ini dapat menjadi salah cara untuk memanfaatkan hasil samping industri gula, selain untuk mengurangi penggunaan bahan pangan dalam produksi asam laktat.
Penelitian ini bertujuan memanfaatkan tetes tebu sebagai alternatif substrat yang berharga murah dalam produksi asam laktat dengan bantuan bakteri L. delbrueckii subsp. bulgaricus. Hipotesis dari penelitian ini adalah tetes tebu dapat menjadi alternatif substrat dalam produksi asam laktat secara fermentasi dengan bantuan L. delbrueckii subsp. bulgaricus. Manfaat dari penelitian ini adalah tetes tebu dapat digunakan sebagai alternatif substrat untuk produksi asam laktat yang dihasilkan dari fermentasi L. delbrueckii subsp. bulgaricus sebagai bahan dasar untuk pembuatan polylactic acid (PLA) yang ramah lingkungan.
TINJAUAN PUSTAKA
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricusBakteri asam laktat termasuk ke dalam bakteri Gram positif, non-spora, berbentuk batang atau kokus. Kelompok bakteri ini mampu memfermentasi karbohidrat untuk menghasilkan asam laktat sebagai produk utama atau asam laktat dengan produk samping lainnya, seperti asam asetat, etanol, karbondioksida, dan asam format. Berdasarkan ketentuan komposisi basa dalam DNA bakteri, kelompok bakteri asam laktat terbagi dalam dua kelompok yaitu Clostridium dan Actynomyces. Anggota Clostridium adalah Genus Lactobacillus, Lactococus, Leuconostoc, Enterococcus, Pediococcus, dan Carnobacterium. Anggota Actynomyces adalah Bifidobectarium (Suskovic et al. 2001).
Bakteri asam laktat memfermentasi gula melalui jalur yang berbeda sehingga dikenal sebagai homofermentatif, heterofermentatif, atau fermentasi campuran asam. Bakteri
2
homofermentatif hanya menghasilkan asam laktat sebagai produk akhir metabolisme glukosa dengan menggunakan jalur EMP. Bakteri heterofermentatif akan menghasilkan asam laktat, karbondioksida, dan etanol melalui jalur fosfoketolase (Hidayat et al. 2006).
Bakteri L. delbrueckii subsp. bulgaricus yang digunakan dalam penelitian ini merupakan salah satu spesies bakteri yang termasuk dalam golongan bakteri asam laktat. Bakteri ini ditemukan pertama kali oleh seorang doktor asal Bulgaria, Stamen Grigorov pada tahun 1905. L. delbrueckii subsp. bulgaricus (Gambar 1) merupakan bakteri yang memiliki genus terbesar dalam kelompok bakteri asam laktat dengan hampir 80 spesies yang berbeda. Bakteri ini berbentuk batang panjang serta bersifat anaerob fakultatif dan katalase negatif (Prescott et al. 2002). Bakteri ini termasuk kelompok bakteri yang bersifat non patogen. Strain Lactobacillus diketahui mampu menghasilkan senyawa bacteoricin yang mampu bersifat bakterisidal terhadap mikroorganisme lain (Laverenz et al. 2006). Suhu optimum pertumbuhan bakteri ini adalah 42°C-45°C. Menurut Dumbrepatil et al. (2007), suhu optimum bakteri ini berada pada 42°C
.
Bakteri L. delbrueckii subsp. bulgaricus menghasilkan asam laktat yang dapat menurunkan pH media fermentasi sehingga mengakibatkan terhambatnya pertumbuhan bakteri penggangu baik bakteri Gram positif maupun bakteri Gram negatif (Cabo et al. 2002).Gambar 1 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Gesciova et al. 2002)
Tetes Tebu (Molasses)
Tebu merupakan salah satu komoditas unggulan tanaman perkebunan yang banyak dimanfaatkan di industri pangan (Rao et al. 2006). Tetes tebu merupakan hasil samping industri gula yang mengandung senyawa nitrogen, unsur pertumbuhan, dan kandungan gula yang cukup tinggi. Sumber tetes tebu berasal dari tebu dan bit. Dari kedua sumber tersebut akan didapatkan tetes tebu yang berbeda sifat dan pengolahannya. Tetes tebu
kaya akan biotin, asam pantotenat, tiamin, fosfor, dan sulfur. Selain itu juga mengandung gula yang terdiri dari sukrosa 30-40%, glukosa 4-9%, dan fruktosa 5-12% (Tabel 1) (Hidayat et al. 2006).
