Solid (%) > 13 > 12 – 13 11.7 - 12
Thai Agricultural Standard (2008) menetapkan beberapa syarat untuk susu kambing segar, yaitu syarat secara umum dan pengelompokan berdasarkan mutu. Syarat umum yaitu: normal, bersih dan berwarna putih atau krem, flavor normal tanpa bahan asing dan pencampuran, ketika diuji dengan uji alkohol untuk mengamati reaksi antara susu kambing segar dengan etil alkohol, endapan atau gumpalan harus hanya sedikit dan berukuran kecil, pH harus diantara 6.5 – 6.8, berat kering tanpa lemak tidak boleh kurang dari 8.25 %, titik beku tidak boleh di atas – 0.530 oC, berat jenis harus tidak kurang dari 1.028 pada suhu 20 oC, perubahan warna metilen blue harus lebih dari 4 jam, perubahan warna resazurin pada satu jam pertama tidak kurang dari skala 4.5.
Mentega
Mentega berdasarkan SNI01-3744-1995 (DSN, 1995) adalah produk makanan berbentuk padat lunak yang dibuat dari lemak atau krim susu atau campurannya dengan atau tanpa penambahan garam (NaCl) atau bahan lain yang diizinkan dan maksimal mengandung 80 % lemak susu.
Spreer (1998) menyatakan, mentega merupakan emulsi air dalam minyak dengan kira-kira 18% air terdispersi didalam 80% lemak dengan sejumlah kecil protein yang bertindak sebagai zat pengemulsi (emulsifier). Mentega merupakan lemak makanan dengan flavor dan cita rasa yang enak dan khas. Ciri khas ini pada dasarnya merupakan komposisi alami dari lemak susu yang dihasilkan melalui proses biokimia. Mentega mudah dicerna dan dimanfaatkan oleh tubuh (>90%) karena kemampuan mentega mencair yang mendekati temperatur tubuh. Mentega mengandung vitamin yang dapat larut dalam lemak, terutama vitamin A.
Apabila ditinjau dari segi kesehatan maka kandungan kolesterol yang terdapat pada mentega sering menjadi perhatian utama, namun berdasarkan teori lipid belum ada bukti yang nyata dari hubungan antara kolesterol makanan dan kolesterol serum (dibentuk pada tubuh saat mencapai 1000mg/hari).
Proses pembuatan mentega melalui tahapan utama separasi krim, churning
dan kneading. Mentega diperoleh dari krim melalui proses agitasi yang disebut
churning. Krim diaduk dan dikocok sehingga menghancurkan membran yang menyelubungi butir-butir lemak. Gumpalan-gumpalan lemak susu dipisahkan dari bagian lain dan dicuci dengan air dingin beberapa kali untuk menghilangkan
buttermilk hasil ikutannya. Working atau kneading dilakukan dengan tujuan untuk mengeluarkan air yang tersisa dalam lemak butter fat (susu). Mentega biasanya diberi garam dengan jumlah sekitar dua setengah persen untuk meningkatkan citarasa dan sebagai pengawet (Winarno & Fernande 2007).
Menurut Hettinga (2005), mentega adalah salah satu bentuk pengawetan komponen lemak susu. Karakteristik tekstur mentega secara signifikan tergantung pada komposisi lemak susu dan metode pembuatannya. Jika komposisi kimia dari lemak mentega diketahui, maka akan memudahkan untuk memilih parameter teknologi yang tepat pada pembuatan mentega guna memperbaiki teksturnya. Hal ini penting dilakukan pada industri pembuatan mentega guna menghasilkan
produk mentega dengan karakteristik yang konstan dan mengendalikan parameter pembuatan mentega.
Lemak susu memiliki komposisi asam lemak yang cukup komplek. Trigliserida merupakan komponen yang paling banyak mendominasi lemak susu yaitu sebesar 98% (dengan sejumlah kecil digliserida, monogliserida dan asam lemak bebas). Komponen lainnya yang terdapat dalam lemak susu yaitu fosfolipid, sterol (kolesterol) serta sejumlah kecil vitamin yang larut dalam lemak (terutama A, D dan E), antioksidan (tokoferol), pigmen (karoten) dan komponen rasa (lakton, aldehid dan keton).