Tetes tebu digunakan secara luas sebagai sumber karbon untuk denitrifikasi, fermentasi anaerobik, pengolahan limbah aerobik, dan diaplikasikan pada budidaya perairan (Burford et al. 2003; Jimenez et al. 2004; Quan et al. 2005).
Tetes tebu berbeda dengan bahan baku umum yang digunakan dalam produksi alkohol seperti jagung dan kentang. Bahan tersebut mengandung karbohidrat yang disimpan sebagai pati sehingga harus mengalami perlakuan awal misalnya dengan menambahkan enzim untuk menghidrolisis pati menjadi gula yang dapat difermentasi. Sebaliknya, karbohidrat dalam tetes tebu telah siap digunakan untuk fermentasi tanpa perlakuan pendahuluan karena sudah berbentuk gula (Hidayat et al. 2006).
Selain itu, tetes tebu merupakan sumber daya alam yang melimpah. Hal ini didukung dengan luas lahan perkebunan tebu yang terus meningkat dari tahun ke tahun untuk digunakan dalam produksi gula. Pada tahun 2009 areal perkebunan tebu di Indonesia mencapai 473 ribu ha atau naik 2.9% dibanding pada tahun 2008 yang hanya mencapai 460 ha. Sejalan dengan meningkatnya areal perkebunan tebu, maka produksi pun meningkat dengan pertumbuhan sekitar 2.8% (2.85 juta ton) pada tahun 2009. Selain itu, dalam rangka memenuhi kebutuhan gula nasional dari dalam negeri, pemerintah menetapkan akan memperluas areal tanaman tebu hingga 150000 ha pada 2010 dengan tahap awal seluas 41705 ha (ICN 2010). Tabel 1 Komposisi kimiawi tetes tebu
Unsur Kisaran (%)
Air 17-25
Sukrosa 30-40 Dektrosa (glukosa) 4-9 Laevulosa (fruktosa) 5-12 Bahan pereduksi lain 1-5 Karbohidrat lain 2-5
Abu 7-15
Unsur Nitrogen 2-6 Unsur bukan nitrogen 2-8 Lilin, sterol, fosfolipid 0.1-1 Kalsium - Fosforus - Sumber: Hidayat et al. 2006
Pada tahun 2011, menurut salah satu BUMN Perkebunan, PT Perkebunan Nusantara X (PTPN X) menyebutkan bahwa produksi tetes tebu yang berasal dari industri gula yang tersebar di daerah Jawa Timur mencapai 310.67 ton. Hasil ini menunjukkan bahwa ketersediaan tetes tebu di Indonesia sudah terjamin. Selain itu, tetes tebu juga memiliki harga yang murah.
Fermentasi Asam Laktat
Fermentasi adalah suatu proses perubahan- perubahan kimia dalam suatu substrat organik yang berlangsung karena aksi kalisator- kalisator biokimia, yaitu enzim yang dihasilkan oleh mikrob-mikrob hidup tertentu. Faktor-faktor yang penting dalam fermentasi adalah medium, garam, keasaman, kultur, dan waktu. Parameter penting lainnya dalam proses fermentasi adalah pH, suhu, tekanan, dan agitasi (Sodegard & Stolt 2002). Proses fermentasi bersifat sederhana namun harus teliti sehingga flavor, tekstur, aroma, dan karakteristik lainnya dapat terbentuk dengan baik(Hidayat et al. 2006)
Industri fermentasi dimulai sebelum tahun 1900, yaitu dengan dimulainya alkohol dan vinegar. Di Arab, produksi skala besar dimulai tahun 1700. Pengembangan proses dengan menggunakan termometer dimulai tahun 1757 dan pemindahan panas pada tahun 1801.
Produksi asam laktat di dunia mencapai 80000 ton sekitar 90% di antaranya dihasilkan oleh bakteri asam laktat melalui fermentasi dan sisanya dihasilkan secara sintesis dengan menghidrolisis laktonitril (Hidayat et al. 2006). Produksi asam laktat dapat dilakukan melalui proses curah (batch) maupun sinambung. Fermentasi dilakukan dengan menggunakan gula 5% dan sumber nitrogen sebagai nutrien. Rendemen asam laktat diperoleh sebanyak 90-99% setelah fermentasi dua hari. Pada fermentasi sinambung dengan menggunakan media yang sama lebih menguntungkan karena menghasilkan produktivitas yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan proses fermentasi secara curah (Sodegard & Stolt 2002).
Proses produksi asam laktat harus memperhatikan kurva pertumbuhan mikrob, sehingga pertumbuhan mikrob terbagi atas empat fase, yaitu lag, log, stationer, dan kematian. Fase lag ditandai dengan perubahan jumlah sel yang sangat kecil karena pada fase ini sel tidak langsung berproduksi dalam media baru. Pada fase ini, pembelahan sel yang terjadi sangat kecil. Selama fase ini sel-
sel tidak aktif dan mengalami aktivitas berbagai metabolik, khususnya sintesis enzim dan berbagai molekul. Fase log merupakan fase ketika sel-sel mikrob mulai membelah dan memasuki masa pertumbuhan konstan yang mengikuti kurva logaritmik, serta terjadinya aktivitas metabolik yang paling aktif. Namun, selama fase ini mikrob sangat sensitif terhadap kondisi lingkungan yang merugikan, seperti radiasi dan beberapa antimikrob. Fase ini dapat digunakan untuk menentukan waktu inkubasi mikrob ketika akan ditumbuhkan dalam media fermentasi. Fase stationer ditandai dengan pertumbuhan sel yang berjalan lambat. Jumlah mikrob yang mati seimbang dengan jumlah sel yang hidup sehingga populasi pada fase ini menjadi stabil. Aktivitas metabolik yang terjadi pada pada fase ini juga berjalan dengan lambat. Hal ini diakibatkan ketersediaan nutrisi yang tidak memadai dan akumulasi produk limbah. Pertumbuhan ini disebut pertumbuhan tersembunyi (cryptic). Apabila inkubasi masih berlangsung setelah fase stasioner dan sel masih hidup serta bermetabolisme maka sel lambat laun akan mati. Fase pertumbuhan terakhir adalah fase kematian. Jumlah kematian pada fase ini melebihi jumlah sel yang masih hidup karena nutrisi sudah hampir habis. Fase ini berlanjut hingga jumlah sel hidup terus berkurang untuk sebagian kecil dari jumlah pada fase sebelumnya atau hingga kematian pada semua sel (Tortora et al. 2006). Pertumbuhan mikrob dapat diukur dengan beberapa cara yaitu dengan menghitung jumlah sel dan massa sel. Pengukuran jumlah sel dilakukan dengan cara perhitungan mikroskopik langsung (Petroof-Hausser, hemasitometer), menghitung sel yang hidup (hitung cawan), filtrasi, dan mengukur kemungkinan jumlah sel yang ada secara statistik (Most Probable Number). Pengukuran massa sel meliputi pengukuran berat sel kering, kekeruhan (turbiditas), pengukuran aktivitas metabolisme (Tortora et al. 2006).
Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Mikrob
Kegiatan mikrob dipengaruhi oleh faktor- faktor lingkungan. Faktor-faktor lingkungan yang sering mempengaruhi pertumbuhan mirob adalah faktor abiotik dan biotik. Faktor abiotik yaitu suhu, kelembapan, pH, dan komposisi medium.
Suhu merupakan salah satu faktor yang penting dalam kehidupan mikrob. Beberapa mikrob dapat tumbuh pada kisaran suhu yang
4
luas. Suhu pertumbuhan dibagi dalam 3 tingkatan yaitu suhu minimum, maksimum, dan optimum. Suhu minimum adalah suhu yang paling rendah, namun kehidupan mikrob masih dapat berlangsung. Suhu maksimun adalah suhu teritinggi yang masih dapat menumbuhkan mikrob tetapi pada tingkat kegiatan fisiologi yang paling rendah. Selain itu, suhu optimum adalah suhu yang paling baik untuk kehidupan mikrob.