Asam lemak adalah asam monokarboksilat berantai lurus yang terdapat di alam sebagai ester di dalam molekul lemak atau trigliserida. Hasil hidrolisis trigliserida akan menghasilkan asam lemak jenuh dan tak jenuh berdasarkan ada tidaknya ikatan rangkap rantai karbon di dalam molekulnya. Asam lemak tidak jenuh (memiliki ikatan rangkap) yang terdapat dalam lemak dapat berada dalam dua bentuk yakniisomer cis dan trans. Asam lemak tak jenuh alami biasanya berada sebagai asam lemak cis, hanya sedikit bentuk trans.
Stuktur asam lemak pada mentega belum dipahami dengan jelas, diperkirakan terdapat 400 jenis asam lemak yang ditemukan didalam lemak susu dengan jumlah atom karbon C2 hingga C28, termasuk asam lemak dengan jumlah
atom karbon ganjil, jenuh, tak jenuh tunggal dan tak jenuh ganda, cis dan
trans, linear dan bercabang, dan berbagai keto-dan asam lemak hidroksi (Collomb
et al. 2002). Sekitar 20 asam lemak merupakan komponen utama dalam pembentukan lemak susu dan sisanya terdapat dalam jumlah yang sangat sedikit, sedangkan pada mentega hanya sekitar 15 asam lemak utama yang dipertimbangkan (Hettinga 2005).
Gen Growth Hormon (GH)
Hormon pertumbuhan atau growth hormone (GH) merupakan hormon anabolik yang disintesis dan disekresikan oleh sel somatotrof pada lobus anterior pituitari (Ayuk & Stephard 2006). Protein GH terdiri atas 191 asam amino, dengan berat molekul 22 kDa (Frago & Chowen 2005). Sintesis dan sekresi protein tersebut dipengaruhi oleh umur dan jenis kelamin (Ardiyanti et al. 2009).
Protein ini memiliki peranan penting dalam pertumbuhan dan perkembangan longitudinal pascanatal, pertumbuhan jaringan, laktasi, reproduksi, metabolism lipida, protein dan karbohidrat. Pada ternak ruminansia, GH berperan dalam pengaturan perkembangan kelenjar mamae (Akers 2002).
Protein GH disandikan oleh gen GH yang terletak pada kromosom 18 dengan panjang sekitar 200 bp yang tersusun atas lima ekson dan empat intron. Gen GH telah digunakan secara luas sebagai penanda pada beberapa spesies ternak seperti sapi (Bos taurus dan Bos indicus) (Zhou et al. 2005) dan kambing (Capra hircus) (Boutinaud et al. 2003). Keragaman gen GH pada kambing Algarvia (Portugis) yang diidentifikasikan dengan metode single strand conformation polymorphism (SSCP) berhubungan dengan sifat produksi, lemak dan protein susu (Boutinaud et al. 2003).
Mekanisme Kerja Growth Hormone
GH (Growth hormone) yang dihasilkan oleh kelenjar pituitari pertama-tama mengalir melalui pembuluh darah menuju ke organ hati. GH di dalam hati diubah menjadi IGF-1 (Insulinlike Growth Factor 1), melalui peredaran darah bersama aliran nutrien, IGF-1 dialirkan ke seluruh organ-organ yang ada di tubuh ternak. IGF-1 inilah yang bertanggung jawab untuk memelihara seluruh organ-organ di dalam tubuh manusia. Gen GH penting untuk pertumbuhan setelah kelahiran dan metabolisme normal karbohidrat, lemak, nitrogen serta mineral. Growth hormone tidak bekerja secara langsung dalam mempengaruhi pertumbuhan, tetapi melalui perantaraan suatu peptida yang disebut somatomedin (IGF I dan IGF II) yang produksinya diinduksi oleh growth hormone. Somatomedin yang produksi utamanya di hati ini dipengaruhi juga oleh usia dan keadaan nutrisi ternak. Somatomedin inilah yang akan berikatan dengan reseptor-reseptor dalam sel tubuh guna merangsang pertumbuhan melalui:
1. Sintesis protein. Hormon pertumbuhan akan meningkatkan produksi protein dan transportasinya ke sel-sel otot sehingga merangsang pertumbuhan otot dan jaringan pada umumnya.