Berdasarkan suhu pertumbuhannya, mikrob dapat dibedakan menjadi 3 golongan, yaitu psikrofil, mesofil, dan termofil. Mikroba psikrofil/kriofil dapat pada tumbuh pada suhu antara 0 °C sampai 30 °C, dengan suhu optimum 15 °C. Mikrob golongan psikrofil tumbuh di tempat-tempat dingin, baik di daratan maupun lautan. Mikrob golongan mesofil mempunyai suhu optimum antara 25°C -37°C, dengan suhu minimum 15 °C dan suhu maksimum antara 45 °C -55 °C. Mikrob ini banyak hidup dalam saluran pencernaan, tanah, dan perairan. Mikrob golongan termofil mempunyai suhu pertumbuhan antara 40°C - 75 °C dengan suhu optimum 55 °C-60 °C (Hidayat et al. 2006).
Selain suhu, pH merupakan salah satu faktor penting dalam pertumbuhan mikrob. Setiap organisme mempunyai kisaran pH yang diperlukan untuk menunjang pertumbuhan terutama pada pH optimum. Pada media fermentasi, pH dapat berubah selama pertumbuhan berlangsung sebagai akibat reaksi metabolisme yang mengkonsumsi atau menghasilkan substansi asam atau basa (Sunatmo 2009).
Komposisi medium juga merupakan faktor yang penting dalam pertumbuhan mikrob. Sebagian besar prokariot membutuhkan senyawa karbon organik sebagai sumber karbon. Selain itu, mineral penting yang dibutuhkan mikrob diantaranya magnesium, natrium, dan besi (Sunatmo 2009).
Asam Laktat
Asam laktat (2-hydroxypropanoic acid) yang biasa disebut sebagai asam susu adalah salah satu bahan kimia yang berperan penting dalam industri biokimia. Asam laktat pertama kali berhasil diisolasi oleh ahli kimia Swedia, Carl Wilhelm Schele pada tahun 1780. Asam laktat mempunyai rumus kimia C3H6O3, termasuk keluarga asam hidroksi propionat dengan rumus molekul CH3CHOHCOOH. Asam laktat dalam larutan akan kehilangan satu proton dari gugus asam dan menghasilkan ion laktat CH3CH(OH)COO-.
Asam laktat larut dalam air dan etanol serta bersifat higroskopik (Riekri 2010).
Asam laktat merupakan senyawa natural yang dapat diproduksi oleh manusia, hewan, tumbuhan, dan mikroorganisme. Asam laktat memiliki dua bentuk isomer optik yaitu L- asam laktat dan D-asam laktat (Gambar 2). Asam laktat juga merupakan bentuk umum dalam metabolisme pada manusia, hewan, dan mikroorganisme. Bakteri dapat memproduksi asam laktat dalam dua bentuk (D- dan L-asam laktat) (Mirdamadi et al. 2002).
Reaksi dasar proses sintesis asam laktat secara kimiawi adalah mengubah laktonitril (asetaldehida sianohidrin) menjadi asam laktat. Beberapa metode kimia yang memungkinkan sintesis asam laktat adalah degradasi gula dengan alkali seperti kapur atau NaOH, interaksi asetaldehida dan karbonmonoksida pada suhu dan tekanan yang tinggi, dan hidrolisa dari asam α- kloropropionat (Aulana 2005).
Perbedaan produksi asam laktat secara kimia dengan fermentasi antara lain: yang pertama, sintesis kimia menggunakan senyawa beracun seperti hidrogen sianida sedangkan secara fermentasi, lebih ramah lingkungan; secara kimia produk yang dihasilkan merupakan campuran bentuk L- dan D-asam laktat sedangkan secara fermentasi produk yang dihasilkan bisa dalam bentuk L-, D-, atau DL- tergantung dari strain mikrob yang digunakan; sintesis kimia menggunakan bahan baku tidak bisa diperbaharui sedangkan secara fermentasi bahan bakunya dapat diperbaharui; produksi secara kimia memiliki kondisi ekstrim (temperatur tinggi dan tekanan) sedangkan secara fermentasi prosesnya dalam kondisi sedang (lebih hemat energi).