2. Metabolisme karbohidrat. Hormon pertumbuhan memiliki efek antagonis terhadap insulin, sehingga meningkatkan kadar gula dalam
darah, yang nantinya akan meningkatkan proses konversi karbohidrat menjadi protein.
3. Metabolisme lemak. Hormon pertumbuhan akan meningkatkan penguraian lemak tubuh menjadi asam lemak bebas dan gliserol, sehingga kadar lemak dalam darah meningkat.
4. Efek mirip prolaktin sehingga merangsang kelenjar ambing dan produksi susu saat kebuntingan (Ohlsson et al.1998).
Penanda Molekuler
Penanda molekuler memiliki peranan penting dalam genetika ternak. Hal tersebut merupakan salah satu faktor utama yang mendasari terjadinya proses seleksi (Vignal et al. 2002). Penanda molekuler merupakan pemanfaatan dari keragaman meliputi subsitusi, delesi, insersi dan inverse (Nei & Kumar 2000).
Polymerase chain reaction (PCR) merupakan suatu teknik untuk menggandakan jumlah molekul DNA secara in vitro. Proses ini berjalan dengan bantuan enzim polymerase dan primer. Primer merupakan oligonukleotida spesifik pada DNA template. Enzim polymerase merupakan enzim yang dapat mencetak urutan DNA baru. Hasil PCR dapat langsung divisualisasikan dengan elektroforesis atau dapat digunakan untuk analisis lebih lanjut (Williams 2005).
Polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism atau PCR-SSCP merupakan salah satu metode analisis lebih lanjut yang memanfaatkan produk PCR. Metode PCR-SSCP merupakan metode yang handal dalam mendeteksi adanya mutasi secara cepat (Hayasi 1991). Metode ini didasarkan pada asumsi bahwa perubahan asam nukleotida akan menyebabkan perubahan pola migrasi dari bentuk ikatan utas tunggal DNA pada gel poliakrilamida, yang disebut sebagai perubahan konformasi atau bentuk molekul. Pendeteksian dalam SSCP dipengaruhi oleh matriks gel, kondisi elektroforesis, panjang fragmen dan kandungan G+C (Nataraj et al. 1999). Perbedaan konsentrasi akrilamida, perbandingan akrilamida dengan bis-akrilamida, penggunaan gliserol, suhu elektroforesis dan kondisi buffer dapat berpengaruh terhadap pendeteksian keragaman (Barroso et al. 1999).
Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) merupakan suatu metode analisis molekuler yang bertujuan untuk melihat perbedaan jumlah basa antar fragmen dengan menggunakan gel poliakrilamid, yang masing-masing dapat memisahkan 6-8 basa. Template DNA pada poliakrilamid gel difragmentasi dengan elektroforesis terkontrol yang disebut GenePhor. Genephor merupakan horizontal elektroforesis kering, dengan suhu yang dapat diatur sedemikian rupa, sehingga dapat memisahkan DNA pada tegangan tinggi tanpa menimbulkan panas yang berlebihan pada poliakrilamid gel. Metode pewarnaan menggunakan metode
silver stainning. Hasil dari SSCP sangat dipengaruhi dan ditentukan oleh konsentrasi DNA sampel serta proses ekstraksi, amplifikasi, purifikasi dan restriksi serta optimasi dalam pelaksanaan stainning. Teknik ini merupakan salah satu teknik analisis polimorfisme dan banyak diterapkan untuk genotiping dengan hasil cukup akurat.
Analisis Keragaman Genetik
Keragaman genetik dapat digunakan sebagai parameter dalam mempelajari genetika populasi dan genetika evolusi. Tingkat keragaman dalam populasi dapat digambarkan dari frekuensi alel yangmerupakan rasio relatif suatu alel terhadap keseluruhan alel yang ditemukan dalam satu populasi. Informasi keragaman genetik suatu populasi menggunakan beberapa lokus, dapat digambarkan melalui nilai heterozigositas (Nei & Kumar 2000).
Identifikasi keragaman genetik dalam suatu populasi berguna untuk mengetahui dan melestarikan bangsa-bangsa dalam populasi terkait dengan penciri suatu sifat khusus. Populasi alami biasanya memiliki keragaman genetik yang tinggi. Informasi keragaman genetik suatu bangsa akan sangat bermanfaat bagi keamanan dan ketersediaan bahan pangan yang berkesinambungan (Blott et al. 2003).
BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu
Penelitian dilaksanakan mulai bulan Juni 2010 hingga Januari 2011. Lokasi pengambilan sampel darah dan susu kambing dilakukan di PT Fajar Taurus Dairy Farm dan PT Elang 45. Analisis keragaman gen dilaksanakan di Laboratorium Genetika Molekuler Bagian Pemuliaan dan Genetika Ternak Fakultas Peternakan IPB, sementara pengujian kualitas susu dan produk olahan susu dilaksanakan di Laboratorium Pengolahan Susu Bagian THT Fakultas Peternakan IPB dan Laboratorium Terpadu IPB.
Materi Sampel Darah Kambing
Ternak yang digunakan dalam penelitian ini adalah kambing Saanen dan Peranakan Etawah yang berjumlah 89 ekor. Pengambilan sampel darah dilakukan untuk masing-masing individu ternak kambing. Alat dan bahan untuk pengambilan sampel darah berupa venoject, vacutainer dan etanol. Ekstraksi DNA menggunakan metode fenol kloroform (Sambrook et al.1989).
Primer
Primer adalah DNA utas tunggal dengan ukuran pendek, biasanya 18 sampai 25 basa, yang akan menempel pada DNA cetakan pada tempat yang spesifik. Primer berguna untuk mengapit sekuen DNA target pada reaksi PCR. Pada penelitian ini, primer forward dan reverse untuk mengamplifikasi gen GH ditunjukkan pada Tabel 3.
Tabel 3. Primer untuk amplifikasi gen GH
No. Sekuens (5'-3') Pustaka
1. Forward GGA AGG GAC CCA ACA ATG CCA Kioka et al. 1989 2. Reverse CTG CCA GCA GGA CTT GGA GC
Bahan dan Alat Analisis PCR
Bahan yang digunakan untuk PCR adalah DNA, pereaksi PCR (Master mix- Genaid) yang terdiri atas enzim tag DNA polymerase, 10x buffer, larutan MgCl2, dNTPs, primer forward dan reverse fragmen gen GH. Peralatan yang
digunakan adalah pipet tip, mikropipet, microtube eppendorf, microsentrifuge dan mesin thermocycler.
Bahan dan Alat Analisis PCR-SSCP
Bahan yang digunakan untuk analisis PCR-SSCP adalah air destilasi steril, akrilamida 30%, 5 x TBE, TEMED (tetramethylendiamine) dan APS (ammonium persulfat) 10 %, loading dye dan marker 100 pb (Biorad). Alat yang digunakan adalah dua buah kaca untuk cetakan gel, pipet berskala, tabung reaksi, sisir khusus untuk sumur, pipet mikro Eppendorf 2 µl dengan tipsnya dan power supply 200 Volt.
Bahan dan Alat Pewarnaan Perak
Bahan yang digunakan adalah larutan yang terdiri atas 0.2 gram AgNO3;
80 µl NaOH 10 N ; 0.8 ml NH4OH dalam 200 ml air destilasi, larutan 6 gram
NaOHdengan 200 µl formaldehida dan asam asetat 200 µl dalam 200 ml air. Alat yang digunakan adalah gelas ukur, labu Erlenmeyer dan water-bath shaker.
Bahan dan Alat Analisis Kualitas Susu Kambing dan Mentega
Sampel susu diambil dari ternak kambing Saanen dan PE. Pengolahan susu yang dilakukan adalah pemisahan lemak susu dengan separator krim. Sebelum dilakukan pengolahan susu dilakukan pengujian terhadap kualitas susu segar. Bahan yang digunakan untuk analisis susu dan mentega susu kambing antara lain H2SO4, alkohol 70%, Aquadest, NaOH 0.1 N, amilalkohol, fenolftalin,
NaOH, kalium oksalat, K2SO4, HgO dan formalin. Peralatan yang digunakan
antara lain laktodensimeter, butirometer, pipet volumetric, pH-meter, inkubator, autoklaf, timbangan analitik, termometer, labu Kjeldahl, alat titrasi, alat-alat gelas, sentrifuse, wadah plastik, desikator, cawan porselen, tanur, alat ekstraksi Sokhlet, oven 105ºC dan penangas air.