Saat ini, sekitar 85% kebutuhan asam laktat adalah untuk aplikasi di bidang pangan, antara lain sebagai pengasam makanan (food acidulan), pemberi rasa, penstabil pH, dan antimikrob (Koesnandar 2004). Kebutuhan asam laktat di Indonesia belum begitu besar yaitu sekitar 1 juta ton yang dipenuhi melalui impor dari negara-negara seperti Belanda, Amerika Serikat, dan Jerman.
D (-) asam laktat L(+) asam laktat Gambar 2 Struktur asam laktat (Takeuchi
Kebutuhan asam laktat dunia dilaporkan terus-menerus meningkat baik dari segi jumlah maupun dari segi volume penjualan. Asam laktat merupakan senyawa antara yang penting dan memiliki potensi besar untuk aplikasi produk baru seperti plastik ramah lingkungan atau plastik biodegradable (PLA), bahan polimer, aplikasi bidang farmasi dan kedokteran, pelarut alami dalam aplikasi proses pengemasan makanan, pemberi elastis (ester laktat dan turunan laktat), serta mengatur pertumbuhan tanaman asam (oligo(L-laktat) (Koesnandar 2004). Asam laktat juga mempunyai beberapa karakteristik di antaranya titik leleh yang rendah, kalor pembakaran yang tinggi, dan bobot molekul sebesar 90.08 (Tabel 2).
Tabel 2 Ciri-ciri fisik asam laktat Karakteristik Nilai Bobot molekul 90.08 Titik leleh 16.8 0C
Titik asap 82 0C pada 0.5 mmHg 122 0C pada 14 mmHg Tetapan disosiasi 1.37 x 104
Kalor pembakaran 1361 kJ/mol Kalor jenis 190 J/mol e/0C Narayan et al. 2004
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan suatu teknik kromatografi dengan fase gerak cairan dan fase diam cairan atau padat. Kelebihannya jika dibandingkan dengan metode lain adalah mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran, kecepatan analisis dengan kepekaan tinggi, dan dapat digunakan bermacam-macam detektor. KCKT terdiri pompa, injektor, kolom, dan detektor (Putra 2004). Analisis asam laktat menggunakan KCKT sangat diperlukan karena kepekaannya tinggi sehingga dapat mendeteksi adanya asam laktat pada hasil fermentasi.
Pada kromatografi cair komposisi fase gerak adalah salah satu dari variable yang mempengaruhi pemisahan. Fase gerak yang disukai dalam KCKT adalah murni atau tidak mengandung kontaminan, tidak bereaksi dengan wadah, sesuai dengan detektor dan melarutkan sampel (Putra 2004).
Jumlah bahan yang dimasukkan ke dalam kolom KCKT biasanya sangat sedikit, namun sistem detektor memiliki kepekaan yang cukup tinggi dan stabil terhadap respon dari setiap bahan yang diuji pada konsentrasi
rendah dalam efluen. Umumnya, detektor bervariasi berdasarkan pada panjang gelombang ultraviolet sampai sinar tampak, seperti pada spektrofotometer. Detektor tersebut mampu mengukur absorban dari 190 nm, dan sensitivitasnya sampai skala 0.001 unit. Detektor mempunyai fasilitas untuk mencatat setiap absorban spektrum analat untuk membantu identifikasi (Bintang 2010).
Detektor flouresen sangat penting dalam HPLC karena sensitif, tetapi relatif terbatas pada beberapa komponen yang berflouresensi. Detektor electrochemical bersifat selektif untuk senyawa elektro aktif dan berpotensi memiliki sensitivitas yang tinggi. Kedua detektor di atas memiliki prinsip yang sama (Bintang 2010)
Kolom yang digunakan pada penelitian ini adalah kolom C18. Fase gerak yang digunakan adalah metanol/air (20:80, v/v). Analisis asam laktat digunakan untuk memastikan bahwa asam yang dihasilkan pada fermentasi adalah asam laktat (Zhuo et al. 2011). Analsisi kualitatif ini sangat penting untuk dilakukan untuk mendukung data penelitian.