Metode
I. Identifikasi Keragaman Molekuler
a. Pengambilan Sampel Darah (Sulandari & Zein 2003)
Pengambilan sampel darah kambing dilakukan menggunakan venoject pada bagian vena jugularis sebanyak 2 ml. Sampel darah selanjutnya dicampur dengan etanol 70% untuk menghindari kerusakan sel-sel darah.
b. Ekstraksi DNA ( Sambrook 1989)
DNA diekstraksi dengan menggunakan metode fenol kloroform (Sambrook
et al.1989). Sampel darah total yang disimpan dalam etanol 95% disentrifugasi 3500 rpm selama 5 menit. Endapan sel-sel darah yang diperoleh dicuci dengan buffer TE sebanyak 2 kali. Sekitar 100 µl sel-sel darah yang telah bebas dari etanol disuspensikan dengan 1xSTE sampai volume mencapai 350 µl. Sel-sel darah kemudian dilisis dengan 20 µl proteinase K (10 mg/ml) dan 40 µl 10% SDS. Campuran ini dikocok pelan-pelan selama 2 jam pada suhu 55oC.
Pemurnian DNA dilakukan dengan metode fenol-kloroform, yaitu dengan menambahkan 1/10 volume 5 M NaCl, 1 x volume larutan fenol, dan 1 x volume kloroform iso amil alkohol (24:1), kemudian dikocok pelan-pelan pada suhu ruang selama 2 jam. Fase DNA dipisahkan dari fase fenol dengan sentrifugasi pada kecepatan 7000 rpm selama 5 menit. Molekul DNA diendapkan dengan menambahkan 1/10 x volume 5 M NaCl dan 2 x volume etanol absolut. Endapan DNA yang dihasilkan selanjutnya dicuci dengan etanol 70% kemudian diendapkan lagi dengan kecepatan 7000 rpm selama 5 menit. Sisa etanol dibuang dan diuapkan dengan menggunakan pompa vakum. DNA selanjutnya dilarutkan dengan 80 µl 80% buffer TE.
c. Amplifikasi Gen dengan Tehnik PCR
Teknik PCR dilakukan untuk memperbanyak (amplifikasi) fragmen gen menjadi 2n copy. Dengan perbanyakan ini maka fragmen gen target dapat divisualisasikan pada gel elektroforesis.
Reaksi PCR dilakukan dengan volume total 25 µl dari campuran larutan yang terdiri atas 2 µl DNA genom, 1 U enzim taq polimerase dan 10X buffernya (New England Biolab); 2 mM dNTP mix; 2.5 mM MgCl2 dan dH2O steril. Kondisi
reaksi PCR dalam mesin thermocycler dirancang dengan suhu pradenaturasi 94oC selama 4 menit, selanjutnya 30 siklus reaksi yang terdiri atas denaturasi 95 oC selama 30 detik, annealing (suhu spesifik primer) selama 1 menit, perpanjangan 72 oC selama 1 menit. Pemanjangan akhir pada suhu 72 oC selama 5 menit. Suhu
annealing untuk primer gen GH 60 oC.
d. Genotiping Teknik PCR-SSCP (Tegelstrom 1992)
Genotiping dengan teknik SSCP menggunakan elektroforesis gel poliakrilamid 10%. Gel dibuat dengan cara pencampuran 14 ml air destilata; 2.5 ml larutan 5 x TBE; 8,3 ml larutan akrilamid 30%; 15 µl larutan TEMED dan 150 µl APS 10%. Sebanyak 2 µl produk PCR dicampur dengan + 25 µl loadying dye
(bromthymol blue 0.01%, xilene cyanol 0.01 dan gliserol 50%). Elektroforesis dilakukan pada tegangan konstan 200 volt selama 16 jam. Setelah elektroforesis selesai, gel diambil untuk dilakukan pewarnaan perak.
d.Visualisasi Pita DNA (Tegelstrom 1992)
Visualisasi pola pita hasil SSCP menggunakan metode silver stainning atau pewarnaan perak. Tahapan pewarnaan perak yaitu gel dicuci secara bertahap